专利名称：由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的病害抗性鉴定方法，尤其是一种由禾谷镰刀菌引起的小麦 根颈腐病苗期抗性鉴定方法，属于植物保护技术领域。
背景技术：
镰刀菌的多个小种可导致小麦赤霉病(Fusarium Head Blight，简称FHB)和根颈 腐病(Crown Rot，简称CR)的发生，是影响小麦生产的主要致病菌之一。由禾谷镰刀菌、黄 色镰刀菌等侵染小麦穗部而引起的小麦赤霉病，是温暖多雨和气候湿润地区小麦的重要病 害，主要流行于加拿大、美国、南美洲、欧洲、非洲南部地区和中国，已成为一种世界性小麦 病害。我国是全球小麦赤霉病受害面积最大的国家，长江中下游冬麦区和东北春麦区是赤 霉病的主要发生地区，每年受害面积超过700万hm2，禾谷镰刀菌是导致目前小麦赤霉病流 行的优势镰刀菌种，近年来受到全球环境变化的影响，赤霉病有向黄淮流域及其他地区蔓 延的的趋势。研究表明，许多引起小麦赤霉病的镰刀菌如黄色镰刀菌(F. culmorum)、燕麦镰刀 菌(F. avenaceum)、禾谷镰刀菌(F. graminearum)、锐顶镰刀菌(F. acuminatum)也能弓I起 小麦根颈腐病，其中尤其以禾谷镰刀菌致病性最强，小麦根颈腐病在澳大利亚、欧洲、北美 洲、南美洲、西亚、北非和南非等地区等小麦种植地区发病严重，可导致小麦植株矮小、分蘖 减少、籽粒皱瘪甚至不结实而引起产量损失，已经受到当地小麦遗传育种和病理学者们的 广泛关注(Mitter等，Plant Pathology，2006，55 :433_441)。美国小麦根颈腐病主要发生 于气候较温暖的爱达荷州、俄勒冈州、华盛顿州、科罗拉多州、怀俄明州以及德克萨斯州等 西北太平洋各州。在澳大利亚，禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌(F. pseudograminearum)是引 起小麦赤霉病和根颈腐病的主要致病菌，根颈腐病是是仅次于叶枯病的第二大病害，在昆 士兰州、新南威尔士州、南澳、西澳尤为严重，普通小麦产量一般损失30% -70%，硬粒小麦 (durum wheat)品种均不抗此病，每年由小麦根颈腐病引起的损失超过6000万澳元；在环 境条件适宜的同一块田中，赤霉病和根颈腐病可以同时发生(Mitter等，Plant Pathology, 2006，55 433-441)。在我国小麦赤霉病流行的部分地区，如长江中下游冬麦区，具备小麦根 颈腐病发生的条件，已发现由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病植株。同时，近年来我国镰刀 菌引起的小麦赤霉病有向黄淮冬麦区蔓延的趋势，发生的频率和严重度日趋加大，黄淮麦 区小麦生育后期的气候条件有利于根颈腐病的发生，因此，应重视和加强由镰刀菌引起的 小麦根颈腐病的相关研究。筛选根颈腐病抗源，是进行根颈腐病抗性遗传研究和新品种选育的前提条件，而 简便有效的小麦根颈腐病抗性鉴定技术体系的建立是进行抗病种质资源筛选和分子遗传 研究的关键。目前，已报道的小麦禾谷镰刀菌根颈腐病抗性鉴定方法，主要分为人工接种和 病圃自然接种。大多数人工接种方法，在种子或苗期进行接种，在成株期对发病情况进行评 价。病圃自然接种是在成熟期进行病害评价。Dodman 等(Inoculation methods for assessing resistance in wheatto crown rot caused by Fusarium gramineum group 1, Australian Journal of Agricultural Research, 1987，38 473-486)报道了小麦根颈腐病鉴定的三种方法，即种子 接种、土壤接种和茎基部接种。种子接种方法的发病率和严重度均较低，同时该方法引起出 苗率降低。土壤接种主要带菌土壤直接接种，或小麦出苗以后用带菌的籽粒洒在土壤表面 或播种沟中，该方法的发病率和严重度都较高。茎基部接种主要有两种类型，一是将孢子液 喷洒在植株茎基部，抗病品种的抗侵入性明显好于感病品种；二是将孢子液注射在茎基部， 该方法抗病品种与感病品种的抗侵入性没有明显差异。Wallwork等(Resistance to crown rot in wheat identified through an improved method for screening adult plants. Australasian Plant Pathology，2004，33 :1-7)报道了种子在带菌土壤中接种、成株期进 行抗性鉴定方法(带菌土壤接种法)，该方法鉴定周期较长，所需的空间较大，在成熟期对 病害进^ii平价° Mitter 等(A high-throughput glasshouse bioassay to detect crown resistance in wheat germplasm. Plant Pathology, 2006, 55 :433_441) 艮道了在苗期将 孢子悬浮液滴在茎基部，接种后35天进行抗性鉴定的方法，将它称之为孢子悬浮液点滴接 种法，该方法不易于操作，接种在植株基部的孢子悬浮液容易滑落。Li等(A simple method for the assessment for crown rot disease severity in wheat seedlings inoculated with Fusarium pseudograminearum. Journal of Phytopathology,2008，156 (11-12) 751-754)报道了一种根颈腐病的土壤接种方法(发芽种子接种法)，将接种过的发芽种子 种植于装有灭菌土壤的塑料钵中，在温室或人工气候室中生长，当植株出现萎蔫症状时进 行浇水，接种后35天进行病害严重度评价。ffallwork, Mitter和Li等报道的上述方法，均在苗期或种子进行接种，成株期进 行抗性评价，Li等的接种方法比Mitter和Wallwork等的方法更容易操作。同时，Li等的 方法发病的严重度比较高，病害严重度与田间成熟期病害表现相关性较好。这几种方法从 接种到抗性评价所需的时间均较长(35天以上)，表现出来的抗性均为成株期抗性，同时需 要土壤进行接种或生长，工作量较大。因此在根颈腐病抗性鉴定中，迫切需要开发、建立一 套简便、有效、快速的小麦根颈腐病抗性苗期鉴定技术体系，在环境可控条件下，采用合适 的接种方法、合理的病情评价标准研究品种之间的抗性差异，在较短的时间内对大批材料 进行鉴定，为快速高效的根颈腐病抗病育种和遗传研究奠定基础。针对由禾谷镰刀菌引起的根颈腐病在小麦苗期进行抗性鉴定，目前未见报导。
发明内容
本发明的目的在于针对目前由小麦禾谷镰刀菌引起小麦根颈腐病抗性鉴定存在 的容易受到环境条件影响，基本上是通过种子、土壤、苗期接种，存在发病不充分、鉴定时间 长、工作量大等一系列问题，提供一种针对由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴 定方法。本发明的目的是这样实现的一种由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴 定方法，其特征在于首先将被测小麦品种或品系的种子消毒后在培养皿中发芽，然后接种 活化后的禾谷镰刀菌；将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹后在避 光条件下保湿培养ι 3天，然后在自然光照条件下自然生长11 13天，形成幼苗，在自 然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将纸巾的端缘置于蒸馏水中浸泡；最后对幼苗的根颈腐病进行鉴定，结果作为被测小麦品种或品系由禾谷镰刀菌引起的根颈腐病的病 情指数。在本发明中活化后的禾谷镰刀菌是指将禾谷镰刀菌菌种置于PDA固体培养基 上活化，培养后以血球计调节菌液浓度至IX IO6个孢子/mL;种子消毒是指将被测小麦 品种或品系的种子用NaClO溶液中消毒2min后，再用无菌水冲洗3次；培养皿中发芽 是指在垫有两层湿滤纸的培养皿中于22°C温度条件下发芽；接种活化后的禾谷镰刀菌是 指当芽长达4 6mm时，在含有体积比为0. 的Tween 20、浓度为IX IO6个孢子/mL的 禾谷镰刀菌悬浮液中接种2min。在本发明中将禾谷镰刀菌菌种置于PDA固体培养基上活化是指将禾谷镰刀菌 菌种置于1/4强度PDA固体培养基上活化；1/4强度PDA固体培养基是由IOg马铃薯葡萄 糖琼脂粉，15g琼脂粉，加入IL蒸馏水，121°C高压灭菌20min后形成的。在本发明中所述的将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹 后在避光条件下保湿培养是指将灭菌过的纸巾平铺在经过消毒处理塑料盘上，用蒸馏水 使其湿润，将已经接种禾谷镰刀菌的10粒相同品种或品系的小麦种子呈直线形状铺在纸 巾上，芽的生长方向一致且指向纸巾边缘，芽与纸巾边缘的距离为1.8 2. 5cm，将纸巾沿 种子的排列方向从一端向另一端卷起来，放入避光的泡沫盒中，加入蒸馏水使纸卷充分湿 润，在22°C环境下进行保湿培养；所述的在自然光照条件下自然生长是指在22°C、每天自 然光照12h条件下生长，在自然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将种子根际一 端的纸巾的端缘置于蒸馏水中浸泡IOs ；所述的对幼苗的根颈腐病进行鉴定，是以每张纸 巾的10粒被测种子为一个重复，每个品种或品系的被测小麦种子的鉴定至少基于平行试 验的三个重复的检测结果。在本发明中对幼苗的根颈腐病进行鉴定中，按病害严重度将病级分为0-5级，其 中0级为叶鞘无发病症状；1级为第一叶鞘病斑长度小于1. Ocm ；2级为第一叶鞘病斑长度1. 0-2. Ocm ；3级为第一叶鞘病斑长度大于2. 0cm，幼苗未出现萎蔫病症；4级为幼苗出现萎蔫病症；5级为幼苗死亡；病情指数=[Σ (病情级别X该级株数)/ (调查总株数X最高病级)]X 100 ；以同品种或品系的被测小麦种子中平行试验的各重复的病情指数的平均值作为 该小麦品种或品系的最终鉴定的病情指数；病情指数的标准为7个级别免疫的指数为0 ；高抗HR的指数为< 20 ；抗R的指 数为20. 01 40. 0 ；中抗MR的指数为40. 01 60. 0 ；中感MS的指数为60. 01 70. 0 ；感 S的指数为70. 01 80. 0 ；高感HS的指数为80. 01 100. 0。本发明的优点在于(1)鉴定周期短，从接种到病害评价，约为15天，相对于种子 直接接种、发芽种子接种、土壤带菌接种、苗期点滴接种等方法(一般需35-60天)，大大缩 短了试验周期，因而可以在一定的时间内，对大批小麦材料进行苗期抗性鉴定。(2)该方法 从接种至病害评价均处于苗期阶段，是一种鉴定小麦根颈腐病苗期抗性的方法。(3)实验所需的空间小，接种后，在敞口的塑料盒或泡沫盒中继续生长，直至进行病害评价。(4)不需要 土壤，减少因土壤灭菌和接种而带来的工作量。(5)在实验室、温室、人工气候室等环境条件 下均可操作。(6)该方法获得的抗性鉴定结果与田间病圃鉴定结果的吻合度高。
图1是将接种后的被测小麦种子在纸巾中排列包裹的照片；图2是纸巾展开，观察幼苗发病情况的的照片。
具体实施例方式实施例1被鉴定品种选用从澳大利亚引进的17份小麦品种或品系，它们因禾谷镰刀菌 引起根颈腐病的田间成株期抗病性均为已知的，抗病性的资料来源于澳大利亚昆士兰州 2007 年、2008 年和 2009 年小麦品种介绍(网址为 http //www, dpi, aid, gov, au/265121. htm),以及文献 Mitter 等，Plant Pathology, 2006, 55 :433_441 ；Li 等，Journal of Phytopathology,2008，156(11-12) :751_754。鉴定过程禾谷镰刀菌悬浮液的获得方法禾谷镰刀菌为F15，由江苏省农科院植物保护所 提供[禾谷镰刀菌菌种F15已在文献上发表(任丽娟等，小麦抗纹枯病和赤霉病QTL定位 研究，麦类作物学报，2007，27 (3) :416-420)]。将禾谷镰刀菌菌种F15在超净工作台上于 1/4强度PDA固体培养基上活化培养(1/4强度PDA固体培养基配置方法为10g马铃薯葡 萄糖琼脂粉，15g琼脂粉，加入IL蒸馏水，121°C高压灭菌20min)，在22°C、光照时间12h条 件下，培养7天后将菌丝涂于相同强度PDA培养基上，继续在22°C、光照时间12h条件下培 养10天，刮去培养基表面菌丝，再继续培养7天后，在超净台上用蒸馏水洗涤、三层无菌纱 布过滤，以血球计调节菌液浓度至1 X IO6个孢子/mL。小麦种子经NaClO溶液消毒清洗后，在垫有两层湿滤纸的培养皿中于22°C下 发芽，当芽长达5mm左右时，在含有0. (体积比)Tween 20、浓度为1 X IO6个孢子/mL的 禾谷镰刀菌悬浮液中接种2min。将灭菌过的纸巾(24cmX24cm)平铺在经过消毒处理的正方形塑料盘上，用适量 蒸馏水使其湿润，将10粒接种的小麦种子呈直线形状铺在纸巾上，芽的生长方向一致且指 向纸巾边缘，芽与纸巾边缘的距离为2cm，将纸巾沿种子的排列方向从一端向另一端卷起来 (见图1)，放入避光的泡沫盒中，每个品种重复三次。每个重复随机放入避光的泡沫盒中， 加入蒸馏水使纸卷充分湿润，在22°C、避光条件保湿培养48h，然后在22°C、光照时间12h条 件下生长，当纸卷外层出现干燥时，将纸巾另一端在蒸馏水中浸10s，接种后14天将纸巾展 开(图2)按单株进行病害等级鉴定。鉴定中，按病害严重度将病级分为0-5级0级为叶鞘无发病症状；1级为第一叶 鞘病斑长度小于1. Ocm ；2级为第一叶鞘病斑长度1. 0-2. Ocm ；3级为第一叶鞘病斑长度大 于2. 0cm,幼苗未出现萎蔫病症；4级为幼苗出现萎蔫病症；5级为幼苗死亡。根据病害评价等级计算病情指数病情指数=[Σ (病情级别X该级株数)/ (调 查总株数χ最高病级)]Χ100%，计算获得3个重复的平均病情指数。根据抗病性病情指数的标准免疫的指数为0，高抗(HR)的指数为<20，抗(R)的指数为20. 01 40.0，中抗 (MR)的指数为40. 01 60. 0，中感(MS)的指数为60. 01 70. 0，感(S)的指数为70. 01 80. 0，高感(HS)的指数为80. 01 100. 0。从表1可以看出，17份小麦材料在根颈腐病抗性方面覆盖面较大，其中，2份品种 抗性达抗(R)水平，3份品种抗性为中抗(MR)，4份品种为中感(MS)，6份品种为感(S)，2份 品种为高感(HS)。通过表1的比对，可见本方法的抗性鉴定结果与公众已知的，采用传统方法在田 间成株期抗性鉴定结果具有较高的吻合度。表1 17份小麦品种苗期抗性接种鉴定结果以及成株期抗性
权利要求
一种由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，其特征在于首先将被测小麦品种或品系的种子消毒后在培养皿中发芽，然后接种活化后的禾谷镰刀菌；将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹后在避光条件下保湿培养1～3天，然后在自然光照条件下自然生长11～13天，形成幼苗，在自然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将纸巾的端缘置于蒸馏水中浸泡；最后对幼苗的根颈腐病进行鉴定，结果作为被测小麦品种或品系由禾谷镰刀菌引起的根颈腐病的病情指数。
2.根据权利要求1所述的由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，其特 征在于活化后的禾谷镰刀菌是指将禾谷镰刀菌菌种置于PDA固体培养基上活化，培养后 以血球计调节菌液浓度至IXlO6个孢子/mL ；种子消毒是指将被测小麦品种或品系的种 子用1 % NaClO溶液中消毒2min后，再用无菌水冲洗3次；培养皿中发芽是指在垫有两层 湿滤纸的培养皿中于22°C温度条件下发芽；接种活化后的禾谷镰刀菌是指当芽长达4 6mm时，在含有体积比为0. 1 %的Tween 20、浓度为1 X IO6个孢子/mL的禾谷镰刀菌悬浮液 中接种2min。
3.根据权利要求2所述的由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，其特 征在于将禾谷镰刀菌菌种置于PDA固体培养基上活化是指将禾谷镰刀菌菌种置于1/4 强度PDA固体培养基上活化；1/4强度PDA固体培养基是由IOg马铃薯葡萄糖琼脂粉，15g 琼脂粉，加入IL蒸馏水，121°C高压灭菌20min后形成的。
4.根据权利要求1或2或3所述的由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方 法，其特征在于所述的将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹后在避 光条件下保湿培养是指将灭菌过的纸巾平铺在经过消毒处理塑料盘上，用蒸馏水使其湿 润，将已经接种禾谷镰刀菌的10粒相同品种或品系的小麦种子呈直线形状铺在纸巾上，芽 的生长方向一致且指向纸巾边缘，芽与纸巾边缘的距离为1. 8 2. 5cm，将纸巾沿种子的排 列方向从一端向另一端卷起来，放入避光的泡沫盒中，加入蒸馏水使纸卷充分湿润，在22°C 环境下进行保湿培养；所述的在自然光照条件下自然生长是指在22°C、每天自然光照12h 条件下生长，在自然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将种子根际一端的纸巾的 端缘置于蒸馏水中浸泡IOs ；所述的对幼苗的根颈腐病进行鉴定，是以每张纸巾的10粒被 测种子为一个重复，每个品种或品系的被测小麦种子的鉴定至少基于平行试验的三个重复 的检测结果。
5.根据权利要求4所述的由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，其特 征在于对幼苗的根颈腐病进行鉴定中，按病害严重度将病级分为0-5级，其中0级为叶鞘无发病症状；1级为第一叶鞘病斑长度小于1. Ocm ；2级为第一叶鞘病斑长度1. 0-2. Ocm ；3级为第一叶鞘病斑长度大于2. 0cm，幼苗未出现萎蔫病症；4级为幼苗出现萎蔫病症；5级为幼苗死亡；病情指数=[Σ (病情级别X该级株数)/(调查总株数X最高病级)]Xl00 ； 以同品种或品系的被测小麦种子中平行试验的各重复的病情指数的平均值作为该小 麦品种或品系的最终鉴定的病情指数；病情指数的标准为 个级别免疫的指数为0 ；高抗HR的指数为< 20 ；抗R的指数为 20. 01 40. 0 ；中抗MR的指数为40. 01 60. 0 ；中感MS的指数为60. 01 70. 0 ；感S的 指数为70. 01 80. 0 ；高感HS的指数为80. 01 100. 0。
全文摘要
本发明涉及一种由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，首先将被测小麦品种或品系的种子消毒后在培养皿中发芽，然后接种活化后的禾谷镰刀菌；将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹后在避光条件下保湿培养1～3天，然后在自然光照条件下自然生长11～13天，形成幼苗，在自然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将纸巾的端缘置于蒸馏水中浸泡；最后对幼苗的根颈腐病进行鉴定，结果作为被测小麦品种或品系对禾谷镰刀菌引起的根颈腐病的病情指数。
文档编号C12Q1/02GK101990819SQ201010270518
公开日2011年3月30日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者周淼平, 姚金保, 杨学明, 马鸿翔 申请人:江苏省农业科学院