一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用。本发明公开的一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，其保藏编号为CGMCC No.9499。作为小麦赤霉病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。CGMCC No949920140718
【专利说明】一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及特基拉芽孢杆菌，特别涉及一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌 方面的应用。
【背景技术】
[0002] 禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起 麦类赤霉病（Fusarium Head Blight，FHB)，禾谷镰刀菌为限制小麦产量的一个主要因素 (Dubin，1997)。我国气候条件十分有利于麦类赤霉病的发生，长江中下游地区常年病害造 成产量损失10%-15%，大流行年份减产近50% (黄昌等，2000)。由于全球气候变暖以及 秸杆还田、免耕栽培等耕作制度改变的影响，我国麦类赤霉病的发生区域由长江流域迅速 向西北、华北扩展（张昊，2011)，特别是在2008、2010和2012年，全国麦类赤霉病发生十分 严重，造成了严重的产粮损失和不良的社会影响，严重威胁我国粮食安全。
[0003] 禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（D0N，3, 7, 15三羟基-12, 13环氧单端孢 霉-9烯-8酮）是存在于赤霉病菌感染麦粒中的主要天然毒素之一。DON已被认定为最危险 的自然发生食品污染物之一，被列入国际研究的优先地位（Larsen et al.，2004) AON可致 人免疫力下降、贫血、头痛、腹痛、恶心；致动物拒食、生长延滞和流产（Rocha et al.，2005 ; Sobrova et al.，2010 ;Pestka，2010)。DON广泛存在并大量污染小麦及其制品，对人畜构 成很大危害，严重威胁我国食品安全。
[0004] 因此，加强禾谷镰刀菌防控研究已成为保障我国粮食安全和食品安全的迫切需 求。
[0005] 多年来对麦类赤霉病防治主要依靠化学农药，但随着化学农药带来的环境问 题，加之多年用药已导致病原菌抗药性禾谷镰刀菌菌株的出现（Changjun Chen et al.， 2007)，使防治难度加大。虽然在赤霉病抗性品质方面国内外投入大量的精力开展相关研 究，但至今尚无理想的高抗小麦品种（李正辉等，2007)。
[0006] 生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性，相关理论和技术的研究 日益为人们所关注。特基拉芽孢杆菌营养简单，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害， 不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，较其他微生 物更具有开发为生物防控菌剂的潜力。
【发明内容】
[0007] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一株特基拉芽孢杆菌及 其防治禾谷镰刀菌方面的应用。
[0008] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0009] 一株特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis)，其保藏编号为CGMCC No. 9499。
[0010] 上述菌株在生物防治镰刀菌引起的植物病害中的应用也属于本发明的保护范围。
[0011] 上述应用中，所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。
[0012] 上述任一所述的应用中，所述病害为镰刀菌引起的赤霉病或穗腐病或根腐病。
[0013] 上述任一所述的应用中，所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物或玉米；所述麦 类作物具体为小麦。
[0014] 上述菌株在制备抑制镰刀菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0015] 一种防治镰刀菌引起的植物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植 物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为上述特基拉芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产 物。
[0016] 上述方法中，所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。
[0017] 上述任一所述的方法中，所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物或玉米；所述麦 类作物具体为小麦。
[0019] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的特基拉芽孢杆菌不仅在平 板培养时可高效抑制禾谷镰刀菌，而且在温室实验中其防治效果高达77. 4%。作为小麦赤 霉病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用 前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为对峙培养实验。
[0021] 图2为挥发性气体抑菌实验。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细阐述：
[0023] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] NB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋 白胨在NB液体培养基中的浓度为1 %，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0. 3 %，NaCl在 NB液体培养基中的浓度为0. 5%，所述％均为质量体积百分比（g/100ml)。
[0026] NA固体培养基：在NB液体培养基中加入琼脂（琼脂与液体培养基的比例为I. 5g : 100ml)，得到NA固体培养基。
[0027] PDA培养基：马铃薯200g，加入少量水煮20min，三层纱布过滤，取滤液用水定容至 1L，加入20g葡萄糖，15g琼脂，121°C高压灭菌20min。
[0028] 绿豆汤培养基：绿豆10g，加入少量水煮20min，三层纱布过滤，取滤液用水定容至 1L，分装后121°C高压灭菌20min。
[0029] 磷酸盐缓冲液：由溶剂和溶质组成；溶质为磷酸二氢钾和氯化镁，溶剂为水； 磷酸二氢钾的浓度为〇. 004%，氯化镁的浓度为0. 019%，所述％均为质量体积百分比 (g/100ml)。
[0030] 禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)FGl在文献"杨慧勇，李飞凤，陆琼娴，徐 剑宏，史建荣.拮抗菌株AFR0406对小麦赤霉病菌和纹枯病菌的生物活性测定.江苏农业 科学，2006 (06)，142-144. "中公开过，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。
[0031] 小麦石新828品种在文献"孙志军，杨晓丽，张辉，张广辉.小麦新品种石新828选 育过程及高产栽培技术.现代农业科技，2011 (09)，96-97. "中公开过，公众可从中国农业 科学院农广品加工研究所获得。
[0032] 实施例1、菌株的分离与鉴定
[0033] 一、菌株的分离
[0034] (一）2012年6月，在超净工作台中，将10穗江苏采集的小麦病穗放在IOOml无菌 蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，然后80°C水浴处理10分钟。
[0035] (二）将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30°C 条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不 同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于禾谷镰刀菌对峙培养实验，结果如图1 所示。将得到的对禾谷镰刀菌拮抗能力强的一株菌命名为JS5L。
[0036] 二、鉴定
[0037](一）按照"伯杰细菌鉴定手册"（第八版）和"常见细菌系统鉴定手册"（东秀珠， 蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001. 2)中描述的方法，对菌株JS5L进行形态特征、培养 特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下：
[0038] 菌体的形态和生理生化特性：
[0039] 在NA培养基，28°C培养1天，菌体杆状，直径约为0. 6 μ mX 2. 0-2. 5 μ m ;菌落微黄 色，圆形，平滑，边缘整齐。
[0040] 生理生化特征：
[0041] 氧化酶：+ ;精氨酸双水解酶：+ ;明胶水解：+ ;淀粉水解：+ ;过氧化氢酶：+ ;三丁 酸甘油脂水解：_ ;硝酸盐还原：+ ;七叶灵水解：+ ;酪素水解：+ ;Tween80水解：+ ;Π 引哚实 验：_ ;脲酶：_ ;朽1檬酸利用：+ ;H2S生成：-;VP实验：+ ;厌氧生长：-;50°C :+ ;
[0042] 20°C ;ρΗ4· 0 ;ρΗ9· 0 :-。
[0043] 可以利用甘油、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、D-半 乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α -甲 基-D-匍萄糖苷、N-乙醜匍糖胺、七叶灵、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蜜二 糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-棉籽糖、淀粉、木糖醇、D-龙胆二糖、D- 土伦糖、D-来苏糖、D-塔 格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇产酸。利用卫矛醇、苦杏仁苷、熊果 苷、菊糖和糖原产酸能力较差。
[0044] (二）16S rDNA 试验
[0045] 提取JS5L的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得 到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列如SEQ ID No. 1所 /Jn 〇
[0046] 根据 Gen-Bank 序列同源性比较，菌株 JS5L 与 Bacillus sp. LB159 (GenBank 登录 号 KJ564121.1)同源性为 99%，与 Bacillus sp.JX2 (GenBank 登录号 KF860138.1)同源性 为99%，初步判定该菌为芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp.)。
[0047] 基于以上特征，将菌株JS5L鉴定为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis)。该 菌株已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 9499。
[0048] 实施例2、特基拉芽孢杆菌JS5L对禾谷镰刀菌的拮抗作用
[0049] 采用对峙培养法检测特基拉芽孢杆菌JS5L对禾谷镰刀菌的拮抗。
[0050] -、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)FGl菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将菌盘挑入PDA平板中心。
[0051] 二、在距PDA平板中心25mm处四点划线接种相同体积和浓度的JS5L，以仅接种禾 谷镰刀菌菌盘的PDA平板为对照组，28°C培养4-5天，观察有无抑菌带形成。每个组做三个 平行。结果如表1所示。表明，JS5L对禾谷镰刀菌有很强的抑制效果。
[0052] 表1培养5天后JS5L对禾谷镰刀菌的抑制作用
【权利要求】
1. 一株特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis)，于2014年7月18日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 9499。
2. 权利要求1所述的菌株在生物防治镰刀菌引起的植物病害中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。
5. 根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述植物为谷物；所述谷物为麦类 作物或玉米；所述麦类作物具体为小麦。
6. 权利要求1所述的菌株在制备抑制镰刀菌的产品中的应用。
7. -种防治镰刀菌引起的植物病害的方法，是在植物生长过程中进行喷雾处理； 所述喷雾为权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。
10. 根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为谷物；所述谷物为麦 类作物或玉米；所述麦类作物具体为小麦。
【文档编号】A01N63/00GK104403962SQ201410602448
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】赵月菊, 刘阳, 邢福国, 周露, 王龑 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所