专利名称：一种液体悬浮培养生产猪苓甾体和多糖的方法
技术领域：
本发明属于真菌发酵领域，涉及一种液体悬浮培养生产猪苓留体和多糖的方法和 用于该方法培养基的制备及分离留体化合物和多糖的方法。
背景技术：
猪苓[办斤/7仗狀umbellatus (Pers. )Fries]别名野猪筌、猪屎、鸡屎筌、地乌桃 等，系层菌纲多孔菌科多孔菌属真菌，以菌核入药，在我国入药已有2000年的历史，其菌核 性平味淡，具有利尿、抗肿癌、增强免疫等功能，是临床常用而又紧缺的药物之一，具有很好 的发展前景。目前对猪苓的研究利用主要集中在猪苓多糖上，研究发现猪苓多糖具有很好的生 物活性，例如郑虎占、曾星等许多学者研究发现猪苓多糖有抗肿癌的活性；梅力等学者研 究发现猪苓多糖有很好的免疫调剂能力；研究还发现猪苓多糖还具有保肝、抗菌、抗衰老、 抗辐射等作用。然而从猪苓中分离得到的50余个化合物中甾体类化合物就有33个之多，占有相 当大的比例(ZHAO Y Y，J Chem Res-S, 2009, (11) :699_701·)。但是关于猪苓甾体类化合 物的研究少有报道。近期研究发现，猪苓中大量的留体化合物具有很好的生物活性。研究表明猪苓中甾体化合物在其药理活性中具有非常重要的作用，如麦角 甾_4，6，8 (14)，22_四烯-3-酮为猪苓中利尿作用成份之一；日本学者OHSAWA Τ.等人 (Chem Pharm Bull (Tokyo)，1992，40 (1 ):143_147·)研究发现猪苓酮 A-G 对白血病 L-1210 细胞的增殖均有剂量依赖性的抑制作用；WEILU E A. (Chem Pharm Bull (Tokyo), 1985， 33(11): 5083.)研究发现麦角甾-7，22_ 二烯-3-醇、麦角甾醇和5α，8α-过氧麦角 甾-6，22-二烯-3-醇对胶原蛋白诱导的血小板聚集有促进作用；STAO Μ. (pharmbull, 2002,25 (1) :81-86.)等人研究发现猪苓酮A可促进荷兰猪角质层的代谢更新，作为代谢 促进剂可用于延缓皮肤的衰老；INAOKA Y.等人(Chem Pharm Bull (Tokyo)，1994，42 (3) 530-533.)研究发现猪苓酮A、猪苓酮B均为促进毛发再生的活性物质；Wei Lu等人研究发 现麦角留-7,22- 二烯-3-醇和麦角留醇对血小板凝聚有促进作用等等。这些都显示出了 猪苓留体化合物具有重要的应用开发价值。然而野生猪苓菌核中留体类化合物和多糖的含量很低，分离过程复杂，并且猪苓 是多年生，生长三年以上才能到达生长旺盛期，野生猪苓资源及其匮乏，很难用于工业化生 产；人工栽培猪苓又存在一定的困难；利用发酵方法生产猪苓多糖的报道很多，但是普遍 存在必须与蜜环菌一起发酵，发酵过程复杂，周期长，产物分离效果差等问题；并且关于发 酵法生产猪苓留体的研究还没有报道。因此开发一种提高猪苓中留体化合物和多糖含量的 方法是十分必要的。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种用于液体悬浮培养生产猪苓留体和多糖的液体培养基。本发明的另一个目的是，提供一种悬浮培养生产猪苓留体和多糖的方法，该方法 发酵周期短，猪苓的菌丝体产率高，其中留体化合物含量和多糖含量很高。本发明的目的是通过以下技术路线实现的
一种液体培养基，其特征在于，制得的该液体培养基中含有葡萄糖20g/L 42g/L，磷 酸二氢钾0. 5g/L 1. Og/L,硫酸镁0. 5g/L 1. Og/L,酵母膏:0 30g/L，硝酸胺:0 1· Og/L, 氯化钙(Tl.0g/L，蛋白胨(T4g/L，维生素 B1 :(T0. lg/L。一种液体悬浮培养生产猪苓留体和多糖的方法，其特征在于依次包括以下步骤
a)在适合猪苓生长环境条件下，利用权利要求1所述液体悬浮培养生产猪苓留体和多 糖的的液体培养基对猪苓进行培养，得到猪苓的液体菌种；
b)将步骤a)制得的液体菌种接种到发酵罐中，在合适的环境条件下，继续利用权利要 求1的液体培养基进行大规模发酵培养，得到发酵物；
c)对发酵物进行过滤，得到发酵液和菌丝体；
d)对猪苓菌丝体进行真空冷冻干燥，粉碎，过40目筛，然后用二氯甲烷浸提、过滤，滤 液减压浓缩得到猪苓留体化合物；滤渣用水浸提、过滤、滤液减压浓缩得到猪苓多糖。其中，步骤a)中，所述的猪苓生长环境为培养温度为23士2°C、pH5 7、培养时间 为5 10天；步骤b)中，所述的合适的环境条件是培养温度25士21、？!15 7、通气量1:0.3、 每8小时搅拌lOmin，搅拌速度为120r/min，培养时间为2 8天。猪苓留体化合物提取时，二氯甲烷的体积用量为猪苓菌丝体质量的1(Γ20倍，提 取温度为35°C，提取次数3次，提取时间为广3h ；猪苓多糖多糖提取时水的体积用量为猪 苓菌丝体质量的1(Γ20倍，提取温度为100°C，提取次数为3次，提取时间为广3h。本发明具有下列优点
1、利用生物工程技术，采用液体悬浮发酵的培养方法，缩短了发酵的周期，提高了猪苓 菌丝体的产量、增加了猪苓中留体化合物和多糖的含量。一般野生的猪苓中留体化合物和 多糖含量分别为0. lmg/g和5mg/g ；利用本发明的到的猪苓菌丝体中留体化合物和多糖含 量分别大于3. 5mg/g和llmg/g，在很大程度上提高了留体化合物和多糖的含量。2、本发明的到的猪苓菌丝体可以通过简单的操作直接从中提取留体化合物和多 糖，简化了次生代谢产物的分离和纯化步骤，减低了生产成本和生产难度，为工业化生产创 造了条件。
具体实施例方式本发明首先制备一种液体培养基，利用该液体培养基采用摇瓶法培养出液体菌 种，接着将液体菌种接种于发酵罐中继续使用上述液体培养基进行大规模发酵生产，然后 通过过滤得到猪苓菌丝体，最后利用不同极性的溶剂对其进行提取浓缩，得到大量的甾体 和多糖。下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明内容的实施方式不限于 这些实施例。实施例1:
(1)液体养基的制备制备的液体培养基中含有葡萄糖28g/L，磷酸二氢钾1. Og/L，硫酸镁1. Og/L，酵母膏 4g/L，维生素 B1O. lg/L。(2)液体菌种的培养取等量同一种的猪苓菌种，接种到装有IOOmL步骤(1)制备 的液体培养基中，在培养温度为23士2°C、pH为5、培养时间为8天的条件下，在恒温摇床(摇 床速度100次/min)中对猪苓进行培养，得到猪苓的液体菌种。(3)大规模发酵培养将制得的液体菌种接种到发酵罐中，利用步骤(1)制备的 液体培养基在培养温度为25士2°C、pH7、通气量1:0. 3、每8小时搅拌IOmin (搅拌速度 120r · mirT1)，培养时间为7天的条件下继续发酵培养，得到发酵物。(4)对发酵物进行过滤，得到发酵液和菌丝体，对猪苓菌丝体进行真空冷冻干燥。(5)猪苓菌丝体中猪苓留体化合物和猪苓多糖的制备
A、猪苓留体化合物制备将干燥的猪苓菌丝体粉碎，过40目筛备用。用猪苓菌丝体质 量12倍的二氯甲烷(二氯甲烷体积mL 猪苓菌丝体质量g=12)于35°C下回流提取3次，每 次lh，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪苓留体化合物，测得菌丝体中留体化合物含 量为 3. 864mg/g。B、猪苓多糖的制备将二氯甲烷提取后的滤渣用15倍的水(水的体积mL 猪苓菌 丝体质量g=15)于100°C下回流提取3次，每次lh，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪 苓多糖，测得菌丝体中多糖含量为11.542 mg/g。实施例2
(1)液体培养基的制备
制备的液体培养基中含有葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾0. 5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硝酸胺 1. Og/L、氯化钙 0. 5g/L、蛋白胨 1. 25g/L。(2)液体菌种的培养取等量同一种的猪苓菌种，接种到装有IOOmL步骤(1)制备 的液体培养基中，在培养温度为23士2°C、pH7、培养时间为5天的条件下，在恒温摇床(摇床 速度100次/min)中对猪苓进行培养，得到猪苓的液体菌种。(3)大规模发酵培养将制得的液体菌种接种到发酵罐中，在培养温度为 25士2°C、pH6、通气量1:0. 3、每8小时搅拌IOmin (搅拌速度120r .mirT1),培养时间为4天 的条件下，继续利用上述步骤(1)的液体培养基发酵培养，得到发酵物。(4)对发酵物进行过滤，得到发酵液和菌丝体，对猪苓菌丝体进行真空冷冻干燥。(5)猪苓菌丝体中猪苓留体化合物和猪苓多糖的制备
A、猪苓留体化合物制备将干燥的猪苓菌丝体粉碎，过40目筛备用。用猪苓菌丝体质 量15倍的二氯甲烷(二氯甲烷体积mL 猪苓菌丝体质量g=15)于35°C下回流提取3次，每 次2 h，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪苓留体化合物，测得菌丝体中留体化合物含 量为 3. 491mg/g。B、猪苓多糖的制备将二氯甲烷提取后的滤渣用10倍的水(水的体积mL 猪苓菌 丝体质量g)于100°c下回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪苓 多糖，测得菌丝体中多糖含量为11.007mg/g。实施例3
(1)液体培养基的制备
制备的液体培养基中含有葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾lg/L、硫酸镁lg/L、酵母膏2. 73g/L、维生素 B1O. lg/L。(2)液体菌种的培养取等量同一种的猪苓菌种，接种到装有IOOmL步骤(1)制备 的液体培养基中，在培养温度为23士2°C、pH6、培养时间为7天的条件下，对猪苓进行培养， 得到猪苓的液体菌种。(3)大规模发酵培养将制得的液体菌种接种到发酵罐中，在培养温度为 25士2°C、pH6、通气量1:0. 3、每8小时搅拌IOmin (搅拌速度120r .HiirT1X培养时间为6天 的条件下，继续利用上述步骤(1)的液体培养基发酵培养，得到发酵物。(4)对发酵物进行过滤，得到发酵液和菌丝体，对猪苓菌丝体进行真空冷冻干燥。猪苓菌丝体中猪苓留体化合物和猪苓多糖的制备
A、猪苓留体化合物制备将干燥的猪苓菌丝体粉碎，过40目筛备用。用猪苓菌丝体质 量的10倍二氯甲烷(二氯甲烷体积mL 猪苓菌丝体质量g=10)于35°C下回流提取3次，每 次3h，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪苓留体化合物，测得菌丝体中留体化合物含 量为 4. 252mg/g。B、猪苓多糖的制备将二氯甲烷提取后的滤渣用20倍的水(水的体积mL 猪苓菌 丝体质量g)于100°c下回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪苓 多糖，测得菌丝体中多糖含量为14. 215mg/g。实施例4
(1)液体培养基的制备
制备的液体培养基中含有葡萄糖42g/L、磷酸二氢钾lg/L、硫酸镁lg/L、酵母膏30g/ L、氯化钙lg/L。(2)液体菌种的培养取等量同一种的猪苓菌种，接种到装有IOOmL步骤(1)制备 的液体培养基中，在培养温度为23士2°C、pH6、培养时间为10天的条件下，在恒温摇床(摇 床速度100次/min)中对猪苓进行培养，得到猪苓的液体菌种。(3)大规模发酵培养将制得的液体菌种接种到发酵罐中，利用步骤(1)制备的 液体培养基在培养温度为25士2°C、pH7、通气量1:0. 3、每8小时搅拌IOmin (搅拌速度 120r · mirT1)、培养时间为2天的条件下继续发酵培养，得到发酵物。(4)对发酵物进行过滤，得到发酵液和菌丝体，对猪苓菌丝体进行真空冷冻干燥。猪苓菌丝体中猪苓留体化合物和猪苓多糖的制备
A、猪苓留体化合物制备将干燥的猪苓菌丝体粉碎，过40目筛备用。用猪苓菌丝体质量20倍的二氯甲烷(二氯甲烷体积mL 猪苓菌丝体质量g=20)于 35°C下回流提取3次，每次lh，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪苓留体化合物，测得 菌丝体中留体化合物含量为3. 572mg/g。B、猪苓多糖的制备将二氯甲烷提取后的滤渣用15倍的水(水的体积mL 猪苓菌 丝体质量g)于100°c下回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得到猪苓 多糖，测得菌丝体中多糖含量为12. 428mg/g。
权利要求
一种液体培养基，其特征在于，制得的该液体培养基中含有葡萄糖20g/L~42g/L，磷酸二氢钾0.5g/L~1.0g/L，硫酸镁0.5g/L~1.0g/L，酵母膏0~30g/L，硝酸胺0~1.0g/L，氯化钙0~1.0g/L，蛋白胨0~4g/L，维生素B10~0.1g/L。
2.一种液体悬浮培养生产猪苓留体和多糖的方法，其特征在于依次包括以下步骤a)在适合猪苓生长环境条件下，利用权利要求1所述液体培养基对猪苓进行培养，得 到猪苓的液体菌种；b)将步骤a)制得的液体菌种接种到发酵罐中，在合适的环境条件下，继续利用权利要 求1的液体培养基进行大规模发酵培养，得到发酵物；c)对发酵物进行过滤，得到发酵液和菌丝体；d)对猪苓菌丝体进行真空冷冻干燥，粉碎，过40目筛，然后用二氯甲烷浸提、过滤，滤 液减压浓缩得到猪苓留体化合物；滤渣用水浸提、过滤、滤液减压浓缩得到猪苓多糖。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的猪苓生长环境为培养温 度为23士2°C、pH5 7、培养时间为5 10天；步骤b)中，所述的合适的环境条件是培养温度 25士2°C、pH5 7、通气量1:0. 3、每8小时搅拌lOmin，搅拌速度为120r/min，培养时间为2 8 天。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，猪苓留体化合物提取时，二氯甲烷的体积用 量为猪苓菌丝体质量的10 20倍，提取温度为35°C，提取次数3次，提取时间为广3h ；猪苓 多糖多糖提取时水的体积用量为猪苓菌丝体质量的1(Γ20倍，提取温度为100°C，提取次 数为3次，提取时间为广3h。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的二氯甲烷回收后反复利用。
全文摘要
本发明公开了一种液体悬浮培养生产猪苓甾体和多糖方法，包括以下步骤(a)液体培养基的制备；(b)在适合猪苓生长条件下，在液体培养基中培养，得到猪苓的液体菌种；(c)将步骤(b)制得的液体菌种接种到发酵罐中，在合适的条件下，在液体培养基中继续发酵；(d)对发酵液和菌丝体进行分离，然后对菌丝体中甾体化合物和多糖进行分离。本发明具有发酵周期短，产率高，菌丝体中甾体和多糖含量高，成本低廉等优点。减低了生产成本和生产难度，为工业化生产创造了条件。
文档编号C12P33/00GK101948760SQ20101028434
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者吴进, 李同臣, 杜宏涛, 王俊儒 申请人:西北农林科技大学