专利名称：一种基因重组黄素还原酶的提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从重组大肠杆菌中提 取黄素还原酶的方法，产品纯度达95%以上。
背景技术：
硫是原油中含量第三位元素，大部分都是以有机物的形式存在的，大部分都是噻 吩类化合物。燃油中的有机硫化合物是造成大气中硫氧化合物超标和酸雨的主要原因。要 降低大气中硫氧化合物的污染，就必须降低燃油中硫的比例，对原油进行脱硫。古地分支杆 菌(Mycobacterium goodie X7B)能将硫芴(DBT)降解为2_ 二羟基联苯(2-HBP)，进行专 一性脱硫。其中的脱硫酶系为DszC，DszA, DszB和黄素还原酶(flavin reductase, frm)。 黄素还原酶对两种单加氧酶DszC和DszA在降解过程中起重要的桥梁作用。目前，从微生 物自身或重组大肠杆菌分离黄素还原酶的主要方法有层析法和等电聚焦法等。然而这些 技术均存在一定的局限性，如成本昂贵，且难于工业放大等。膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力， 对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代 发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续 操作、易于放大、无污染等优点。超滤膜是指膜孔径在I-IOOnm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸 与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离 是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节 溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子 之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术 常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂， 且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的成功实例极少。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的重组黄素还原酶的超滤提取方 法。本发明采取的技术路线是1.以古地分支杆菌(Mycobacterium goodie X7B)基因组DNA为模板，采用PCR 技术克隆黄素还原酶基因，PCR产物经Nde I和Hind III双酶切后，连接到经同样处理 的pET21a克隆/表达载体上，产生重组质粒pETfrm，将重组载体pETfrm导入大肠杆菌 (E. coli)，获得基因重组工程菌E. coli/pETfrm。2.将重组大肠杆菌培养至OD620为0. 25-0. 35之间(37°C，250rpm)，加入诱导剂 IPTG至浓度为4mM ；继续培养12小时(18°C，250rpm)。3.取步骤2得到的发酵液30ml，离心15min (离心条件为4°C，离心力为2000g)，
3用IM的TE Buffer (pH7. 0) 5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入IM的 TEBuffer(pH7. 0)5ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件声波 时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液备用。4.利用截留分子量为100-150kDa的超滤膜对步骤2得到的上清液进行超滤分离， 分离条件为溶液PH值5-9，离子强度0-1M。5.利用截留分子量为10_30kDa的超滤膜对步骤3得到的滤出液进行超滤分离，分 离条件为溶液PH值5-9，离子强度0-1M。截留液为黄素还原酶的终产品。本发明直接应用超滤分离技术从重组大肠杆菌中分离获取高纯度的黄素还原酶， 由于超滤膜是指膜孔径在Ι-lOOnm，具有不对称结构的复合膜。其孔径尺寸与生物大分子 的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质、酶等的分离与纯化。本发明工艺仅涉及破 碎、离心和超滤三个简单步骤，相对目前的实验室提取工艺，具有操作简单、分离浓缩同步 进行、活性损失小、回收率高、能耗低、分离效率高、产品纯度可调控、控制因素单一，便于工 业放大等特点。
具体实施例方式下面结合实施例进一步描述本发明。实施例1，提取基因重组黄素还原酶的方法，步骤取基因重组工程菌E. coli/pETfrm的发酵液200ml，离心15min (离心条件4°C， 2000g)，用IM的TE Buffer (pH7. 0) IOOml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入IM的 TEBuffer (pH 7. 0) 20ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对菌体进行破碎(超声条件声波 时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液(17ml)。利用截留分子量为IOOkDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)对上清液进行 分离，分离条件溶液pH值6. 0，NaCl浓度30mM，流速0. 2ml/min，超滤时间2小时，取滤出 液(24ml)；利用30kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)对滤出液进行二次超滤分离， 分离条件溶液pH值6. 0，NaCl浓度30mM，流速0. 2ml/min,超滤时间4小时，截留液(16ml) 即为黄素还原酶溶液，纯度为95. 4%。实施例2，重组黄素还原酶的分离纯化工艺，步骤取基因重组工程菌E. coli/pETfrm的发酵液100ml，离心15min (离心条件4°C， 2000g)，用IM的TE Buffer (pH 7. 0) IOOml清洗菌体，再离心15min,弃去上清液，加入IM的 TEBuffer (pH 7. 0) 20ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对菌体进行破碎(超声条件声波 时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液(16ml)。利用截留分子量为IOOkDa的平板式超滤膜(再生纤维素材质，0. 09m2)对上清液 进行分离，分离条件溶液PH值6. 8，NaCl浓度50mM，流速0. 2ml/min,超滤时间2小时，取 滤出液(24ml)；利用30kDa的平板式超滤膜(再生纤维素材质，0. 09m2)对滤出液进行二次 超滤分离，分离条件溶液PH值6. 8，NaCl浓度50mM，流速0. 2ml/min,超滤时间3小时，截 留液(IOml)即为黄素还原酶溶液，纯度为94.3%。实施例3，提取基因重组黄素还原酶的方法，步骤取基因重组工程菌E. coli/pETfrm的发酵液250ml，离心15min (离心条件4°C， 2500g)，用IM的TE Buffer (pH 7. 0) 150ml清洗菌体，再离心15min,弃去上清液，加入IM的TEBuffer (pH 7. 0) 30ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对菌体进行破碎(超声条件声波 时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液(25ml)。
利用截留分子量为IOOkDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)对上清液进行 分离，分离条件溶液pH值6. 5，NaCl浓度IOmM,流速0. 2ml/min,超滤时间3小时，取滤出 液(36ml)；利用50kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)对滤出液进行二次超滤分离， 分离条件溶液pH值6. 5, NaCl浓度10mM，流速0. 2ml/min,超滤时间4小时，截留液(20ml) 即为黄素还原酶溶液，纯度为95 %。
权利要求
一种提取重组黄素还原酶的方法，是以截留分子量为100 150kDa的超滤膜超滤处理黄素还原酶的粗酶液，获得的滤出液再用截留分子量为10 30kDa的超滤膜进行处理，最终获得高纯度的黄素还原酶溶液；所述粗酶液是将表达黄素还原酶的大肠杆菌(E.coli)菌体超声破碎、离心后得到的上清液。
2.根据权利要求1所述的提取黄素还原酶的方法，其特征在于用超滤膜处理时，溶液 pH值5-9，离子强度0-1M。
3.根据权利要求1或2所述的提取重组黄素还原酶的方法，其特征在于所述用截留 分子量为10-30kDa和100-150kDa的超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。
全文摘要
本发明提供了一种基因重组黄素还原酶的提取工艺，属于生物分离工程技术领域，主要是应用超滤分离技术，经过破碎、离心和超滤三个简单步骤，即可从重组大肠杆菌(E.coli)中分离出高纯度的黄素还原酶，在提取过程中，未使用层析及蔗糖梯度离心技术，大幅度缩短了提取周期，实现了重组黄素还原酶的快速大规模制备。
文档编号C12N9/02GK101974495SQ20101050448
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者刘建国, 吕建仁, 崔占峰 申请人:中国石油大学(华东)