专利名称：一种基因、重组质粒及在提高番茄果实色素积累中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种调控番茄果实色素积累的基因、真 核重组质粒及其制备方法与应用。
背景技术：
番茄红素是重要的抗氧化剂之一，具有清除活性氧自由基、促进细胞间隙连接通 讯、防癌抗癌等多种生理功能。近年来基因工程从对结构基因的遗传操作已拓展到对调节基因的遗传操作 (Gantet P et al.，2002，Trends Pharmacol Sci，23 :563-9 ；Wagoner W et al. 2003， Activation tagging in tomato identifies a transcriptional regulator of anthocyanin biosynthesis, modification, and transport. Plant Cell，15 :1689-703)0 通过RNA干扰技术(RNAi)获得目标基因表达水平降低的转基因植株，再观察转基因植 株的表现型来研究基因的功能，也就是功能基因组学研究中应用最广泛的反向遗传学方 法。如，利用CaMV35S启动子在番茄中过量表达燕麦的红光和远红光受体光敏素(PHYA) 可以引起番茄果实高色素表现型，叶片和果实颜色加深，但植株矮化(Boylan MT, Quail PH. 1989，Oat phytochrome is biologically active in transgenic tomatoes. Plant Cell，1 :765-7 。过量表达蓝光受体隐花色素(CRY》基因也可以提高果实中类黄酮和 番茄红素的含量，叶片中叶绿素和花青素含量提高，植株矮化(Leonardo G，et al. ,2005, Manipulation of the Blue Light Photoreceptor Cryptochrome 2 in Tomato Affects Vegetative Development, Flowering Time, and Fruit Antioxidant Content. Plant Physiology, 137 :199-208)。利用RNAi技术组成型地干涉光形态建成的正调控基因LeHY5 的表达，使番茄果实的类胡萝卜素含量和叶片中的叶绿素的含量下降，而光形态建成的负 调控基因LeCOPlLIKE的RNAi转基因番茄果实中类胡萝卜素的总含量明显提高，叶片呈现 深绿色。(Liu YS, et al. , 2004,Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato. Proc Natl Acad Sci USA,101 9897-902)。番茄中存在一类单基因的高色素突变体hpl (high pigment-1)和hp2(high pigment-幻，这类突变体的成熟果实积累的类胡萝卜素总量可以达到野生型的三倍，同时 叶片和未成熟的绿果实中叶绿素的含量也比野生型的高，但这类突变体的幼苗对光存在超 敏反应(hyper-responsiveness to light)下胚轴伸长被抑制和花青素大量积累。研究发 现这类突变体可能影响光敏受体(phytochrome)和蓝光受体(crytochrome)下游的信号转 导(Songhu Wang, et al. ,2008, Altered plastid levels and potential for improved fruit nutrient content by downregulation of the tomato DDB1-interacting protein CUL4, The PlantJournal,55,89-103)。综上所述，现有技术中虽然公开了一些用于调控番茄果实色素积累的基因，但通 过基因工程技术克隆和筛选出更多的调节基因，对提高番茄果实色素积累，培育品质优良 的番茄仍然有着重要的作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的基因、真核重组质粒及其制备方法，本发明的 目的之二是将所述基因和真核重组质粒在提高番茄果实色素积累中应用，以培育出品质更 好的番茄。本发明的技术方案如下利用生物信息学方法分析确定一个与质体分裂调控有关的基因HPl (Gene Bank AY531660. 1)作为诱饵基因构建到PLexA酵母双杂交系统的表达载体中，然后利用番茄果 实发育的目标基因文库(所述文库及其构建见实施例1)筛选到与HPl基因相互作用的目 标基因,命名为HP5 (high-pigment 5)基因。序列分析显示基因HP5的mRNA包含1551个 碱基的开放阅读框，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO 2 所示。在 DFCI 网站(http//compbio. dfci. harvard, edu)找到 7 个 EST (expressed sequence tag)，显示该基因可能是番茄的一个调节基因。本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列中的基因片 段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸 序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的 基因片段之间存在有150bp的内含子。本发明所述真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下(1)在序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基 因片段是位于起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入 到质粒PSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK 中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子；(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段 的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述真核表达载体为pHB、pM0N1772、 pBE12、pBC7、pBI121 中的一种。将本发明所述真核重组质粒转化番茄，获得转基因番茄植株。实验表明所述转 基因番茄植株的未成熟果实颜色明显深于野生型番茄植株的未成熟果实；对成熟的转基因 番茄果实和野生型番茄果实的番茄红素的含量进行测定显示与野生型番茄的番茄红素含 量相比，转基因番茄的番茄红素含量有明显的提高。由此可见，本发明所述基因HP5和真核 重组质粒能够调控质体的发育和调控番茄果实色素积累，可在提高番茄果实色素积累中应 用。本发明具有以下有益效果1、本发明通过酵母双杂交系统筛选，克隆了一个新的基因HP5，并从该基因的核苷 酸序列中选择了一段基因片段与真核表达载体构建真核重组质粒，为提高番茄果实色素积 累提供了一种新的真核重组质粒，有利于番茄品质的改良。2、本发明所用的基因为番茄本身自有的基因，所以转基因番茄的安全性能高。3、本发明所述基因的克隆和番茄转基因均为常规方法，所需材料易于获取。
图1是本发明所述基因HP5全长序列的扩增电泳图，图中，M泳道分子量标记 (Trans2k plus DNAMarker，购自TRANS公司)；1泳道基因HP5的全序列。图2是本发明所述真核重组质粒(pBI121_HP5RNAi)的一种示意图，其中，sense为 正向基因片段，anti-sense为反向基因片段。图3是真核重组质粒pBI121_HP5RNAi转基因番茄植株中转基因抗性筛选标记卡 那霉素抗性基因(NPTII)的PCR扩增结果图，图中，M泳道=Marker (DL2000) ；P泳道阳性 对照，PCR模板为真核重组质粒pBI121-HP5RNAi ；C泳道阴性对照，PCR模板为野生型番茄 植株DNA ； 1-7泳道PCR模板为候选的转基因番茄植株DNA。图4是番茄植株的RT-PCR鉴定结果图，图中，WT泳道野生型番茄植株；1泳道真 核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄1号植株；2泳道真核重组质粒pBI121_HP5RNAi 转基因番茄2号植株；3泳道真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄3号植株。图5是真核重组质粒pBI121_HP5RNAi转基因番茄植株叶片和野生型叶片的颜色 对比照片，从左至右计数，第1 3片番茄叶分别为pBI121-HP5RNAi转基因番茄1号、2号、 3号植株的叶片；第4片番茄叶为野生型番茄植株的叶片。图6是真核重组质粒pBI121_HP5RNAi转基因番茄植株叶片和野生型番茄植株叶 片叶绿素含量测定的统计图，图中，WT代表野生型番茄植株，图7是真核重组质粒pBI121_HP5RNAi转基因番茄果实和野生型番茄果实在绿肩 (green shoulder)期间的色素含量对比照片，其中，A为野生型番茄果实；B、C、D为分别为 pBI121-HP5RNAi转基因番茄1号、2号、3号的果实。图8是真核重组质粒pBI121_HP5RNAi转基因番茄植株和野生型番茄植株在相同 的生长环境下生长60天后植株的表型对比照片，图中，WT代表野生型番茄植株。图9是真核重组质粒pBI121_HP5RNAi转基因番茄植株和野生型番茄植株节间长 的统计分析图，图中，WT代表野生型番茄植株。图10是根据紫外分光光度计测定番茄红素标准品的吸光值绘制的标准曲线图。图11是真核重组质粒pBI121_HP5RNAi转基因番茄果实中的番茄红素含量和野生 型番茄果实中的番茄红素含量测定统计分析图，图中，WT代表野生型番茄植株。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件 的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆实验 室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。实施例1 番茄果实发育的目标基因文库(cDNA)构建1、番茄果实Total RNA的提取1)液氮迅速研磨番茄果实(直径2-3cm的绿色果实)，按50_100mg组织/ml Trizol (购自北京天为时代科技有限公司)加入Trizol，剧烈震荡，室温放置5min。2) 212，OOOrpm 离心 5min。3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置!Bmin。
4) 4"C 12，OOOg 离心 15min。5)取上清，按0. 5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混勻，室温放置lOmin。6) 4°C 12，OOOg 离心 lOmin，弃上清，RNA 沉于管底。7)按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。8) 4"C 8，OOOg 离心 5min，尽量弃上清。9)室温干燥5-lOmin (RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。10)用 50ul DEPC-H20 溶解 RNA 样品，55-60°C，5-10min。2.、磁珠法分离mRNA (promega mRNA分离试剂盒，购于宝信生物技术有限公司)1)在 RNase-free 的 Eppendorf 管中加入 0. 1 1. Omg 的总 RNA 禾口 RNase—free /K 至终体积为500ul.2) 65 °C 加热 10 分钟。3)加入3ul生物素标记的Oligo (dT)和13ul 20 X SSC于RNA中，轻轻混合，室温 放置逐渐冷去至室温，一般需10分钟左右。4)同时配 0.5 X SSC 1. 2ml 和 0. 1 X SSC 1.4ml.5)将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧 (约30sec)，小心去上清，切不可离心。用0. 3ml 0. 5 Xssc漂洗SA-PMPs，用磁性分离架集 中磁珠，去除上清，重复3次。6)将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0. Iml 0. 5Xssc，注意漂洗后的SA-PMPs应在 30分钟内使用。7)将(3)中的oligo (dT) /mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，轻 轻摇勻，室温下放10分钟。8)用磁性分离架捕获SA-PMPs，小心去上清，但不要弃去。9)用0. 1 X SSC,每次0. 3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽 可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs。10)将SA-PMPs重新悬浮在0. Iml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开， 洗脱mRNA。11)用磁性分离架捕获SA-PMPs，将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。12)将SA-PMPs再悬浮于0. 15ml RNase-free的水中，洗脱，与(11)步洗脱液合并。13)将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转 录，则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18)。14)加0. 1体积的3mol/l NaAc和1. 0体积的异丙醇于洗脱液中，_20°C沉淀过夜。15)4°C，13000g离心60分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混勻。16)4°C，7500g 离心 10 分钟。17)去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。18)重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱。3、cDNA双链合成(promega cDNA文库构建试剂盒，购于宝信生物技术有限公司)3. ISuperscipt II-RT 合成第一链1)在一 RNase-free 的 0. 2ml PCR 管中，加入
5ul mRNA (大约 500ng)Iul Xho I Primer (1. 4ug/ul)(5，GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT. · · 3，)6ul RNase-free water2)混勻后，70°C反应10分钟。3)反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5min。稍微离心一下，顺序加入以下试剂5Xfirst strand buffer,4ul ；0. IM DTT，2ul ；IOmM dNTP, Iul ；混勻，稍微离心反 应物之后，42°C放置2分钟；反应完成，趁热加入Iul Superscipt II-RT，混勻；42°C反应50 分钟，然后70°C，15分钟灭活反转录酶。3. 2cDNA第二链的合成1)第一链反应完成后，取2ul —链产物_20°C冰箱中保存，待电泳检测。其余的产 物合并，混勻，然后顺序加入下列试剂(promega)10XDNA Polymerase I buffer, 20u 1 ； IOmM dNTP，6ul;dd H20,163ul ；RNase H(2U/ul)，Iul ；DNA Polymerase I (lOU/ul)，IOul ；总体系为 200ul。2)混勻后，16°C反应2. 5小时。3)70°C灭活 10 分钟。4)反应完成后，得到200ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上。幻取2111 二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上11Λ ladder，确定 双链的大小范围。3. 3双链cDNA末端补平1)在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂(promega cDNA文库构建试剂盒，购 于宝信生物技术有限公司)IOmM dNTP，6ul ；T4 DNA Polymerase(8. 7U/ul) ,2ul ；BSA(10mg/ml)，2ul。2)稍微离心混勻反应物，37°C反应至少30分钟，然后75°C灭活10分钟。3)加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟。4)离心后，吸取上清于另一 1. 5ml eppendof管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几 次混勻后，常温下13000g离心5分钟。5)吸取上清至另一 ^pendof管，加入1/10V3M NaAc (PH5. 2)和2. 5V预冷的无水 乙醇，混勻，_20°C放置过夜以沉淀双链cDNA。6)第二日，将昨日沉淀物在4°C，13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA。7)离心完毕，弃上清，加入Iml 70%乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5分钟。8)离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味。9) PCR纯化试剂盒操作流程9-1)溶液PE使用前应加入适量体积95% -100%的乙醇，混勻。9-2)向200ul 二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混勻。9-3)加入 spin column 中，13000rpm 离心 lmin。9-4)加入 0. 75ml buffer ΡΕ, 13000rpm 离心 lmin。9-5) 13000rpm,再离心 lmin。
9-6)将 spin column 放入一新的离心管中，加入 50ul buffer EB，静置 lOmin。9-7) 13000rpm 离心 2min。9-8)加入 30ul buffer EB，静置 IOmin09-9) 13000rpm 离心 2min。9-10)加入1/10体积3M的NaAc，2. 5倍体积无水乙醇，混勻，_20°C沉淀过夜。3. 4EcoR I 接头(adaptor)力口接1)往双链 cDNA 沉淀中加入 9ul EcoR I adaptor (400ng/ul)，4°C至少放置 30 分 钟以充分溶解cDNA沉淀。2)溶解完成后，顺序加入下列试剂IOXLigase Buffer, 1. 2ul ； IOmM rATP, Iul ；T4DNA Ligase，Iul。3)混勻后，4°C连接3days，或者8°C过夜连接。3. 5双链cDNA末端的磷酸化及Β ο I酶切1)连接反应完成后，将反应体系70°C放置15分钟灭活T4DNA Ligase02)稍微离心使反应物集中至管底，室温下放置5分钟，然后加入下列试剂IOXLigase Buffer, Iul ； IOmM rATP, Iul ；dd H20，6ul ；T4PNK (10U/ul)，Iul。3)37°C反应30分钟，然后70°C灭活15分钟。4)稍微离心使反应物集中至管底。5)室温放置5分钟；然后加入下列试剂Xho 10XBuffer,4ul ；BSA,2ul ；ddH20,5ul ；Xho I (10U/ul)，8ul。6)37°C反应1. 5小时，然后65°C灭活酶10分钟。7)反应完成，双链cDNA合成完毕。置于4°C准备回收。3.6胶回收cDNA IAEXII GEL Extraction Kit回收试剂盒，购于保守宝信生物技 术有限公司)1)配制小胶数板(每个样品一板)琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml胶。2)取4°C保存样品上样，40ul/孔。3)电泳 50V;lhr。4)紫外灯下分别切下500 IkbU. 0-2. Okb及2. 0-4. Okb cDNA片段·，分别放入 已做标记的1.5ml离心管中。5)称取胶重，加入三倍体积buffer QXI (例如，IOOmg胶中加入300ul buffer QXI)。6)50°C水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹QIAEX II使重悬，每管中加入 5ulQIAEXII。7) 50°C水浴lOmin，每隔^iin取出颠倒混勻数次，使QIAEX II保持悬浮。8)4°C,13000rpm,30seco (弃上清，离心机中甩一下，吸取上清)。9)加入 500ul buffer QXI，轻弹管底使 QIAEX II 重悬。10)离心并去上清(同操作8)。11)加入 500ul buffer PE，重悬 QIAEX II，离心 30sec，去上清。12)再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一 下，吸去上清。
13)超净台上吹干(至无乙醇味)，加入IOul elution buffer，重悬QIAEX II，静 置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。14)取Iul上清上样电泳，同时做分子量标准(11Λ ladder)及DNA含量标准 (10ng，20ng)作对照。15)将收回的cDNA置于_20°C内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。4、载体制备4. IpBlueScriptII的提取(promega cDNA文库构建试剂盒，购于宝信生物技术有 限公司)1)取Iul商品的pBlueScriptll，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均勻 涂布在含AMP的LB平板上，37 °C培养过夜。2)第二天取一只无菌的50ml离心管，加入IOml AMP抗性的LB液体培养基，挑单 克隆于离心管中，370C，250rpm,培养过夜。3)第三天取200μ 1小摇后的菌液接种于250ml含AMP的LB液体培养基中，37 °C， 250rpm培养6hr左右，使OD值达到0. 6-0. 8。4)将菌液移入250ml离心管中，4°C，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上 倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。5)力卩入 IOml 溶液 I (50mM Glucose, 25mM Tris-HCl, IOmM EDTA, ρΗ8· 0)，力口入 RNase至终浓度100 μ g/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置lOmin。6)按Na0H(0.4N) SDS(2% )—1 1的比例新鲜配制溶液II，加入20ml溶液 II，静置 3-5min。7)加入15ml冰浴的溶液III，冰浴15_30min。8)4°C，5000rpm，离心 15min。9)取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。10)每管加入0. 6倍体积的异丙醇，充分混勻，室温下放置IOmin。11)20°〇，1200(^，离心201^11回收质粒沉淀。12)弃上清，用70%的乙醇洗2次。13)弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。14)用 3ml TE (pH8. 0)溶解沉淀，移入 1. 5ml Eppendorf 离心管中。15)电泳检查DNA质量并定量。4. 2pBlueScriptII 的双酶切消化1)以如下体系进行EcoRI酶切pBSK⑴，20μ 1 ；ddH20,154μ 1 ； 10XBuffer Ε，20μ 1 ；混勻，加入限制性内切酶 EcoRIdOU/μ 1)，6μ 1 ；总体积为，200 μ 1。2)轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混勻，在离心机上甩一下。3)37°〇，水浴1111·。4)加入 200ul 1 1 的酚 / 氯仿，混勻。4°C，13000rpm，离心 15min。5)取上清，加入等体积的氯仿，4°C，13000rpm，离心lOmin。6)取上清，加入0. 1倍体积的NaAC和2. 5倍体积的无水乙醇，-20 V，沉淀30min。7)4°C，13000rpm，离心 lOmin，弃上清，取沉淀。
8)加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。9)4°C，13000rpm，离心 lOmin，弃上清，取沉淀。10)自然风干沉淀，至无乙醇味，加入IOOul ddH20充分溶解沉淀。11)加入以下试剂进行BioI酶切ddH20, 74 μ 1 ； 10XBuffer D,20y 1 ；混勻，加入限制性内切酶 XhoI =XhoI (10U/ μ 1)，6μ 1 ；总体积为 200 μ 1。12)轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混勻，在离心机上甩一下。13)37°〇，水浴1.5111·。14)加入200ul 1 1的酚/氯仿，混勻。15)4°C, 13000rpm，离心 15min。16)取上清，加入等体积的氯仿，4°C，13000rpm，离心lOmin。17)取上清，加入0. 1倍体积的NaAC和2. 5倍体积的无水乙醇，_20°C，沉淀30min。18)4°C，13000rpm，离心 lOmin，弃上清，取沉淀。19)加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。20)4°C，13000rpm，离心 lOmin，弃上清，取沉淀。21)自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH20充分溶解沉淀，得到双酶切载体。4. 3载体去磷酸化1)在40ul双酶切载体中加入以下试剂10 Xbuffer, 6ul ；CIAP (0. 01U/ul)，6ul ；ddH20，8ul ；总体积 60ul。2)轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混勻，在离心机上甩一下。3)37°〇，水浴1111·。4)70°C，15min，灭活酶。5)电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。5、cDNA双链和载体的连接根据载体和cDNA的电泳定量结果，每个样品设置3个比例的连接，即dnsert/ vector = 1/3 incert/vector = 1/1 insert/vector = 3/1按以下体系依次加入 ddH20xul
0182]T41igase IOx bufferIul
0183]PBK(E/X)vector (20ng/ul) Iul
0184]cDNA (由浓度及连接比例而定)
0185]T4DNA ligase(3U/ul)Iul
0186]TotalIOul14°C，连接 12 小时。6、连接产物纯化和电转化6.1连接产物纯化1)将连接产物转移至一 1. 5ml Eppendorf管中，加入下列试剂ddH20, IOu 1 ；3M NaAC (PH5. 2)，2ul ；无水乙醇，50ul ；轻轻混勻，稍微离心并将其 置于-20°C放置1小时以上。2) 4°C，top Speed 离心 30 分钟。
3)小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4)加入500ul70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀(注不要离心混勻)。5) 4°C，top Speed 离心 5 分钟。6)小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味。7)加入10ulddH20重新溶解沉淀，4°C短期保存，_20°C长期保存备用。6. 2电转化1)从_80°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。2)取1 μ 1纯化后的质粒于一 1. 5ml的离心管中，将其和0. ICM的电极杯一起置于 冰上预冷。3)将40 IOOul解冻的感受态细胞转移至此1. 5ml的离心管中，小心混勻，冰上 放置IOmin。4)打开电转仪，调至Manual，调节电压为2. IKV05)将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均勻进入电极 杯的底部。6)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入 1000 μ 1的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1. 5ml的离心管中。7) 37 °C, 220-250rpm 复苏 1 小时。8)取20ul转化产物加160ulS0C涂板，放于37°C温室，过夜培养，次日查看转化结 果，其余菌液加1 1的30%的甘油后混勻-80°c保存。7.菌落PCR
1)取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17. 3ul的灭菌水。
2)用灭过菌的IOul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混勻。
3)依次加入
IOxbuffer2. 5ul
Mgcl2(25mM)1. 8ul
DNTP (2. 5mM)Iul
T3 引物(IOpmol)Iul
Τ7 引物(IOpmol)Iul
iTaq 酶0. 4ul
total25ul
各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上
4)反应条件94 V 5min(预变性)；94 V 40s (变性)，53. 6 V 30s (复性)，
72 0C 4min (延伸)，所述变性_复性_延伸35个循环；72 °C 5min (终延伸。)5)待PCR反应进入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电 泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小 及小片段率。6)将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。8. pBlueScript cDNA 库扩增1)将cDNA文库转入大肠杆菌，如DH5a(DH10B)后，取少量菌液涂布氨苄平板，以推算克隆总量。2)取一大小合适的三角瓶，根据克隆总量配制2x LB液体，每500ml 2x LB液体可 扩增5x105个克隆，可以适当增加2x LB液体的量，但不能少于此比例。3)按每IOOml加0. 3g的比例在2xLB液体中加入琼脂糖。4) 70°C加热搅拌至琼脂糖溶解，高压灭菌后再70°C搅拌30分钟。5)37°C放置 1 小时。6)加入适量安苄青霉素，使之终浓度为50ug/ml。7)加入全部菌液，并轻柔旋转使之混勻，避免振荡。8)将三角瓶置于冰水中1小时，水面必须没过三角瓶内液面。9)轻轻取出三角瓶，30°C培养40-45小时。10)将三角瓶内容物全部转入离心管中，离心10，OOOg, 20分钟，必须室温。11)弃上清，每IOOml培养基离心得到的沉淀用IOml 2x LB-甘油(12. 5%)重悬。12)将重悬液留下IOul检测滴度，其余分装于1. 5ml离心管，_80°C冰箱内保存。13)取Iul扩增后菌液倍比稀释。14)各取IOul稀释为10-5和10_6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上， 37°C过夜培养，次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数。通过本实施例获得了番茄果实发育目标基因的cDNA文库。实施例2 利用酵母双杂交实验筛选与HPl基因相互作用的目标基因1、培养基与试剂1. 1SD/-Ura 液体培养基酵母氮源化他)，0.678;葡萄糖，2.0(^;10\00(-见8，-1^11，-11卬，-此&)，10.01111； 20 XHis，5. Oml ；20 X Leu, 5. Oml ；20 X Trp, 5. Oml ；ddH20 至 100. Oml ； 115°C，灭菌 15min。1. 2YPD液体培养基Polypepton, 6. Og ；bacto-Yeast Extract, 3. Og ；葡萄糖,6. Og ；ddH20 补至 300ml， 115°C,灭菌 15min。1. 310 XDropout (-His, -Trp, -Leu, -Ura)氨基酸溶液为不含His，Trp，Leu，Ura 等成份的 IOXDropout 溶液。每IOOOml溶液中含有下列成份，用ddH20配制后保存于4°C。l)L-Isoleucine L-异亮氨酸300mg2) L-Valine L-缬氨酸1500mg3) Adenine 腺嘌呤200mg4) L-Arginine HCl L-精氨酸200mg5) L-Lysine HCl L-赖氨酸盐酸盐300mg6) L-Methionine L-甲硫氨酸200mg7) L-Phenylalanine 苯丙氛酸500mg8) L-Threonine L-苏氨酸2000mg9) L-Tyrosine L-酪氨酸300mg1.4 20 X氨基酸储存液 每IOOml溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4°C。
20×HiS L—Histidine L一组氨酸40mg
20×／rp L-／ryptophan L一色氨酸40mg
20×Leu L—Leuc ine L一白氨酸200mg
20×Ura Uracil尿嘧啶40mg
1．5酵母转化缓沖液
缓沖液体积缓沖液配制
10×／E100ml／riS 1．2ig；ED／ANa2。2H20 0．37g；ddH20 80ml；盐酸调pH7．5；ddH20
定容
10×LiAc100ml LiAc．2H20 10．20g；ddH20 50ml，冰醋酸调pH7．5；ddH20定容
50％PEG100ml PEG335050．Og；ddH20定容
1．6其它缓沖液
缓沖液体积缓沖液配制
TE 1000ml；TriS 1．2ig；ED／ANa2。2H20 0．37g；ddH20 800ml；调pH；ddH20定容。
S／E 1000mlNaCl 5．84g；TriS 1．2ig；ED／ANa2。2H20 0．37gddH20 800ml盐酸调pH8．0；ddH20定容
2、酵母双杂交实验的基本流程
2．1将报告基因p80p—LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD／一Ura筛选。
2．2同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
2．3构建DNA—BDfl靶蛋白质粒pLexA—HPl，作为钓饵(bait)。
2．4将上述钓饵质粒pLexA—HP l转化EGY48(p80p—LacZ)细胞株，用SD／一Hi s／一Ura筛选；
并用固体诱导培养基SD／Gal／Raf／一His／一Ura检测此DNA—BD／靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
pLexA—Po sSD／一Hi S，一Ura蓝阳性对照
pLexASD／一Hi S，一Ura白阴性对照
PLexA—HP 1SD／一Hi S，一Ura白没有直接激活活性
PLexA—HP 1SD／一Hi S，一Ura蓝具有直接激活活性
PLexA—HPlSD／一HiS，一Ura菌落不能生长酵母细胞毒性
1)如果pLexA—HPl能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少半乳糖苷酶的信号作用。
2)如果pLexA—HPl虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
2．5如果pLexA—HPl既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与实施例l纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。
转化质粒SD固体培养基LacZ表型
对照lpLexA—Pos Gal／Raf／一Hi s／一Ura蓝
对照2pLexA一53Gal／Raf／一Hi s／一Trp／一Ura／一Leu+pB42AD—T蓝
实验pLexA-HPlGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/_Leu+pB42AD-文库待测1)用SD/-HiS/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质 粒在诱导前达到最大拷贝数。2)上述重组转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-HiS/-Trp/-Ura/-Leu， 观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu 虽有表达，但半乳糖苷酶无表达。3)同时用LacZ、LeU两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差， 譬如AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个 报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。4)将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。2. 6阳性克隆的筛选1)随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E. coli KC8宿主菌，抽提 大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。2)如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大 小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。2. 7用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克 隆1)将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1_2天，含有HIS3 编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10% -20%左右的频率随机丢失。2)30°C孵育2-3，将上述克隆，转铺固体培养基SD/_Trp/-Ura。3)再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛 选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。4)将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证 AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。2. 8酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或 文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-HPl与pB42AD_文库确实具有相互作用的真阳性克隆。质粒1(in YM4271)质粒 2(in EGY48) LacZ 表型 Leu 表型pLexA pB42AD 白不能生长pLexA-HP lpB42AD 白不能生长pLexA pB42AD_文库白不能生长pLexA-HP lpB42AD_ 文库蓝真阳性pLexA-Lam pB42AD_ 文库白不能生长2. 9阳性克隆的进一步筛选和确证1)扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因 组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。电转化E. coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始 调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含 有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。3)用pLexA-HPl与pB42AD_库DNA——对应、共转化只含有报告基因的酵母菌 EGY48中，先到SD/-HiS/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的 表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、LeU报告基因的表达。4)扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。通过本实施例获得一个与HPl基因相互作用的新基因，命名为HP5 (high-pigment 5)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。实施例3 基因HP5的克隆1、试剂限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、PrimeStar热启动高保真DNA聚合 酶、pMDIS-T克隆载体、大肠杆菌(E. coli)JM109菌株等购自大连宝生物工程公司；Trizol 试剂购自北京天为时代科技有限公司；质粒提取及DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；PCR引 物由上海英俊生物公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。2、大肠杆菌菌株和植物材料大肠杆菌克隆菌株为E. coli JM109，购自Clontech公司。番茄野生型种子为AC+， 可通过市场购买。3、培养基和溶液LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7. 0，高压 灭菌。SOB 培养基胰蛋白胨 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 0. 58g/L，KCl 0. 19g/L， IOOXMg2+IOmLo 用 NaOH 调 pH 至 7. 0，高压灭菌。SOC 培养基S0B+20mM 葡萄糖。TB buffer (临用前配置)=IMKCl 4mL, 0. 45MMnCl22. 4mL, 0. 50M CaCl2O. 6mL,0. 50M K-MES 0. 5mL, ddH20 12. 5mL(总体积 20mL)。IOOXMg2+溶液:20. 33g MgCl2. 6H20 ；24. 65g MgSO4. 7H20定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。20%葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于IOOmL H2O,过滤除菌。IM KCl 溶液7. 45g KCl 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。0. 45M MnCl2 溶液8. 9g MnCl2. 4H20 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。0. 50M CaCl2 溶液7. 35g CaCl2. 2H20 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。0. 50M K-MES 溶液9. 76g MES 定容于 IOOmL H2O,用 KOH 调 pH 至 6. 3，过滤除菌， 分装成0. 5mL每管，-20°C储存。DMSO 分装 200 μ 1 新鲜 DMSO，_20°C 储存。4、实验方法4. 1质粒微量提取1)将带有克隆载体pMDIS-T质粒(购自大连宝生物工程公司)的E. coli JM109 接种于裝有5ml LB培养液(含适量抗生素)的试管中，37°C摇床培养12 16hr，以扩增质粒。2)取1. 5 5ml的菌液，于室温下10，OOOxg离心lmin。倒净培养基，往沉淀中加 入250 μ 1的solution I/RnaseA (购自OMEGA公司)混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。3)往重悬混和液中加入250 μ 1 solution II (购自OMEGA公司)，轻轻翻转试管 4 6次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。4)往上述混和液中加入350ul solution III (购自OMEGA公司)，并温和地上下 颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10，OOOxg离心lOmin。5)取一干净的质粒微量分离柱置于2ml收集试管上(已备)。小心将上清转至 质粒微量分离柱内，确保转至柱内的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下10，OOOxg离心 lmin，使裂解液完全流过柱子。6)弃去离心甩出液，加入500 μ 1的solution HB缓冲液(购自OMEGA公司)到柱 子上，室温下10，OOOxg离心Imin洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的
高质量DNA。7)弃去收集液，加入700 μ 1用无水乙醇稀释的wash buffer缓冲液洗涤柱子，室 温10，OOOxg离心lmin,弃去洗涤液。8)可选做步骤重复步骤7，用700 μ 1 wash buffer缓冲液再洗涤柱子一次。9)室温下10，OOOxg离心空柱2min以甩干柱子基质。10)把柱子置于一干净的1. 5ml离心管上，直接加入30 50 μ 1灭菌去离子水或 TE缓冲液液到柱子基质上(所加的量取决于预期终产物浓度)，10，OOOxg离心Imin以洗脱 出 DNA0存)。
16
4. 2DNA回收方案
见实施例1的3. 6胶回收方案。
4. 3番茄叶片RNA的提取
见实施例1的1.番茄果实Total RNA的提取。
4. 4RT-PCR
1)RT
冰上在一个200 μ 1 EP管中加入以下组分 5XRT Buffer4 μ 1
dNTP Mixture(各 IOmM)2 μ 1
RNase Inhibitor (IOU/μ 1)1 μ 1
01igo(dT)20(10pmol/y 1)1 μ 1
Total RNA3 μ 1
RNase-Free H2O8 μ 1
ReverTra Ace1 μ 1
按以下程序进行反转录42°C 20min(反应)；99°C 5min(酶变性)；4°C 5min(保
2)PCR
1))番茄基因HP5的克隆
冰上在一个的200 μ 1 EP管中加入以下组分5XPrimeStar BufferdNTP Mixture (各 2. 5mM)
10 μ 1 4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 32. 5μ 1 0. 5μ 1RT 产物HP5-F1HP5-R1ddH20 PrimeStar按以下程序进行扩增:98°C 3min (预变性)；98°C IOs (变性)，58°C 15s (复性)， 72 °C 2min (延伸)，所述变性_复性_延伸30个循环；72 °C 5min (终延伸)。以上述PCR产物为模板，以巢式引物HP5-F2和HP5-R2进行第二轮高保真PCR，延 伸时间2min，其它条件同上。引物序列如下HP5-F1 :5，-GCAGCCATATAAAACATGAGACT-3，HP5-R1 :5，-CTATTTACTTCGAACATCAGGCC-3，HP5-F2 :5， -GGATCCATGGAGACTTCATTGGTTAATC-3，HP5-R2 :5， -GAGCTCCTATTTACTTCGAACATCAGGC-3，通过上述操作，获得了番茄HP5基因的全长片段(1551bp)。4. 5目的DNA片段与克隆载体pMD18_T的连接目的DNA片段与克隆载体pMDIS-T按摩尔分子数比3/1连接，反应体系如下IOXligase Buffer1 μ 1pMD18-T(50y g/μ 1)1 μ 1目的 DNA 片段( 150 μ g/μ 1)Ιμ T4Ligase (350U/ μ 1)1 μ 1ddH206 μ 116°C，连接 12 小时。4. 6大肠杆菌转化1)感受态细胞的制备a)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37°C过夜培养；b)转接0. 5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18 °C剧烈震荡18 24h至 A600 ^ 0. 55 ；c)将培养液转入50mL离心管中，冰浴IOmin, 4°C 4，OOOrpm离心IOmin ；d)去上清，加16mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意轻轻旋转，不要用振荡器或 吹吸混勻)，冰浴 IOmin, 4°C 4，OOOrpm 离心 IOmin ；e)去上清，加4mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280 μ 1的DMS0，轻缓混勻，冰 浴 IOmin ；f)分装于预冷得1. 5mLEP管中，液氮冻存。2)转化a)从液氮中取出感受态细胞冰浴解冻；
b)将10 μ 1连接产物与感受态细胞轻轻混勻，冰浴30min ；c) 42°C热冲击 90s，立即冰浴 l_2min ；
d)加 0. 8mL 的 S0C,混勻，37°C温和摇床 Ih0e)室温13，OOOrpm离心lmin，倒掉一部分上清液，留约200 μ 1的上清液，用枪头 将上清液与细胞混勻，涂布LB+amp (50 μ g/ml)平板，37°C培养过夜。4. 7细胞快速裂解法鉴定重组质粒1)挑取单个转化子接种于500 μ 1含相应抗生素的LB培养液中，37°C振荡培养至 A600 为 0.6 0.8。2)取200 μ 1菌液至0. 5ml EP管中，13，OOOrpm离心lmin，去上清，留约20 μ 1上清。3)力口 20 μ 1 2 X 快速裂解液
，剧烈振荡。4) 13，OOOrpm 离心 15min。5)取5 μ 1上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组质粒。4. 8菌落PCR鉴定重组质粒经过快速裂解法鉴定的重组质粒再做菌落PCR以确定插入片段是目标片段，反应 体系如下 ο X PCR Buffer2 μ 1Mg2+(1. 5mM)1. 2μ 1
dNTP Mixture(各 2. 5mM)0. 6μ 1
菌液1 μ 1
M13F0. 4μ 1
M13R0. 4μ 1
ddH2012. 4μ 1
TaqDNA聚合酶1 μ 1
反应条件:94°C 5min (预变性)；94°C 40s (变性)，56°C 30s (复性)，72°C 2min (延
伸)，所述变性_复性_延伸30个循环；72°C 5min (终延伸)。对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，对测序结果进行比对和拼接，所得序列为 序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。实施例4 真核重组质粒的构建及其功能验证1、材料1. 1实验材料番茄野生型种子为AC+，可通过市场购买。1. 1. 1主要试剂1)菌株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a，购自天为时代公司。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 由本实验室保存。2)质粒pMD18-T 载体衍生自 pUC18，2. 692Kb，Ampr,为克隆 PCR 产物(ΤΑ Cloning)的专 用载体，插入位点为EcoRV的酶切位点，购自TaKaRa。
质粒pSKint (以下简写pSK) =Amp抗性，具有两处多克隆位点。植物真核表达载体pBI121 含有选择标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因及 β-葡萄糖苷酸酶(⑶S)基因，由本实验室保存。3)植物激素吲哚乙酸(IndoleaceticAcid, IAA)；激动素(Kinetin，Kt) ；6_ 苄氨基嘌呤 (6-Benzylaminopurine, 6-BA)；乙酰丁香酮(Acetosyringone, ACE) ；2，4-二氯苯氧基乙酸 (2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4~D)。4)抗生素羧卞青霉素(Carbenicillin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin，Km)5)植物DNA提取缓冲液IOOmmol/L Tris 'HCl(ρΗ8· 0)，50mmol/L EDTA(pH8. 0)，500mmol/L NaCl，IOmmol/ La-巯基乙醇，10%或20% SDS。6)培养基与溶液酵母提取物lg/L，胰蛋白胨 5g/L，蔗糖 5g/L，MgSO4. 7H20 0. 5g/L。用 NaOH 调 pH 至7.0，高压灭菌。番茄转化过程中所用培养基如下(表1)表1番茄组织培养所用培养基
权利要求
1.一种基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.一种真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中的基因 片段和真核表达载体构成，所述基因片段是起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序 列，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因 片段之间存在有150bp的内含子。
3.根据权利要求2所述的真核重组质粒，其特征在于所述真核表达载体为pHB、 PM0N1772、pBE12、pBC7、pBI121 中的一种。
4.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下(1)在序列表中SEQID NO :1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片 段是起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK 载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的PSK中间载体， 正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子；(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部 分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。
5.根据权利要求4所述的真核重组质粒的制备方法，，其特征在于所述真核表达载体 为 pHB、pM0N1772、pBE12、pBC7、pBI121 中的一种。
6.权利要求2或3所述真核重组质粒在提高番茄果实色素积累中的应用。
全文摘要
一种基因，它具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。一种真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子。制备方法(1)将上述基因片段正向插入到pSK载体上，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK载体；(2)利用限制性内切酶切下pSK载体上含有所述基因片段的部段连接到真核表达载体上。实验表明，所述真核重组质粒可在提高番茄果实色素积累中应用。
文档编号C12N15/79GK102121016SQ20101059855
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者刘永胜, 刘继恺, 唐晓凤, 张治国, 李颖楠, 苗敏, 高永峰 申请人:四川大学