专利名称：预测早产风险的方法
预测早产风险的方法
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早产(PTB)是新生儿死亡的首要原因，同时也是新生儿发病的ー个重要因素。在美国，所有活产婴儿中大约12%为早产，即，胎龄在37周前。PTB发病率并未下降，实际上，已显示出上升的趋势。PTB花费巨大，不仅在于即时的新生儿护理，而且也在于因早产所导致的持续发病所需的长期护理匕早产儿的护理消耗了用于儿童的健康保健费用的很大部分。最近的数据表明，PTB导致的长期后遗症比以前认识到的更多，包括这些孩子到达入学年龄时的显著的神经行为异常。PTB的有效预防或治疗，能显著降低新生儿死亡率和发病率，以及医疗保健费用。针对处于最高PTB风险的孕妇的治疗是迫切需要的。然而，除非我们能够可靠地确定哪些妇女和婴儿真正处于最高风险，否则这些类型的干预措施和治疗策略无法开始。到目前为止，预测哪些妇女将发生PTB的尝试都没有成功。虽然ー些生物标记物已显示出高特异性，但是它们缺乏敏感性和阳性预测值，这使得它们不适合作为危险分级的工具。鉴别用于预测PTB的生物标记物(体液中的蛋白质或遗传“倾向”)具有重要 的临床价值，这将允许对最高风险人群进行危险分级、治疗和护理，而确定的“较低风险”人群可避免不必要的治疗、住院和关注是否会拥有早产儿。鉴别处于最大PTB风险的妇女无疑将带来新的预防策略。短宫颈的鉴定已被证明是PTB的最强预测指标6’7，但仍缺乏使其成为有用的普遍人口筛查试验所需的显著测试特性。即使是连续测量，短宫颈对于预测PTB的敏感性仍然较低9。此外，非常短的宫颈(< 15毫米)的患病率是相当低的，这限制了使用该测量作为PTB的一个筛查试验。类似地，阳性胎儿纤连蛋白(FFN)与PTB紧密相关，而阴性试验是一个强有力的预测因子，其预示至少14天以上的继续妊娠6。FFN的较低的阳性预测值，以及不同人群的变异性，限制了它在普遍人群中的使用，同时也表明FFN和CL可能只是代表相同的生物学途径，在PTB的预测中，这两个生物标记物没有累加性。6细菌性阴道病(BV)的存在已经与PTB关联。1CI但是，就BV而言，数据是相互矛盾的。BV的存在似乎与一些人群的风险升高相关联，但并非所有人群都是如此n’12 ;治疗无症状妇女的BV没有使得PTB比例发生变化。13目前，筛查妇女BV以防止PTB仅对高风险妇女推荐。虽然到目前为止已经取得了一些进展，但是仍然没有针对早产的可靠和明确的标记物。本领域仍然需要针对PTB的更准确、更敏感的诊断或预测分析。发明概述一方面，提供了ー种用于诊断或预测早产(PTB)发生的可能性或升高的风险的方法，包括測量来自怀孕的哺乳动物受试者的生物样品中的生物标记物，即可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)，的表达水平，其中高于预定对照表达水平的升高的SE-CAD表达水平表明诊断为早产风险增加或或具有早产风险增加的可能性。另ー方面，提供了一种筛查孕妇人群过早宫颈重构(premature cervicalremode I ing)的方法,包括测量来自怀孕的哺乳动物受试者的生物样品中的生物标记物，即可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)，的表达水平，其中高于预定对照表达水平的提高的SE-CAD表达水平表明与PTB风险增加相关的宫颈变化。
另ー方面，提供了诊断试剂在检测或测量生物样品中SE-CAD从而诊断或预测早产(PTB)发生可能性或风险增加中的用途。本发明的其它方面和优势在以下有关优选实施方式的详细说明中进行了进ー步描述。附图
的简要说明图I为柱状图，显不了小鼠母体血清中的SE-CAD水平,该水平是在宫内注入LPS或生理盐水后2、4和6小时测量的，使用了炎症诱导的早产小鼠模型。图2为散点图，显示了在30周的胎龄之前的早产临产中的母体血清中的SE-CAD水平。正方形代表< 34周分娩的妇女的数据点，三角形代表> 34周分娩的妇女的数据点。图3为柱状图，显示了对照组(足月分娩)血清中的SE-CAD水平，发生先兆子痫但是未出现早产临产或未发生早产的妇女，以及出现早产临产但未发生早产的妇女。 图4为散点图，显示了出现早产临产的妇女母体血清中几种免疫生物标记物的表达，包括发生早产(PT)和未发生早产(T)的妇女。发明详述本发明通过提供ー种新方法满足了本领域的需求，该方法使用ー种新的宫颈重构生物标记物，即可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)，在有症状和无症状的妇女中诊断或预测早产发生的可能性或风险增加。A.定义如在本文中使用的，早产的“増加的可能性”，是指受试者将发展为早产的风险或可能性与预定对照相比的増加。在一个实施方式中，増加的可能性是指超过对照水平的5-6倍。如在本文中使用的，“早产”(PTB)是指胎龄小于37周的婴儿的出生。在一个实施方式中，晩期早产是指胎龄在34-37周之间的婴儿的出生。在另ー个实施方式中，早期早产是指胎龄小于34周的婴儿的出生。如在本文中使用的，“早产临产”(pre-term labor, PTL)是指胎龄小于37周的临产症状发作。临产症状包括痉挛或收缩、阴道排液、背痛、严重骨盆压力、阴道流血。早产临产可能会发展为早产，也可能不会。在一个实施方式中，PTL是指胎龄22周时或之后发生的临产。如在本文中使用的，“诊断”是指确定、筛查、或鉴定生物样品中表明受试者发生某种疾病的可能性增加的生物标记物的表达水平或存在。如在本文中使用的，“ PTB诊断”是指确定、筛查、或鉴定生物样品中表明受试者发生PTB的可能性增加或将发生PTB的可溶性E-钙粘蛋白的表达水平或存在。蛋白质“E-钙粘蛋白”(E-CAD)是紧密连接(TJ)途径中的一种关键蛋白质。E-钙粘蛋白是钙粘蛋白家族的成员，它是ー种钙依赖性粘附分子。钙粘蛋白是ー类I型跨膜蛋白，这种蛋白在细胞粘附中起到关键作用，确保组织内的细胞结合在一起。E-I丐粘蛋白由胞外结构域中的5个钙粘蛋白重复序列、I个跨膜结构域以及I个结合连锁蛋白的胞内结构域组成——这样就将紧密连接CU)和粘附连接(AJ)途径连接起来。人E-CAD序列是已知的；人E-CAD前蛋白原序列可以在NCBI的參考序列NP_004351. I中找到。该序列现明确引入作为參考。
已将E-钙粘蛋白功能或者表达的缺失与癌症的发展关联。类似地，E-钙粘蛋白的下调降低组织内细胞粘附强度，从而导致细胞运动。E-钙粘蛋白的等位基因变体与E-钙粘蛋白改变有夫，并且已被证明造成了选择疾病状态例如克罗恩病的风险增加22’23。虽然数据非常有限，然而最近的报告表明E-钙粘蛋白启动子多态性已被证明改变了 E-钙粘蛋白的表达。虽然该数据表明在AJ途径中的等位基因变体与疾病状态和AJ蛋白特异性表达都有关，但是在产科学中没有涉及该途径或该途径中的等位基因变体的数据。如在本文中使用的，“可溶性E-钙粘蛋白”(SE-CAD)是指当钙粘蛋白被剪接时释放的蛋白质，提示粘附连接功能的改变。SE-CAD是ー个120kDa E-钙粘蛋白分子的约SOkDa的肽降解产物，产生于钙离子依赖性蛋白水解过程。基质金属蛋白酶、胰蛋白酶、激肽释放酶7和纤维蛋白溶酶是能够执行此蛋白水解过程的范例分子。正如发明人所发现的，SE-CAD是E-钙粘蛋白分解的标记物，特别是在宫颈部位。SE-CAD在组织和生物流体中可被測量；SE-CAD水平表明钙粘蛋白表达的改变。人SE-CAD的蛋白序列对应于NCBI参考序列NP_004351. I的aa 1-750。该序列现引入本文作为參考。在特定的实施方式中，用于这些方法中的“SE-CAD”是指比SOkDa的肽更小的肽，或者是其中的ー个片段。在特定的实施方式中，这样的片段是被结合于SE-CAD序列中的E-CAD抗体所识别的那些片段，例如在 实施例中描述的研发生物系统公司(R&D Biosystems) ELISA中使用的抗体，或者特异性识别SE-CAD序列或片段的其它抗体。适合的SE-CAD片段包括SE-CAD序列的至少8_15个连续氨基酸。在另外的实施方式中，这些片段包括该序列的长度最多可为25aa、50aa、75aa、lOOaa、150aa、200aa、300aa、400aa、500aa、600aa、700aa、750aa 的连续氛基酸。如在本文中使用的，“生物样品”或“样品”是指包含可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)的任何生物流体或组织。最适用于本文描述的方法中的样品包括尿液、宫颈阴道液(CVF)和血清。其它有用的生物样品包括，但不限于，全血、血浆、唾液、阴道粘液、宫颈粘液、胎盘液、唾液、胎盘细胞或组织、子宮颈细胞或组织、阴道壁细胞或组织。在一些实施例中，“血”可指用作样品的任何血液成分，如全血、血浆或血清。这些样品可进ー步用盐水、缓冲液或生理上可接受的稀释剂稀释。或者，这些样品可通过常规手段浓缩。如在本文中使用的，术语“患者”或“受试者”是指雌性哺乳动物，包括人、兽医或农场动物、家畜或宠物、常用于临床研究的动物(包括非人灵长类动物、狗和小鼠。更具体而言，这些方法的受试者是人。在本文所述方法的ー个方面，接受该诊断或治疗方法的受试者无早产症状。在另一方面，接受本文所述诊断或治疗方法的受试者显示早产临床症状或具有早产史。如在本文中使用的，“早产临床指标”包括，但不限于既往PTB、短宫颈长度、细菌性阴道病、母体/宫内感染或炎症、吸烟、性传播疾病、非洲裔美国人、社会经济地位低、压力以及抑郁。如在本文中使用的，“健康受试者”或“健康对照”是指未发展为早产的ー个受试者或多受试者群体。在一个实施方式中，健康受试者可以是出现早产临产但是未发展为PTB的一个受试者或多受试者群体。在另ー个实施方式中，健康受试者可以是从未发展为PTL或PTB的一个受试者或多受试者群体。如在本文中使用的，“相同怀孕时期”是指当对照者与测试受试者处于同一妊娠孕周时采集样品。在一个实施例中，对照者可以早于或晚于测试受试者一个孕周。
如在本文中使用的，“短宫颈”或“短宫颈长度”(CL)是指经阴道超声测量的宫颈长度为25毫米或更短。在一个实施方式中，短CL的测量值为15mm或更短。如在本文中使用的，“胎儿纤连蛋白”(FFN)是指胎儿细胞产生的该蛋白质，FFN被发现于绒毛膜和蜕膜的界面上(在胎囊(fetal sack)和子宮内膜之间)。阳性FFN测试是指受试者阴道内(即在宫颈阴道液)中存在胎儿纤连蛋白。阳性胎儿纤连蛋白(FFN)测试与PTB紧密相关，而阴性测试是怀孕将持续至少14天的有力的预测因子。如在本文中使用的，术语“预定对照”是指规定群体中生物标记物表达的数值水平、平均值、中间值或平均范围。预定对照水平优选通过使用与受试者SE-CAD水平測量中使用的相同的检测技术来提供，以避免标准化中产生的任何误差。例如，对照可能包括与受试者处于相同怀孕时期的単一的健康怀孕哺乳动物受试者。在另ー个实施方式中，对照包括未发展为早产的单一的健康怀孕哺乳动物受试者。在另ー个实施方式中，对照包括具有PTL但是未发展为PTB的単一的健康怀孕哺乳动物受试者。在另ー个实施方式中，对照包括与受试者处于相同怀孕时期的多个健康怀孕哺乳动物受试者或者未发展为早产的多个健康怀孕哺乳动物受试者的群体。在另ー个实施方式中，对照包括与受试者处于相同怀孕时 期的多个健康怀孕哺乳动物受试者或者出现了早产临产但未发展为早产的多个健康怀孕哺乳动物受试者的群体。在另ー个实施方式中，对照包括处于更早怀孕时期的同一受试者。在又一个实施方式中，对照包括具有ー种或多种PTB临床指标但未发展为PTB的一个或多个受试者。另外，预定对照也可以是阴性预定对照。在一个实施方式中，阴性预定对照包括发生了 PTB的一个或多个受试者。如在本文中使用的，术语“对照表达谱”是指在规定的群体中而非在单个受试者中的ー种或多种生物标记物(包括SE-CAD)表达的数值平均值、中间值或平均范围。例如，在健康受试者中的ー种或多种生物标记物的阳性对照表达谱是在未发展为早产的平均健康受试者群体中的那种(些)生物标记物表达的数值或范围。同样的，在早产受试者中的一种或多种生物标记物表达的阴性对照表达谱是在由多个发展为早产的患者所组成的群体中的那种(些)生物标记物平均表达的数值或范围。除非在本说明书中另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员以及參考已公布文本所通常理解的相同的含义。应当认识到，本发明书中各种实施方式描述时使用了“包括”的措辞，而在各种环境下，相关的实施方式也使用“由……组成”或“基本上由……组成”的措辞。要注意术语“一”或者“ー个(种)”(原文为"a" or" an")，是指ー个或多个，例如，“ー个(种)免疫球蛋白分子”，应理解为代表ー个(种)或多个(种)免疫球蛋白分子。同样的，在本文中术语“一”(或“ー个(种)”)(原文为"a" (or" an" ))，“ー个(种)或多个(种)”，以及“至少ー个(种)”可以互相交換。B.早产的诊断/预后方法在一个实施方式中，本发明提供了ー种用于早产(PTB)的诊断或发生可能性预测的方法。该方法包括測量来自怀孕哺乳动物受试者的生物样品中生物标记物可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)的表达水平，其中，SE-CAD表达水平显著区别于预定对照中的表达水平表明诊断为早产或具有早产发生可能性。在依据该方法的另ー个实施方式中，预定对照是对照生物样品中的SE-CAD水平。在一个实施方式中，对照样品来自与受试者处于相同怀孕时期的健康怀孕哺乳动物。在另ー个实施方式中，对照样品来自未发展为早产的健康怀孕哺乳动物。在另ー个实施方式中，对照样品来自发生PTL但是未发展为PTB的健康怀孕哺乳动物。在进ー步的实施方式中，对照样品来自多个上述健康受试者的群体。在另ー个实施方式中，对照样品来自处于更早怀孕时期的同一受试者。在本发明的另ー个实施方式中，生物样品的表达水平或预定对照是中间值或平均值、数值中间值或数值中间值范围、数值模式、图形模式或表达谱。在一个实施方式中，生物样品是上面定义的任何样品。在另ー个实施方式中，生物样品是ー份或多份血清、尿液和宫颈阴道液。在另ー个实施方式中，如所描述，例如在下文的实施例5中所描述，生物样品是母体血清。在另ー个实施方式中，生物样品可以是宫颈阴道液或尿液。下文的实施例7描述了将各种生物流体用于本文中描述的诊断方法中。在一个实施方式中，这些方法提供了对PTB发生可能性的提示。在下文的实施例描述的初步研究中，对于一群妇女，发生PTB的妇女相比起那些发生PTL但是未发展为PTB
的妇女，其母体血清中的SE-CAD平均水平显著增加。SE-CAD水平高于或等于平均水平的妇女比SE-CAD水平低于平均水平的妇女发生PTB的几率增加5. 7。这些数据支持PTB基于其自身功能作为预测PTB的可行的生物标记物。此外，这些结果表明SE-CAD代表了与种族甚至既往孕产史相比而言，更紧密地与PTB发病机理相联系的生物过程。因此，在一个实施方式中，受试者中的SE-CAD表达水平高于健康对照表明发展PTB的可能性増加5-6倍。在另一个实施方式中，受试者的SE-CAD表达水平超过健康对照10pg/ml表明发展PTB的可能性増加200%。虽然这些特定的数值指标可作为商业规模数据涌现来进行细化，然而，SE-CAD与PTB的相关性，正如本文所描述的，是关键的诊断因子，即SE-CAD表达水平超过健康对照是PTB发生可能性増加的阳性指标。在另ー个实施方式中，本发明的方法进ー步包括测量样品中PTB的至少ー种额外生物标记物的表达水平,其中，SE-CAD和额外生物标记物的表达相应于预定对照中它们各自表达水平的组合变化表明诊断为PTB。在一个实施方式中，额外的PTB生物标记物是宫颈阴道液中的胎儿纤连蛋白。在另ー个实施方式中，诊断方法涉及将来自提供生物样品的哺乳动物受试者的SE-CAD测量结果与选自上面描述的那些PTB临床指标中的ー种或多种的PTB临床指标关联起来。这些临床指标均能够为熟练的临床医师提供额外的数据从而有助于提供PTB诊断或提示PTB可能性増加。在一个实施方式中，预定对照可被定制以解释PTB临床指标。例如，对于非洲裔美国人患者，可以使用包括未发展PTB的健康非洲裔美国人受试者的预定对照。例如，包括具有PTB临床指标的所有受试者(如，所有的非洲裔美国人受试者、所有的吸烟者、所有具有既往PTB的妇女)的预定对照的平均水平，可以基于所选择的临床指标而变化。在根据本发明的方法的更进ー步的实施方式中，受试者的PTB鉴别诊断可通过测量SE-CAD水平并测量更多第二或其它PTB生物标记物中的ー种和/或与上面描述的早产临床指标结合。在ー个方面，本文所描述的诊断或疾病监测方法进ー步包括将患者样品中的SE-CAD生物标记物的测量与至少ー个额外的PTB生物标记物特征的表达水平的测量组合起来。SE-CAD和额外的生物标记物的表达相对于它们在健康哺乳动物受试者中各自表达水平的组合变化是早产可能性提高的鉴别诊断的指征。
在本发明的另ー个实施方式中，诊断方法在取自第16孕周时或之后的受试者的和/或预定对照的生物样品上进行。在一个实施方式中，受试者的和/或対照的生物样品取自第34孕周时或之前。在另ー个实施方式中，生物样品取自16-20孕周。在另ー个实施方式中，生物样品取自20-24孕周。在另ー个实施方式中，生物样品取自24-28孕周。类似的，在哺乳动物受试者中监测PTB进展的方法包括在一段给定时间中测量来自具有PTB的哺乳动物受试者生物样品中SE-CAD的表达水平。在一个实施方式中，本发明的方法进ー步包括在受试者怀孕期间多次重复测量SE-CAD水平。在一个实施方式中，測量在怀孕期间重复两次。在另ー个实施方式中，測量在怀孕期间重复3次、4次、5次或更多次。在另ー个实施方式中，本发明的方法进ー步包括測量在怀孕期间不同时间采集的一系列受试者样品中的SE-CAD水平，并鉴别整个孕期SE-CAD表达增加的模式。在一个实施方式中，合适的时段包括大约16周时的基线，并其后每6-8周重复的SE-CAD測量。在其它实施方式中，在怀孕32周之后，更加频繁地重复后续的SE-CAD测量，其中SE-CAD水平的趋势随着逐步增加的測量而变高。在其它的实施方式中，医师可以选择不同的合适的评估周期。在另ー个实施方式中，受试者正在接受针对PTL或PTB可能性增加的治疗，该方 法使得确定治疗效果成为可能。在一个实施方式中，该方法包括測量来自给定时段内发生PTL的哺乳动物受试者的生物样品中的SE-CAD的表达。随后将SE-CAD表达水平与同一受试者早些时候、或治疗之前或之中測定的ー个或多个生物样品中的表达水平进行比较。在一个实施方式中，可采用相同患者的状态的ー个或多个在先评估进行直接比较。在另ー个实施方式中，參照可以是包括发生PTB的受试者的阴性对照。在另ー个实施方式中，受试者的生物样品与同一受试者早些时候的生物样品或预定对照相比，具有相同或降低的SE-CAD表达水平表明治疗具备有效性。受试者样品中的SE-CAD表达水平高于受试者先前的表达水平(或參考平均值)是PTL进展或治疗缺乏有效性的指征。在另ー个实施方式中，治疗过程中SE-CAD表达增长率的下降表明治疗具备有效性。在又一个实施方式中，诊断方法包括测量作为核酸(如，mRNA、DNA、cDNA)或蛋白质的SE-CAD的表达。在另ー个实施方式中，该方法进ー步包括将来自受试者的生物样品与用来测量样品中SE-CAD核酸或蛋白质第一水平的诊断试剂接触。在又一个实施方式中，该方法包括在怀孕期间的第二稍后时间接触来自受试者的第二生物样品，并测量SE-CAD的第二水平。可基于第二水平较怀孕时期与从该受试者采集第二样品时相同的健康怀孕哺乳动物受试者的水平的増加，提供早产风险増加的诊断。在另ー个实施方式中，可基于第二水平较未发展为早产的健康怀孕哺乳动物受试者的増加来提供诊断。在另ー个实施方式中，可基于第二水平较如前所述的多个对照受试者组成的群体的増加来提供诊断。在另ー个实施方式中，可基于第二水平较处于怀孕早些时候的同一受试者的SE-CAD水平的増加提供诊断。在一个实施方式中，如果第二 SE-CAD样品水平高于上述任何一个參考水平，那么受试者发展早产的风险增加。在另ー个实施方式中，接触步骤包括在受试者的生物样品中，在用于SE-CAD的诊断试剂和样品中的SE-CAD核酸或蛋白之间形成直接或间接复合物。在又一个实施方式中，接触步骤进一歩包括在合适的測定方法中测量复合物水平。在一个实施方式中，如下面所述的实施例中所使用的，该测定方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)。參见，下面的实施例，其中用到了研发生物系统公司的人E-CAD单克隆抗体ELISA测定试剂盒。
在一个实施方式中，抗体特异性结合至750aa的SE-CAD序列的至少一部分，即该SE-CAD序列的片段或者表位。这样的片段或表位包括8-15氨基酸，最多可为25aa、50aa、75aa、lOOaa、150aa、200aa、300aa、400aa、500aa、600aa、700aa、750aa。例如，一种来自寿命生物科技公司(Lifespan Biosciences)的市售抗体结合到人SE-CAD的600_707aa之间的序列。选择能够在750aa SE-CAD序列中特异性结合750aa SE-CAD序列的合适表位的抗体属于本领域技木。在另ー个实施方式中，合适的測定方法选自由免疫组化测定法、对流免疫电泳、放射免疫測定法、放射免疫沉淀测定法、斑点杂交法、竞争抑制法和夹心法组成的组。在另ー个实施方式中，诊断试剂采用可检测标记物进行标记。在一个实施方式中，标记物是酶、荧光染料、发光或化学发光物质、或者放射性物质。在另ー个实施方式中，诊断试剂是特异于SE-CAD的抗体或其片段。在另ー个实施方式中，诊断试剂是与SE-CAD的cDNA或mRNA杂交的多核苷酸或基因组探针。这样的多核苷酸的长度可以约为25个或更多个核苷酸。在另一个实施方式中，诊断试剂是扩增并检测SE-CADmRNA多核苷酸序列的PCR引物探针组。在一个实施方式中，试剂固定于基质上。在另ー个实施方式中，诊断试剂包括微阵列、微流控卡、计算机可读芯片或腔室。在另ー个实施方式中，诊断试剂允许检测受试者生物样品中的 SE-CAD表达相对于參考表达谱的变化，该变化与PTB可能性有夫。在本发明的方法的又一个实施方式中，测量是由产生对PTB可能性的诊断有用的数值或图形数据的计算机处理器或计算机程序化的仪器执行的。在一个实施方式中，本发明的方法进ー步包括将样品SE-CAD水平与预定对照水平关联起来，以及进一歩地与上述受试者PTB临床指标的存在关联起来。在另ー个实施方式中，该方法进ー步包括将样品SE-CAD水平与预定对照的比较关系与早产史关联起来。在另ー个实施方式中，该方法在尚未发展早产临床症状的受试者中提供早产风险或可能性的定量评估。在另ー个实施方式中，本发明提供一种筛查怀孕妇女人群过早宫颈重构的方法，包括測量来自怀孕哺乳动物受试者的生物样品中生物标记物可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)的表达水平，其中SE-CAD表达水平相对于预定健康对照表达水平的升高是过早宫颈重构的指征。群体中的SE-CAD水平可基于多个变量而波动。例如，就如在下面的实施例中所描述，在一个实验中，CVF中的SE-CAD水平远低于其在母体血清中的水平，但在所有样品中都能被检测到。除了用于测量的单次測定中的变化，该测定用到的试剂的标准化也会产生所测量的SE-CAD水平的变化。因此，在本发明的一个实施方式中，即基于下面的实施例所用到的样品、测定和抗体，血清SE-CAD水平的范围在2-65pg/ml的浓度内且包括该数值。例如，按照下面实施例中用到的ELISA測定，未发展为PTB的对照患者母体血清中的SE-CAD平均水平为47. 4pg/ml，而发展为PTB的患者的平均血清SE-CAD浓度为58. 8±7. Ipg/ml (实施例4)。因此，在一个实施方式中，血清SE-CAD水平高于47. 4表明PTB可能性增加的诊断。在下面描述的ー个实施例中，母体尿液中的SE-CAD平均水平为大约21. 8pg/ml。因此，在一个实施方式中，尿液SE-CAD水平高于21. 8pg/ml表明PTB可能性増加的诊断。然而，如上所述，这些特定的数值并不意味着仅限于此，因为可从大范围的群体或在其它生理特点(如，PTB临床症状、体重等)不同的患者群体或其它类型的生物样品中得到其它平均值。
在本发明的方法的一个实施方式中，当使用ELISA时，特别是下面的实施例中的ELISA和试剂，当受试者的血清SE-CAD升高到超过40pg/ml时，可以得到PTB或PTB可能性增加的诊断结果。在另ー个实施方式中，当受试者的血清SE-CAD水平高于30pg/ml时,可以作出PTB的诊断。在又一个实施方式中，当受试者的血清SE-CAD水平等于或高于35pg/ml时，可以作出PTB的诊断。在又一个实施方式中，当受试者的血清SE-CAD水平等于或高于45pg/ml时，可以作出PTB的诊断。在本发明的诊断方法的又一个实施方式中，当受试者的血清SE-CAD水平等于或高于50pg/ml时,可以作出PTB的诊断,等等。在另ー个实施方式中，当受试者尿液样品中的SE-CAD水平高于21. 8+/-5pg/ml时，可以作出PTB的诊断。在另ー个实施方式中，当受试者尿液样品中的SE-CAD水平高于30pg/ml时，可以作出PTB的诊断。在另ー个实施方式中，当受试者尿液样品中的SE-CAD水平高于35pg/ml时,可以作出PTB的诊断。在另ー个实施方式中，当受试者尿液样品中的SE-CAD水平高于40pg/ml时，可以作出PTB的诊断。如上所述，用于生物样品中的SE-CAD测量的具体的诊断方法学包括使用常规
检测技术测量核糖核酸形式的SE-CAD (mRNA，即测量SE-CAD的转录)或蛋白质形式的SE-CAD (即测量蛋白质的翻译)。在一个实施方式中，分别通过聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验(ELISA)，在mRNA和蛋白质水平上测量尿液、宫颈阴道液或血液中的SE-CAD表达。可用于执行本文所描述的诊断方法的具体的方法学是常规的，且是本领域技术人员易于选择和调整的，其包括示例性的用于测定尿液、血液或宫颈阴道液样品中SE-CAD的ELISA。I.蛋白质的测定生物样品中SE-CAD蛋白质(或任何第二生物标记物)的测量可使用任何适合的SE-CAD配体，例如，抗体(或抗任何第二生物标记物的抗体)来检测蛋白质。此类抗体可以是本领域中目前已有的或目前在商业上使用的，例如作为研发生物系统公司的人E-CAD单克隆抗体ELISA检测试剂盒的一部分获得的那些抗体，或者可通过目前免疫学领域普通技术开发出抗体。如在本文中使用的，术语“抗体”是指具有两条轻链和两条重链的完整免疫球蛋白或它的任何片段。因此，单一分离的抗体或片段可以是多克隆抗体、高亲和カ的多克隆抗体、单克隆抗体、合成的抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者人抗体。术语“抗体片段”是指少于完整的抗体结构，包括但不限于，分离的单一抗体链、单链Fv结构物(construct)、Fab结构物、轻链可变区或互补决定区(CTR)序列，等等。具有SE-CAD抗体结合部分的重组分子，例如，带有ー个或多个结合SE-CAD的可变链CDR序列，也可以用于本发明的诊断測定。如在本文中使用的，术语“抗体”也可以指(在适当的情况下)结合SE-CAD的不同抗体或抗体片段的混合物。此类不同抗体相对于混合物中的其它抗体可以结合到SE-CAD蛋白的不同部分。用于测定中的抗体的这些差异可以反映于抗体可变区的CDR序列。这些差异也可以由抗体骨架产生，例如，如果抗体本身是包含人⑶R序列的非人抗体，或者是包含非人来源序列的其它重组抗体片段或嵌合抗体。在本发明的方法中有用的抗体或片段可以使用常规技术合成或重组产生，或者可以从血浆中分离或纯化，或者经进一歩处理以増加其结合亲和力。应该理解，任何结合SE-CAD或如上面定义的SE-CAD特定序列的抗体、抗体片段或它们的混合物都可用于本发明的方法中，无论抗体或抗体的混合物是如何产生的。类似的，可以根据所采用的測定形式，用能够提供可检测信号的试剂标示或标记抗体。此类标记物可単独使用或与其它组合物或化合物共同使用以提供可检测信号。在将超过ー种抗体用于诊断方法的情况下，例如，用于夹心法ELISA中，标记物应能够相互作用以提供可检测信号。最理想的，标记物是可视觉检测的，例如，通过比色检测。在測定中，多种酶系统发挥作用以呈现比色信号，例如，葡萄糖氧化酶(其使用葡萄糖作为底物)释放过氧化氢作为产物，当存在过氧化物酶和氢供体(例如四甲基联苯胺(TMB))的时候该产物产生看上去是蓝色的氧化TMB。其它的例子包括辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)，以及己糖激酶连同葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，其与ATP、葡萄糖和NAD+反应产生(除了其它产物)NADH，NADH可以通过在340nm波长处吸光度增加而被检测到。可用于本发明的方法中的其它标记系统可采用其它方法检测，例如，包埋了染料的着色乳胶微粒(Bangs实验室，印第安納州)可用于替换酶以在可应用的測定中提供视觉信号，该视觉信号提示所得SE-CAD-抗体复合物的存在。还有其它标签，包括荧光化合物、放射性化合物或元素。优选的，抗SE-CAD抗体与可检测荧光的荧光染料结合或缀合，所述荧光染料为例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、沉香磷化氢-0 (coriphosphine-O, CP0)或串联染料(tandem dyes)、PE_ 花青苷 _5 (PC5),以及 PE-得克萨斯红(EOT)。常用的荧光染料包括异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白 (APC)，还包括串联染料、PE-花青苷-5 (PC5)、PE-花青苷-7 (PC7)、PE_花青苷-5. 5、PE-得克萨斯红(E⑶)、罗丹明、PerCP、异硫氰酸荧光素(FITC)和爱カ沙(Alexa)染料。这些标记物的組合，例如得克萨斯红和罗丹明、FITC+PE、FITC+PECy5和PE+PEcy7 (除别的以外)，可根据测定方法而使用。用于连接在本发明诊断測定中有用的抗体的可检测标记物可以很容易的从诊断测定领域技术人员已知或容易获得的许多组分中选择。对本发明有用的SE-CAD抗体或片段并不因所使用的特定的可检测标记物或标记系统而受到限制。因此，用于本发明的具有任选标记物的适合SE-CAD抗体的选择和/或产生是本领域技术人员已知的、可由本发明书提供、包括于本文所引入的文件以及免疫学常规教导之中。同样，用于测量生物样品中的SE-CAD的特定检测形式可以从广泛的免疫測定方法中选择，例如酶联免疫试验，例如在下面的实施例中描述的，夹心法免疫測定、均相測定、免疫组化形式或其它常规測定形式。本领域技术人员可以从任意数量的常规免疫測定形式中容易地进行选择来执行本发明。用于生物样品中蛋白质检测的其它试剂，例如能够检测SE-CAD的合成化合物，模拟肽可以用于其它测定形式，以对生物样品中SE-CAD蛋白质进行定量检测，例如高压液相色谱(HPLC)、免疫组化等等。2.核酸测定形式还有在执行本文描述的诊断步骤中有用的本领域已知的其它方法。此类方法包括基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、基于蛋白质组学的方法或免疫组化技木。本领域已知的用于对样品中mRNA表达进行定量的最常用的方法包括RNA印迹法和原位杂交；RNA酶保护试验；以及基于PCR的方法，例如逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)或qPCR。或者,可采用能够识别特定的DNA-蛋白质双联体(duplexes)的抗体。本文所述的方法并不因所选择的执行它们的特定技术而受到限制。用于产生试剂或执行測定的示例性的商业产品包括TRI试剂(TRI-REAGENT)、恰根(Qiagen)RNeasy迷你柱、专业纯化(MASTERPURE)全长DNA和RNA纯化试剂盒(EPICENTRE ，麦迪逊市，威斯康星州)、蜡块RNA分离试剂盒(Ambion公司)和RNAStat-60 (Tel-Test公司)、基于MassARRAY的方法(Sequenom公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)、差异显示、扩增片段长度多态性(iAFLP)，以及使用市售LuminexlOOLabMAP系统和多色编码微球(Luminex公司，奥斯汀，得克萨斯州)的BeadArray 技术(Illumina公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)和高覆盖表达谱(HiCEP)分祈。C.实施例下面的实施例并不限制本文所述的实施方式的范围。本领域技术人员将意识到可对下面的实施例进行改动，这种改动被确定为落入本发明的精神和范围内。实施例I.由宫内感染造成的早产分娩导致宫颈组织中E-钙粘蛋白的表达降低在本实施例中，使用了宫内感染小鼠模型16_18，向其子宮角内注入脂多糖(革兰氏阴性菌细胞壁的组分，LPS)。母畜在8-20小时之间分娩，大部分在12小时分娩，无死亡。
宫内炎症与临床分娩开始之前发生的过早宫颈成熟有夫。16与对照相比，接触宫内LPS的母畜宫颈具有较少的胶原纤维、较低密度的基质以及増加的粘蛋白。16宫颈成熟似乎是炎症诱导的PTB的发病机理的初始事件。使用了上面描述的宫内感染的小鼠模型，从在2、4和6小时接触LPS或盐水的母畜收获宫颈组织。使用QPCR，证明接触宫颈炎症后的宫颈E-钙粘蛋白的mRNA表达在2或4小时的时候没有变化，但是，与接触盐水的母畜相比，接触LPS的母畜在6小时的时候其宫颈中的表达降低了 2. 7倍(P =< 0. 05)。实施例2.足月分娩也与E-钙粘蛋白mRNA表达下降有夫，因为宫颈重构中的该途径被假设为所有分娩所共同采用QPCR，在非怀孕宫颈、定时怀孕小鼠的跨妊娠期以及产后測量E-钙粘蛋白mRNA表达。对于这株小鼠，分娩发生于可预测的时程为E19。“E#”是指用于确定小鼠妊娠期的胚胎日期，其中妊娠的开始24小时记为E0。因此，早于E19的12小时(E18. 5)代表恰好早于足月分娩的时间。E-钙粘蛋白mRNA水平在组之间明显不同(P = 0.001，单因素方差分析)。与非怀孕水平比较，E-钙粘蛋白mRNA水平在E15増加(早产；妊娠中期)(P =0. 007，SNK)。E-钙粘蛋白mRNA水平在E18. 5时相比E15时下降了 4. 3倍(P =< 0. 001，SNK)，这支持了足月分娩同样发生E-钙粘蛋白的表达。实施例3.在炎症诱导的早产小鼠模型的分娩前，母体血清中的SE-钙粘蛋白(SE-CAD)增加使用实施例I的小鼠模型，在宫内注入LPS或生理盐水后2、4和6小时，测定了母体血清中的SE-CAD。使用市售ELISA (研发生物系统公司的人E-CAD单克隆抗体ELISA试剂盒)测定了 SE-CAD。正如图I所指出的，在接触LPS和盐水的母畜之间，SE-CAD水平明显不同(P =< 0. 001，单因素方差分析)。SE-CAD水平在6小时内持续上升(在该模型临床分娩开始之前)。这些数据支持了血清SE-CAD是E-钙粘蛋白分解的标记物，特别是在宫颈部位，由此可以系统地检测宫颈重构。实施例4.用人母体血清中SE-CAD水平预测早产检查了母体人血清中的SE-CAD水平，评估了 SE-CAD准确预测PTB的能力，以确定SE-CAD水平是否能被全身检测，以及能否作为宫颈重构的生物标记物。使用了出现早产临产(PTL)的妇女的前瞻性群组(prospective cohort) (n = 110)。在22-34孕周之间的单胎妊娠符合条件。在出现PTL时采集母体血清。收集了分娩时的胎龄以及母体和新生儿结局。使用与实施例3中用到的相同的市售ELISA (研发生物系统公司)评估这些血清样品中的SE-CAD水平。执行了未调整的分析和多变量逻辑回归。对于该群组，50%在<37周时分娩。发生PTB的妇女的母体血清SE-CAD水平的平均水平(58.8+/-7. I)相比那些未发生PTB的妇女(47. 4+/-190. 6)显著升高(P < 0. 0001)。控制既往的PTB、产位的宫颈检查(cervical exam at presentation)和种族，确定了对于姆10单位的SE-CAD, PTB几率增加202% (Cl I. 3-3. I)。在ROC分析中，对于单独SE-CAD的AUC(曲线下面积)为.73，当考虑其它协变量时没有变化。SE-CAD高于或等于平均值(46. 1+/-12. 7)的妇女发生PTB的几率比那些低于(2. 2-14. 5,P = 0. 0002)上述值的妇女增加5. 7。在该水平，PTB的阳性预测值(PPV)为76%，阴性预测值(NPV)为70%。当研究在< 30周时出现PTL的妇女时，SE-CAD水平甚至更有辨别力，可以预测那些妇女最終在< 34周分娩(參见图2)。这些数据证明SE-CAD似乎在预测PTB中能够单独发挥很好的作用。这些结果表明SE-CAD代表了较种族甚至既往孕产史而言更紧密地与PTB发病机理相联系的生物过程。目前用于预测PTB的策略(例如FFN或宫颈长度)存在问题，因为它们的阳性预测值低或/和敏感性差。这与SE-CAD形成对比，SE-CAD在初步数据中具有76%的PPV，同时仍然给出了 70%的NPV。实施例5. SE-CAD水平在不同的生物流体中是可检测的，并且可用于在临床PTL或PTB发生以前预测PTB风险。为了确定来自妊漏早期(16-20周)的SE-CAD水平是否可检测并且是否在无症状妇女中与PTB有夫，评估了在另ー个低风险妇女的前瞻性群组中采集于16-20周的宫颈阴道液(CVF ；n = 59)中的SE-CAD水平。ELISA结果证明了 SE-CAD在CVF中的水平远低于其在母体血清中的水平，但在所有样品中都能被检测到。在CVF中，在SE-CAD水平和细菌性阴道病(BV)之间有显著的相互作用(P = 0.04)。BV通过Nugent标准进行诊断。在无BV妇女中，SE-CAD水平增加与PTB几率增加3. 2倍相关联。作为研究的一部分，除了測量CVF中的SE-CAD，还测量了来自ー个低风险妇女的前瞻性群组的尿液样品中的SE-CAD，以评估先兆子痫的生物标记物。后续研究排除了< 35周分娩的妇女。因此，仅获得晚期PTB (35-360/6周)的结局与SE-CAD相关联。尿液于16-20周收集自患者。使用上面确定的ELISA測量SE-CAD水平，在第2个妊娠三月期在母体尿液中可检测到SE-CAD。基于平均样品值，尿液SE-CAD水平在CVF和血清测量水平之间。注定会早产的妇女(n = 20)的平均尿液SE-CAD水平为31. 5+/_6，而最终足月分娩的妇女(n= 19)的平均尿液SE-CAD水平为21. 8+/-5。这些差异没有统计学显著性，但是这被认为是由于有限的样本量所造成的。PTB发生于> 34周的被研究受试者的PTB结局的“表型”的严重性低于上面报告的两个实验。实施例6.发生先兆子痫的妇女的SE-CAD水平在上文提到的研究中，发生先兆子痫的妇女的SE-CAD水平与对照没有差异。正如图3中的结果所示，足月分娩的妇女的SE-CAD水平与出现早产临产但未发生早产的组大致相同。对照(第一柱)为足月分娩妇女一其中ー些在分娩中。这与发生先兆子痫的妇女形成对照——无人在分娩中——其实际上具有较低的SE-CAD水平。这进ー步给出了SE-CAD来自宫颈并与临产有关的可信度。发生早产临产的妇女与那些足月分娩的妇女具有相同水平的事实可能预示出现早产临产的妇女的一定水平的宫颈变化，即使其最終没有发生早产。并且，在未出现症状的妇女孕期早期得到的基线水平可以低于本研究的分割点，例如，约40pg/ml。如果这样的话，那么早产妇女的较高SE-CAD水平有可能是更高预测值。这些数据进一歩表明，SE-CAD水平増加表示宫颈重构，并且是新的早产预测指标。实施例7大規模人体研究由孕妇组成的前瞻性群组參与到大規模研究中。孕妇在怀孕期间在三个时间点被评估16-20周、20-24周、以及24-28周。在所有的三个数据采集时间点，以下是被收集的，除非另有说明母体DNA在登记时采用奥拉基因(Oragene)收集管进行收集(只在第一次就诊时收集)；通过经阴道超声和数字宫颈检查评估宫颈长度。收集母体血清和宫颈阴道液(CVF)用于生物标记物分析以及评估是否存在细菌性阴道病。收集母体尿液用于筛查细菌性阴道病。
入选标准是在首次产前检查时在< 20周时筛查的单胎妊娠、且同意參与这项研究的孕妇。包括具有任何既往孕产史的妇女。为具有既往早产的妇女提供根据临床护理标准的17-a己酸羟孕酮(170HPC)。无论使用170HPC与否，这些具有既往PTB的妇女都被包括在内。170HPC的使用(包括注射数目)被记录下来。排除标准多胎妊娠妇女，有显著终末器官损伤的慢性内科疾病的妇女(例如，有肾脏疾病的慢性高血压；移植患者；有重大成人先天性心脏病的妇女)，孕前糖尿病D级或更高的妇女，目前使用免疫抑制治疗的妇女，或晚于20周登记接受产前护理的妇女没有资格參与这项研究。登记办法对于< 20周的孕妇在一次例行产科检查时上前询问是否登记。同意參与研究的妇女进行一次“研究检查(research visit) ”，要么安排在同一次检查时(如果为16-20周)，要么安排在她们下次产前检查的同一时间。第一次数据收集在16-20周进行。在20-24和24-28周之间对妇女再次进行评价。如果可行，该研究检查与她们的定期产前保健检查相一致。为每位患者记录检查的间隔时间。临床规则数据/生物样品的收集在专用研究室进行。超声、检查和样品收集由研究协调员(研究护士)执行，他们在用于样品收集的适当方法以及通过经阴道超声评估宫颈长度的方面受过训练。病例报告表(CRF)包括下面列出的所有变量以及在所有时间点的数据收集结果(如，SE-CAD水平、是否存在BV、宫颈长度，等)。I.经阴道超声測定宫颈长度。宫颈长度(CL)是在三个视图中成像的，记录了最短长度。由于有关超声波图像短宫颈的“治疗”选择的数据是不清楚的，因此该研究的结果不向护理医师透露，除非得到“临界值”。根据最近的研究，临界值被认为是15_或者更短的CL8。所发现的预期发病率约为I. 5% 8 ;因此，我们可能会在大约51个患者中发现短宫颈。目前，我们机构的护理标准是我们不例行筛查CL。然而，当偶然发现短宫颈(15mm或<)吋，患者从母婴医学服务得到有关环扎术、促孕剂的使用或者无干预的建议。该建议的发生独立于研究，并且不由研究的PI提供。这些患者不排除在后续的研究之外。在该群组中测量CL的目的不是研究其与PTB的主要联系，因为这在大型试验中是有据可查的。事实上，虽然通过超声波图像检测的短宫颈是PTB的强风险因子，“极短宫颈”的患病率低和敏感性差限制了将超声波图像检测短宫颈的使用作为在所有妇女中的PTB的可靠筛查工具8’9。在本研究中測量CL的目的是为了评估SE-CAD与CL的相互作用，假设它们都代表了有夫‘宫颈重构’的不同路径。当表现出更高的SE-CAD水平，较低的“临界值”但是仍然为缩短的CL(例如15-25mm)预期与PTB具有更强的相互作用，提示更活跃的宫颈重构。CL图像由研究护士记录和打印。研究护士由经过委员会认证的围产学家且精通经阴道超声的PI训练。每个护士都被要求对10个患者执行宫颈的TV超声成像，得到宫颈的3幅图像。那些患者留在研究中，但排出在任何宫颈长度分析之外。2.宫颈长度和扩张的数字化检查。子宮内ロ的宫颈扩张被记录并向上舍入到最接近的整数(记录为0，1，2，等)。考虑到宫颈消失和软化中的变异性和主观性，这些没有被记录。宫颈检查被测量以确定扩张和SE-CAD水平的相关性，从而观察临床參数是否等同于
宫颈重构的生物标记物。宫颈扩张被用在我们的统计建模中以建立一个预测模型。3.细菌性阴道病(BV):在每个数据采集时间点使用纽金特标准(Nugent' scriteria)25筛查患者以确定是否有BV的存在。BV的存在已经与PTB和胎膜早破相关联，特别是在高风险患者中。然而，BV本身并不足以作为PTB的风险分层标记物。初步数据表明BV的存在(即使在低风险群体中)，改变了 CVF中的SE-CAD与PTB的相关性，还改变了克劳丁(claudin) SNP与PTB的相关性。初歩研究表明BV实际上是PTB的强有力的环境改变者。在这项研究中，在3个数据采集时间点对登记的患者进行BV筛查；使用纽金特开发的标准作为BV整体诊断的金标准25。获得供方收集的阴道拭子，在玻片上展开拭子材料(贴上独特的条形码贴纸)，空气干燥，送到微生物学实验室进行革兰氏染色。阴道涂片被评估(根据纽金特标准)以确定以下形态类型乳酸杆菌(Lactobacillus sp.):直革兰氏阳性杆菌；加德纳类杆菌或拟杆菌(Gardnerella或Bacteroides sp.):小的革兰氏-不定杆菌或小的革兰氏阴性杆菌；动弯杆菌(Mobiluncus sp.):弯曲的革兰氏阴性杆菌。姆个上述形态类型根据每油浸视野的平均数目分别定量。如果总分是>7，革兰氏染色符合BV。每个样品(在每个时间点)的分数被记录，并与所有其它变量一起进入access数据库。4.宫颈阴道液(CVF):两个拭子被放置在宫颈阴道穹窿中，然后放置在PBS中并立即放置在液氮中以进行今后的评价。根据该计划的共同研究者所建立的规则收集样品26。执行样品的收集以进行SE-CAD的评估和今后的蛋白质研究(例如ELISA)。5.尿液样品离心尿液样品以去除任何细胞碎片，然后立即放置在液氮中。这些样品被用于评估SE-CAD水平。6.母体血清抽取母体血液；将收集的血清立即放置在液氮中。这些样品被用于评估 SE-CAD。7.母体DNA :在第一个数据收集时间点，使用奥拉基因(Oragene)收集母体DNA。8.生物样品的处理母体血液、尿液和CVF样品被处理，然后血清被等量分装至5个预标记试管(去标识)，放置在液氮容器中，然后送往实验室。针对SE-CAD的ELISA是市售的(研发生物系统公司)。我们已在我们实验室用所有推荐的生物样品确认了这些ELISA有效。针对各种母体免疫生物标记物的ELISAS也是市售的，已在发明人的实验室中被确认有效并进行了报道，其描述纳入本文作为參考19。使用奥拉基因(Oragene)系统从母体唾液中收集母体DNA。在奥拉基因(Oragene)试剂盒中稳定化的唾液样品提供了基因组DNA的耐用源，其可在环境或冷藏条件下存储和运输；样品根据制造商的说明书进行收集。进行DNA检测。姆个奥拉基因(Oragene)唾液样品的一个等份被用于在Chemagen (坎马金)系统上进行自动DNA提取，通常产生超过100微克的基因组DNA。未使用的DNA样品采用条形码标示归档于_80°C，并在冰箱DB数据库中进行样品跟踪。9.待收集的临床和其它变量-母体人口统计学民族、种族、年龄；首次产前检查时和每个数据收集时间点时的BMI ;吸烟史、教育水平-当前孕产史在本次怀孕期间的STD的存在；本次怀孕中的HSV;本次怀孕的子宫颈抹片检查；在本次怀孕期间促孕剂的使用、早产临产的任何发作、安胎药的使用、针对胎儿适应症的倍他米松给药、任何产科并发症的存在(包括胎盘早剥、绒毛膜羊膜炎、先兆子痫和/或胎儿死亡)。-既往病史和手术史GYN病史STD史、HSV史、纤维瘤史、子宮颈抹片检查异常史；HPV ;社会历史，包括烟草、酒精和非法药物使用 -既往孕产史既往怀孕次数、足月分娩次数、早产次数、早产孕龄、出生体重、任何怀孕中170HPC的使用、先兆子痫史、自发性流产次数、在第二个三月怀孕期发生自发性流产的次数；胎儿死亡史-分娩信息分娩方式、诱导剂(inductionagent)的使用、分娩中抗生素的使用、分娩中的发烧以及诱导原因-新生儿信息出生体重、入住NI⑶、在生命的第7或第30天的不良新生儿结局的存在(IVH、NEC等)。使用已建立的方法对这些变量进行数据抽象以从这些图表中获得最
高质量数据27’28。-在登记时执行有关抑郁症状的ー个简短调查问卷(爱丁堡产后抑郁量表，Eros)。该手段是用于在怀孕期间评估抑郁症状的有效措施29_32。最近的研究表明由ー个类似的手段评估的在怀孕早期的抑郁是PTB的ー个独立风险因子；5然而，这项研究只有5%非洲裔美国人患者，这样可能没有与具有最高PTB风险的妇女群体关联起来。在我们目前的对具有早产临产的妇女的前瞻性试验中，已经在95%的登记的妇女中完成EPDS。在此处的推荐中使用该手段将提供对PTB具有独立风险但也可为遗传风险的强有力的环境调节剂的另一种环境标记物。-有关卫生系统不信任和受歧视经历(EOD)的调查问卷在第一个数据收集时间点时自填33。有越来越多的文献表明有受歧视感会导致生物学压カ，这种压力即使不是PTB的原因，也与其相夫2’3’4’34。这些有效问卷被用于早产临产患者的目前的前瞻性试验。迄今为止，登记的妇女中99%已完成问卷调查。该有效手段被用于评估种族歧视感，且被认为反映了ー种环境压力水平33。对于E0D，以如前所述的经历歧视的平均分和计数的方式进行分祈。3310.样本大小假设整个群组中PTB的发病率被假设为约9%为<35孕周，12%为<37孕周。该发病率基于以我们中心和发表的数据为基础的最近的多中心随机对照试验。35基于先前的和当前的前瞻性群组，针对这些研究类型的登记大于70%。然而，基于重复检查的需要，估计登记为45%。大约75% -80%的在当前的和最近的前瞻性试验中登记的妇女为非洲裔美国人。基于先前的前瞻性研究，新的产科检查中未经产的妇女的百分比为36%。类型1，假设0. 05的a误差；精度为+/-8. 5 ;5%的后续损失。假设流产率为10% (可能为高估，因为登记在第一次检查后进行，该第一次检查例行建立产前护理和确认胎儿生存能力)。假设由于医学并发症损失15% (基于排除标准)。有了这些假设，大约3391名患者被登记。基于
<37周的PTB的发病率为12%，这将提供407个案例或者在< 37周分娩的患者。11.描述性统计在这项研究中，PTB案例和非早产案例(定义为那些> 37周分娩的)通过入院时的胎龄、母体年龄、种族、孕产史以及作为潜在风险因子的其它变量进行表征。通过频率和比例总结分类变量，通过平均值、中值、标准差和范围总结连续变量。PTB案例和非早产案例通过基于胎龄的PTB表型进行全面描述。基于先前的工作，估计< 35周的PTB约为7%，
<32周的约为5%，< 28周的约为2°ん这些发病率被评价时分别有0. 9、0. 8和0. 5%的误差。另外，以足够的检定カ在后续的ニ变量分析中检测其它表型中小于2. 0的比值比，和稀有表型(< 28周)中至少2. 2的比值比。 候选风险因子的ニ变量分析在研究中，各液体空间(fluid compartment)中的SE-CAD和其它PTD的风险因子将首先作为研究中结局的独立风险因子进行分析。単独分析SE-CAD收集的三个时间点中的每个时间点。离散变量的分布通过比例进行表征，并通过卡方或确切法进行适当比较。计算相对风险和95%置信区间，作为二分法风险因子。针对连续变量，使用学生的t检验(对于大致正态分布的数据)或曼惠特尼U检验(对于顺序的或非正态分布的变量)来比较PTB案例和非早产案例。执行分层分析以初步评估混杂和相互作用。对非经产和经产妇女的比值比特别感兴趣。虽然计划对非经产妇女进行单独的分析，如果产次明显混杂，那么对经产妇女也开展单独的分析，并且不进行联合分析。试验特征的评估这项研究的目的之一是评估对于在孕妇群组中预测PTB的SE-CAD试验特性。在该评估中，我们首先把SE-CAD看作一个连续测量值。PTB结局和SE-CAD之间的关联的平滑曲线通过使用广义可加模型方法生成，以帮助评估线性和选择界限。我们还将使用ROC方法评估潜在界限。为了做到这一点，使用不同的分割点将新的生物标记物分为“阳性的”或“阴性的”;构建ー个2X2表，为每个分割点如下定义试验特性我们还在我们预期的试验特性左右构建了 95%置信区间。參见下文关于简化的段落。我们专注于敏感性，其作为感兴趣的主要结局。多变量预测模型逻辑回归也将被用于开发PTB预测模型，这将作为临床预测指标的基础。在考虑纵向模型之前(參见下文)，三个时间段的每ー个都被作为单独的模型进行分析。比较三个模型的预测能力，以确定是否ー个时限对预测最有用。对于初始模型，我们将纳入已在ニ变量分析中显示至少与PTB临界关联的所有风险因子(p < 0. 20)。然后使用后向消除策略从模型中去除项，去除那些删除后不引起ROC面积显著下降的因素，參见下文标题为“使用ROC分析进行模型的比较”的部分。对于每个考虑的模型，使用回归系数实际值得出每个人的分数。目标是利用提高模型辨别カ的所有变量。不同于目标是确定哪些潜在风险因子独立关联于PTB的解释模型，开发预测模型是为了确定能够最好地预测结局的变量最佳组合。特别关注作为SE-CAD或者其它风险因子效果调节剂的变量。我们已经先验地确定了与SE-CAD的4种相互作用为我们二次分析的感兴趣的对象=SE-CAD和BV、宫颈长度、种族和物理宫颈扩张。使用逻辑回归以测试SE-CAD与这些变量中的每ー个的显著相互作用。在适当的情况下，可以基于相互作用结果生成単独的预测模型以便于临床使用，例如，关于种族的模型。虽然包括所有潜在预测变量和相互作用是重要的，但是也存在仅基于本研究中的多重比较来包括变量的可能性(即偶然地)。包括在模型中的变量和相互作用对于PTB必须是生物学上可接受的(plausible)。也就是说，统计推断必须符合常识；不符合医学知识或推理的结论很可能是错误的，应持怀疑态度看待。当然，納入模型的变量已经经过选择，因为它们已在先前的研究中被假设为风险因子，或者为重复剖腹产的可能的风险因子。然而，作为尽可能减少变量选择中I型错误的初步尝试，对具有納入模型的潜在资格的变量数目做限制，从而使得每个候选变量至少有10例PTB (在使用ニ变量分析筛选后)。使用ROC分析进行模型的比较对来源于SE-CAD和使用逻辑回归开发的风险因子的决策规则进行诊断测试评价。对于每个“决策规则”，预测功能的敏感性被定义为具有一个事件(在本研究中，为PTB)并被该规则正确预测具有该事件的受试者的比例。特异性被定义为不发展终点并具有阴性测试的比例。从每个模型可定义多个测试分割点。这些分割点中的每个都与基于实际结局的真阳性率(TPR)和假阳性率(FPR)相关。接受者-操作员特征(Receiver-Operator Characteristic,R0C)曲线，其中绘制各个分割点的TPR和FPR,被用于以图形方式描述各个分割点与模型和生物标记物的相关试验特性之间的关系。这些ROC分析与有关真阳性、真阴性、假阳性和假阴性的相对利益和负担的假设或测量值一起使用。我们将使用HL统计(Homer-Lemeshow statistic)和通过计算模型准确性来评价校准(即预测概率和观察到的剖腹产概率之间的一致性)。ROC曲线下面积衡量模型辨别那些发生或不发生PTB结局的能力。ROC被用于评价和比较不同的模型和测试的辨别力。具体而言，给定ー对随机选择的个体，其中一个发生PTB而另ー个未发生，ROC面积衡量PTB案例被赋予比对照更高的风险分数的可能性。我们具体计划比较针对如下生成的ROC曲线
(I)完整的临床预测指标；⑵排除SE-CAD的临床预测指标；(3)排除宫颈长度的临床预测指标和(4)単独的SE-CAD。我们相信这些比较是必要的，并且将产生极大的洞察力以确定哪个变量或者变量组合，导致最大的辨别カ。在这种情况下，我们需要利用特殊的方法来解释ROC曲线之间的相关性。使用C-指数来完成模型之间的分析比较。该方法对每个受试者的所有不一致结局对进行检查，采用计分系统衡量基于预后模型的值的结局。由此产生的统计是分数和不一致结局数之间比率。对该比率的标准误差的估计已由Hanley和McNeil提出，可用于计算Z-统计以测试源于相同研究受试者的两个C-指数的等价性。简化为了有用，临床规则必须是易于实施的。为了确保容易理解和不受阻碍地应用，使用两种方法简化包括预测分数的变量和參数(I)通过使用四舍五入到最接近的整数的系数值重新计算预测分数，以及(2)通过由模型鉴别的二分法“风险因子”的总和简单计算分数。(对于该方法，将连续预测因子记作二分法变量是必要的。)这导致尽可能简单的模型。将新规则的性能与更完整的模型进行比较。预测规则的内部验证采用“自展”方法对预测规则进行内部验证。通过这种方法，大量的样品被取自原始数据(包括替换)，对这些样品中的每ー个计算预测准确性(正确百分比和C-指数)。替换取样本质上产生了ー个组，其与样品的组成相同。这种方法提供了对预测规则的实验特性的相对无偏估计，然而，需要采用额外的前瞻性收集的数据进一歩验证，因为这是评价有希望的标记物的金标准。这项工作的最終目的是制定最有效的且在临床上有用的模型。纵向模型由于SE-CAD收集于3个时间点(16-20、20-24、24-28周)，我们还利用了用于纵向数据的方法。这使我们在解释同一个妇女的測量值之间的内在关系时能够使用一个受试者的所有可用数据。另外，合并的信息可以让我们随着时间的推移看到在单个时间点不明显的模式，这可能有助于预測。通过用于PTB的逻辑模型，广义估计方程(GEE)方法学被用于评价随着时间的推移的变化36。另外，当从SE-CAD收集中检查至分娩的日期的次要结局时，使用了线性混合效应模型，其中包括了因受试者和/或时间而产生的随机效应，以在对各受试者的重复观察结果之间建立关联37。实施例8.新的免疫生物标记物在预测PTB中的分析 生物标记物在早产(PTB)中的使用集中在炎症途径。考虑了许多自发早产案例中假设的发病机理，对该重点进行了验证。到目前为止，集中于细胞因子，其被证明用于PTB预测的临床希望很小。发明人研究了在高风险妇女群组中免疫途径中的新生物标记物是否与PTB相关。使用了具有早产临产的妇女的群组(N= 110)。22-33周之间的单胎妊娠妇女有资格。母体血清在登记时获得。获得分娩时的胎龄和有关母体信息。可溶形式的早期白细胞活化和细胞粘附分子通过珠分析法进行评估(SE-选择素；sP-选择素；sICAM ；sVCAM)。通过标准ELISA评估先天免疫标记物(LPS的LAL-存在；sOT14，以及正五聚体蛋白)。使用 T-检验或曼惠特尼秩和在发生PTB和未发生PTB的妇女之间比较每种分析物的平均水平。使用了整个组群中每个生物标记物(低/高)的中值水平处的分割点，通过卡方分析法分析分割点与结局之间的关联。LAL、s⑶14、正五聚体蛋白、SE-选择素、sP-选择素、sICAM或sVCAM水平在那些发生早产或足月分娩的妇女之间没有显著差异(图4)。这些生物标记物中没有一个与临床的或组织学的绒毛膜羊膜炎或不良新生儿结局有夫。与对母体血清中细胞因子的评估类似，这些先天免疫中的免疫学生物标记物、早期白细胞活化和可溶性细胞粘附分子似乎无法准确预测哪些妇女将早产。然而，对于PTB，免疫途径的激活可以限于子宮，因此母亲中这些途径的全身性标记物可能被证明临床应用受限。这些数据表明，不同于SE-CAD，这些炎症生物标记物不能准确预测早产。每个和所有的专利、专利申请和出版物，包括本文引用的网站以及美国临时专利申请No. 61/256，066，在本文中特此全部引入作为參考。虽然本发明參考具体实施方式
进行了公开，但在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，本发明的其它实施方式和改变对于本领域技术人员而言是显而易见的。所附权利要求包括了这样的实施方式和等价变化。出版物I. WOOD NS 等.The EPICure study !associations and antecedents ofneurological and developmental disability at 30 months of age followingextremely preterm birth (EPICure研究极端早产后30个月龄的神经学和发育疾病的关联性和前因性).Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2005 ；90 :F134_40.2.RICH-EDWARDS J 等.Maternal experiences of racism and violence aspredictors of preterm birth !rationale and study design (作为早产预期因子的种族歧视和受暴力母体经历原理及研究设计).Paediatr Perinat Epidemiol 2001;15增刊2 :124-35.3. DOMINGUEZ TP. Race, racism, and racial disparities in adverse birthoutcomes(民族、种族和种族差异对出生结果的不良影响).Clin Obstet Gynecol2008 ；51 360-70.4. GISCOMBE CL, LOBEL M. Explaining disproportionately high rates ofadverse birth outcomes among African Americans the impact of stress，racism，andrelated factors in pregnancy (对非洲裔美国人中存在的不成比高比例不良出生结果的解释压力、种族主义和怀孕相关因素的影响).Psychol Bull 2005;131:662-83.5. LI D ^ . Presence of depressive symptoms during early pregnancy andthe risk of preterm delivery a prospective cohort study(早孕期间抑郁症状的存在与早产风险前瞻性群组研究).Hum Reprod 2009 ；24 :146-53.6.G0LDENBERG RL 等 The Preterm Prediction Study !sequential cervic allength and ieta_L fibronectin testing for the prediction oi spontaneouspreterm birth(早产预期研究用于预测自发性早产的相继宫颈长度和胎儿纤连蛋白测试).National Institute of Child Health and Human Development Maternal-FetalMedicine Units Network(国立儿童健康和人类发育母婴医疗单位网站).Am J ObstetGynecol2000 ；182 :636-43.7. IAMS JD 等.The length of the cervix and the risk of spontaneouspremature delivery (宫颈长度与自发性早产风险) National Institute of ChildHealth and Human Development Maternal Fetal Medicine Unit Network (国立儿里健康和人类发育母婴医疗单位网站).N Engl J Med 1996 ；334 :567-72.8. FONSECA EB等 Progesterone ana the risk of preterm birth among womenwith a short cervix (短宫颈女性中早产风险和黄体酮).N Engl J Med 2007 ；357 462-9.9. IAMS JD 等 The preterm prediction study :can 丄ow-risk women destinedfor spontaneous preterm birth be identified (早产预测研究能否鉴别注定会发生自发性早产的低风险女性 )Am J Obstet Gynecol 2001 ;184 :652-5.10. MEIS PJ 等.Tne preterm prediction stuay-significance of vagina丄infections (早产预期研究阴道感染的重要性).National Institute of Child Healthand Human Development Maternal-Fetal Medicine Units Network(国立儿童健康和人类发育母婴医疗单位网站).Am J Obstet Gynecol 1995 ；173 :1231-5.11. T0L0 SA JE 等.The International Infections in Pregnancy (IIP)study variations in the prevalence of bacterial vaginosis ana distribution oimorphotypes in vaginal smears among pregnant women(国际孕中感染石开咒怀孕妇女细菌性阴道病发病率和阴道图片态模标本分布中的变化).Am J Obstet Gynecol 2006 ；195 1198-204.12. NELSON DB 等.Self-collected versus provider-collected vaginalswabs ior the diagnosis oi bacterial vaginosis an assessment oi validity andreliability (用于细菌性阴道炎诊断的自釆集与供体釆集阴道拭子的比较有效性和可信度评估).JClin Epidemiol 2003 ；56 :862-6.13. CAREY JC 等 Metronidazole to prevent preterm delivery in pregnantwomen with asymptomatic bacterial vaginosis (用甲硝唑预防患有无症状细菌性阴道病的怀孕妇女早产) National Institute of Child Health and Human DevelopmentNetwork of Maternal-Fetal Medicine Units (国立儿童健康和人类发育母婴医疗单位网站).N Engl J Med 2000 ；342 :534-40.14. GONZALEZ JM 等 Preterm and Term Cervical Ripening in CDl Mice(Musmusculus) Similar or Divergent Molecular Mechanisms (CDl 小鼠的早产和足月生产宫颈成熟分子机制类似还是不同？)Biol Reprod 2009.15. XU H%. Preventing cervical ripening the primary mechanism by whichprogestational agents prevent preterm birth (预防宫颈成熟促孕剂预防早产的主要机制？ )Am J Obstet Gynecol 2008 ；198 :314 el-8.
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权利要求
1.一种诊断早产(PTB)或预测早产(PTB)发生可能性的方法，包括测量来自怀孕哺乳动物受试者的生物样品中生物标记物可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)的表达水平，其中高于预定对照表达水平的升高的SE-CAD表达水平表明诊断为早产风险增加。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述预定对照是来自选自下组的成员的生物样品中的SE-CAD水平 (a)与所述受试者处于相同怀孕时期的健康怀孕哺乳动物对象； (b)未发展为早产的健康怀孕哺乳动物对象； (C)多个对象(a)或(b)的群体；以及 (d)处于更早怀孕时期的同一受试者。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述水平是中间值或平均值、数值平均值或数值平均值范围、数值模式、图形模式或表达谱。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述生物样品选自下组血清、尿液和宫颈阴道液。
5.如权利要求I所述的方法，其中所述测量步骤包括测量作为核酸或蛋白质的SE-CAD的表达。
6.如权利要求I所述的方法,进一步包括测量所述样品中PTB的至少一种额外生物标记物的表达水平，其中SE-CAD和所述额外生物标记物的表达相应于预定对照中它们各自表达水平的组合变化提示诊断为PTB风险增加。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述额外的PTB生物标记物是母体血清中的胎儿纤连蛋白。
8.如权利要求I所述的方法，其中提供所述生物样品的所述哺乳动物受试者具有选自下组的临床症状细菌性阴道病、升高的FFN、短宫颈长度、压力、抑郁、炎症。
9.如权利要求I所述的方法，其中所述受试者的生物样品取自16孕周或之后。
10.如权利要求I所述的方法，进一步包括在所述受试者怀孕期间多次重复SE-CAD水平的所述测量。
11.如权利要求I所述的方法，进一步包括测量在怀孕期间不同时间采集的一系列受试者样品中的SE-CAD水平，并确定整个孕期SE-CAD表达增加的模式。
12.如权利要求I所述的方法，其中所述受试者正在接受针对PTB风险增加的治疗，其中该方法能够确定所述治疗的效果。
13.如权利要求I所述的方法，进一步包括将来自受试者的生物样品与诊断试剂接触，所述诊断试剂测量所述样品中可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)核酸或蛋白质的第一水平。
14.如权利要求2所述的方法，进一步包括在怀孕期间的第二稍后时间接触来自所述受试者的第二生物样品，并测量SE-CAD第二水平；基于所述第二水平较来自选自下组的成员的第一生物样品中的SE-CAD水平的升高，提供早产风险增加的诊断 (i)处于与第二样品采自受试者时的相同怀孕时期的健康怀孕哺乳动物对象； (ii)未发展为早产的健康怀孕哺乳动物对象； (iii)多个对象(a)或(b)的群体；以及 (iv)处于更早怀孕时期的同一受试者。
15.如权利要求14所述的方法，其中如果第二SE-CAD样品水平高于(i)至(iv)中任何一个的水平，那么所述受试者发展早产的风险增加。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述接触包括在所述生物样品中在SE-CAD诊断试剂和样品中的SE-CAD核酸或蛋白质之间形成直接或间接复合物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述接触进一步包括在合适的测定方法中测定所述复合物的水平。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述诊断试剂采用可检测标记物进行标记。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述标记物是酶、荧光染料、发光或化学发光物质、或者放射性物质。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述诊断试剂是对于SE-CAD具有特异性的抗体或其片段。
21.如权利要求13所述的方法，其中所述诊断试剂选自下组(a)与SE-CAD的cDNA或mRNA杂交的多核苷酸或基因组探针；(b)扩增并检测SE-CAD mRNA多核苷酸序列的PCR引物探针组。
22.如权利要求13所述的方法，其中所述试剂固定于基质上。
23.如权利要求13所述的方法，其中所述诊断试剂包括微阵列、微流控卡、计算机可读芯片或腔室。
24.如权利要求13所述的方法，其中所述诊断试剂能够检测所述受试者生物样品中的SE-CAD表达相对于参考表达谱的变化，所述变化与PTB可能性有关。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述测量是由产生对PTB可能性的诊断有用的数值或图形数据的计算机处理器或计算机程序化的仪器执行的。
26.如权利要求I所述的方法，进一步包括将样品SE-CAD水平与预定对照水平之间的关系与受试者中选自下组的早产临产的临床症状表现或症状历史表现关联起来FFN、既往PTB、短宫颈长度、细菌性阴道病、母体/宫内感染或炎症、吸烟、性传播疾病非洲裔美国人种族、社会经济地位低、压力以及抑郁。
27.如权利要求I所述的方法，进一步包括将样品SE-CAD水平与预定对照之间的比较关系与具有早产史的关联起来。
28.如权利要求I所述的方法，所述方法在尚未发展早产临产临床症状的受试者中提供早产风险或可能性的定量评估。
29.—种筛查怀孕妇女人群过早宫颈重构的方法，包括测量来自怀孕哺乳动物受试者的生物样品中生物标记物可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)的表达水平，其中SE-CAD表达水平相对于预定对照表达水平的升高是过早宫颈重构的指征。
30.一种检测样品中可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)核酸或蛋白质以诊断PTB的诊断试剂的用途。
全文摘要
一种诊断或鉴别诊断早产(pre-term birth，PTB)风险增加的方法，包括检测或测量来自哺乳动物受试者的生物样品中，特别是尿液、宫颈阴道液或血液中的生物标记物可溶性E-钙粘蛋白(SE-CAD)的升高表达。升高的SE-CAD表达水平高于健康哺乳动物受试者相同样品中的表达水平是诊断PTB风险增加的指示。该诊断可以进一步包括鉴定PTB或PTL的其它临床症状。另外，该方法可以使用额外的生物标记物，如胎儿纤连蛋白。
文档编号C12Q1/68GK102792164SQ201080049775
公开日2012年11月21日 申请日期2010年10月28日 优先权日2009年10月29日
发明者M·A·埃洛韦兹 申请人:宾夕法尼亚大学托管会