专利名称：基于dna疫苗和嵌合体病毒的诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法、试剂盒、质粒和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于DNA疫苗和17D嵌合体病毒的联合免疫或共同施药免疫的诱导抗登革热的免疫应答的方法。在本发明的范围内还包括抗四种登革热亚型的DNA疫苗，其来自包含编码蛋白E的序列、或者仅由相应这个蛋白的区域III的序列的不同的重组质粒的构建，蛋白E来自每个登革热病毒亚型(DENV1-4)。包含在保护范围内的疫苗组合物包含
(a)抗四个登革热病毒亚型的DNA疫苗，来自构建的从包含蛋白E基因或包含 仅对应于该蛋白区域III的序列的不同的重组质粒，蛋白E来自每个登革热病毒亚型，它们都融合到质粒编码人组织纤溶酶原激活子(t-PA)的信号肽的序列中；
(b)包含由感染克隆粘附技术修饰的黄热病疫苗病毒17D的嵌合体病毒，编码来自不同亚型的登革热病毒的编码蛋白prM和E的序列取代黄热病毒的蛋白prM和蛋白E的序列；
(c)药学上可接受的载体，
本发明还涉及试剂盒，包含(a)来自构建的不同重组质粒抗登革热病毒亚型的DNA疫苗，重组质粒包含编码来自不同登革热病毒亚型的E蛋白的基因，或仅相应于该蛋白区域III的序列，所有这些序列融合到编码人组织纤溶酶原激活子(t-PA)的信号肽的序列中；和(b)包含由感染性克隆粘附技术(infectious clone attainment technology)修饰的黄热病毒疫苗病毒17D的嵌合体病毒，由编码不同亚型的登革热病毒的蛋白prM和E编码的序列替代黄热病毒蛋白PrM和E的序列。
背景技术：
在由虫媒病毒导致的疾病之中，基于在人群中的致病率和死亡率的重要性，登革热被认为是全球主要公共卫生问题之一，尤其是在热带和亚热带地区。它的致病原是登革热病毒，其是由伊蚊属传播的，通常是由埃及伊蚊传播。登革热病毒(DENV)属于黄病毒属,黄病毒家族。存在4个从抗原学上和病原学上不同的病毒类型DENV1、DENV2、DENV3、DENV4。即使由登革热病毒导致的原发感染诱导对感染亚型的免疫，然而并不存在抗其它病毒类型的长期交叉保护，导致不同登革热病毒的继发感染。登革热病毒是由病毒包膜和复合到RNA分子的核壳组成。它的基因组包含大约10，700核苷酸和由具有阳极的单链RNA组成，其编码黄病毒科蛋白的多肽前体。这个前体由细胞蛋白酶切断，由病毒蛋白酶生长三个结构蛋白，C(壳体)、prM(膜前体)、和E(包膜)，和七个非结构蛋白，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。该翻译的结构蛋白参与成熟的感染性病毒粒子，其非结构蛋白参与病毒复制和发展。在绝大多数的黄病毒中，登革热病毒E蛋白(包膜)是被糖基化的结构蛋白和转膜蛋白。这个E蛋白是在这些病毒表面发现的主要糖蛋白成分，具有大约55到60kDa的分子量，由493至501个氨基酸组成。E蛋白参与大量重要的生物活动。E蛋白作为结合蛋白，与细胞表面的受体结合，介导与宿主细胞膜的病毒膜的融合。这种蛋白还与核包膜相关，在病毒侵入时发挥重要作用。另外，E蛋白是一种强免疫原，在感染病毒的患者体内产生高抗体水平，其可以是中和过程，结合抗原决定簇，其与细胞受体作用，阻止病毒进入宿主细胞(Chang，1997; Kinney &Hung, 2001)。E蛋白是由伸长的平行延伸到病毒膜的二聚体形成。每个单体是由三个域组成域I、域II和域III。域I是中心部分，由120个氨基酸残基组成1-51、133-193、279-296。域II是伸长的，包含由分子内部多个点联结的两个单体形成二聚体的区域。区域II包含以下氨基酸残基52-132、194-280。区域III是位于碳末端的部分，代表免疫球蛋白，它的功能是结合到细胞受体上，比如，存在于未成熟的树状细胞的DC-SIGN。病毒/细胞的结合是通过区域III促进病毒颗粒吞噬作用介导的。区域III包含氨基酸残基298-394。抗原决定簇在这个区域内能够介导类型和亚类型特异性中和抗体反应。
进行大量的疫苗以对抗登革热，然而，没一个建议的方法代表大量疫苗的所需特性，比如对抗不同的循环病毒亚型的安全和长期的保护免疫反应。发展疫苗原型的一个主要困难是包含诱导对抗四种登革热病毒亚型的保护性免疫，但不会产生继发后果，例如，出血热以及尽可能使用最低数量或剂量。在发展减毒的四价疫苗上已经进行了相当的努力。最有希望的这些侯选存在于通过细胞培养途径的减毒病毒。这些疫苗在临床评价阶段。然而，早已注意到一些并发症。而且，存在可从基因回复或重组发生的病毒严重感染的潜在风险，很难去按配方制造多价的活减毒疫苗，因为在病毒复制阶段中存在同源或异源干扰的可能性(Barret，2001;Kinney& Huang, 2001)。另一个用于发展对抗登革热病毒的疫苗的战略是构建嵌合体。这个技术已用于大量的对抗黄病毒的疫苗的研究中，包含登革热病毒(Galler et al.，2005)。即使目前获得的进展，仍然存在巨大的挑战生产能够对抗四种登革热病毒亚型的产生同源反应的疫苗。DNA疫苗在控制感染的试剂的疫苗的发展中代表有效的技术。这个技术包含包含有抗兴趣的抗原的真核表达质粒的接种，其在通过接种的生物体细胞体内合成，通过组织相容性复合物I和II (MHC I和II)表征，激活特异性免疫反应。通过宿主细胞的抗原的内源性表达似乎刺激了天然的病毒感染，能够同时产生具有抗体生成的体液免疫反应，和具有细胞毒性的T淋巴细胞介导的细胞反应。免疫反应的这两个形式的介导主要地或专门地产生抗体应答，并相比于减活疫苗的细胞反应，不具有带来感染原的病原形式的反转的风险，提供了相比于亚株疫苗的优势。另外，DNA疫苗在温度范围内稳定，具有大规模生产的更低成本和允许去经评估的序列的快速选择。最近，几个研究组已分析了在控制黄病毒方面的DNA疫苗的使用。与这个病毒家族不同的病毒的某些研究显示出在接种编码黄病毒蛋白PrM和E的质粒(Phillpotts etal. , 1996; Kochel et al. , 1997;; Raviprakash et al, 2000)之后鼠类和非人类的灵长类动物中黄病毒特异性的保护免疫反应的引导。某些分析还使用包含黄病毒非结构性蛋白基因的DNA疫苗，例如日本脑炎、肝炎和登革热病毒(Lin et al.，1998; Encke etal. , 1998; Wu et al. , 2003; Costa et al. , 2006, 2007)。最近的研究表明，包含编码蛋白prM和E、DENVl-4病毒域III区域的基因的全序列的DNA疫苗能够在鼠模型中产生对抗登革热的体液免疫反应。然而，在这些研究中DNA疫苗的保护潜力仅是非直接地评估(血清中和试验和细胞反应)，没有实施直接的挑战检测在给予致死剂量的登革热病毒而评估这种疫苗的效力(Chen et al.，2007)。通过经登革热病毒挑战的动物中的病毒血评估，在非人类的灵长类中检测一些对抗登革热的DNA疫苗(Aotus 和 Rhesus)提供了部分保护(Raviprakash et al. , 2000; Putnak et al. , 2003;Blair et al. , 2006)。关于免疫方法，本发明人强调，Putnak et al (2003)发展出一种包含其从DENV2中编码蛋白PrM和E的基因的DNA疫苗，在鼠类和进一步免疫的猕猴类中观察它的免疫原性。在免疫后的七个月，动物显示出不再对抗登革热病毒的保护。这样，我们可以注意到到这些研究表明增加免疫反应的长度的新策略的需要。并且最近，有迹象表明DNA疫苗结合其它疫苗比相同的单独施药能够产生更有效的免疫反应。 专利申请W02008/127307，出版于10/23/2008，指出对抗登革热病毒的免疫应答方法使用初始免疫/加强免疫方法。而且特别地，W02008/127307指出包含DNA疫苗或4-价DNA疫苗纯化灭活的疫苗和后续登革热病毒免疫原剂量的加强免疫的登革热病毒免疫原的施药包含4-价灭活的登革热病毒疫苗，比如，例如在其它病毒的体内复制中，一个或多个病毒干扰的可能性，如此导致不同病毒亚型的异种免疫反应。另外，文献还指出包含编码登革热蛋白的基因的腺病毒的使用作为4价疫苗的加强剂，其可能意味着介导在人体内对抗登革热免疫反应的低效价。这个现象是由于在人体内的对抗腺病毒的在先免疫反应的存在，其可以阻止携带登革热病毒基因的载体腺病毒的感染，继而影响对抗登革热病毒的免疫应答的效力。于08/14/2008出版的专利申请US20080193477，一种采用包含在嵌合体黄病毒为基础的登革热疫苗后的第一黄热疫苗的施药的免疫方案。然而，在文献中的其它报导显示，黄热疫苗病毒的免疫方法可以影响由包含登革热病毒基因的黄热嵌合体病毒的免疫继而产生的免疫应答的效力。在这种情况下，在猴群中对抗登革热病毒的中和抗体水平比在先接种抗黄热病毒的猴群中显著下降(Galler et al.，2005)。如在这里讨论的，我们确信不论已作出的努力，仍然有必要发展更有效的DNA疫苗，能够介导增强的免疫应答，以及使用提高这些免疫应答的联合疫苗策略的使用的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA和嵌合体病毒17D疫苗联合给药或共同给药的免疫作用的抗登革热病毒的介导免疫应答的方法。本发明的目的还在于提供抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗组合物，来自包含编码来自登革热病毒的每个病毒亚型(DENV1-4)的E蛋白的基因的不同的重组质粒的构建的四种登革热病毒，或仅仅是相应于这些蛋白的域III的序列，所有这些序列融合到编码信号肽t-PA的序列中。在本发明的目的中包含疫苗的组分由(a)来自不同重组质粒的构建的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，不同的重组质粒包含编码来自登革热病毒的每个病毒亚型的E蛋白的基因，或仅是相应于这些蛋白的区域III的序列，所有的这些序列融合到编码信号肽t-PA的序列；以及(b)嵌合体病毒，包含修饰的黄热疫苗病毒17D，其序列编码黄热蛋白prM和E，被编码不同的病毒亚型的登革热病毒蛋白prM和E的序列所替代，药学上可接受的载体组成。本发明进一步提供试剂盒包含(a)来自从构建的包含E蛋白基因，或仅包含相应于每个登革热病毒亚型的这些蛋白的区域III的序列的不同的重组质粒的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗；以及(b)嵌合体病毒，包含经修饰的黄热疫苗病毒17D，其由编码不同亚型的登革热病毒蛋白prM和E的序列替代编码黄热病毒蛋白prM和E的序列。
图I 是显示质粒 pcTPA, pElD2 and pE2D2 的图；、 图2是显示由质粒pElD2 (A和A')、pE2D2 (B和B')和pcTPA (C和C')转染的细胞BHK-21的免疫荧光图，其中状态对照显示在A、B和C中，荧光显示在A'、B'和C'中(1000XA和B，400 XC的增加)；
图3A-3B是显示pElD2的第一次试验的结果 图3C- 3D是显示pElD2的第二次试验的结果 图4A-4B是显示pE2D2的第一次试验的结果 图4C-4D是显示pE2D2的第二次试验的结果 图5A- 是显示pElD2，pE2D2, 17D-D2的同时联合的第三次试验的结果图。
具体实施例方式本发明者发现在目前发展水平中登革热病毒包膜蛋白(E)是一种强免疫原，能够产生高水平的中和抗体的保护性应答。如此，本发明的第一个目标是发展抗登革热病毒的DNA疫苗，其包含编码蛋白E的没有疏水性C末端区域，或包含插入到质粒pcTPA的这些蛋白区域III的序列，其具有人体组织血浆酶原活动子(t-PA)的信号序列。本发明还具有建立介导抗登革热病毒的保护性免疫应答的方法的目的，基于在初免/加强免疫系统中或两种疫苗联合给药的DNA疫苗和嵌合体病毒17D疫苗的联合免疫。质粒pcTPA包含相应于人体组织血浆酶原活动子基因的信号肽(t-PA)的DNA序列。作为信号肽被识别的t-PA区域具有不同的大小。描述t-PA基因的克隆和测序的文献(Pennica et al. , Nature, 301:214-221，1983)识别105个碱基配对的区域，其编码第一个35个氨基酸，作为信号肽。质粒pcTPA包含69个碱基对序列，其相应于第一个23个氨基酸SEQ ID N0:8。对应于t-PA的信号肽的序列在质粒pcDNA3 (Invitrogen)中使用限制性内切酶和&oRV位点克隆。这样，在EcoRV位点下游的任何序列将被克隆，使用这个酶的位点，其产生盲端片段；然而，结合到另一个片段上，也是一个盲端，不必需要经EcoRV消化。另外在这个位点，质粒pcTPA在EcoRV的下游保有五个限制性酶位点iBstW,Not\, Xhol, Xbal和如al),从质粒pcDNA3多克隆位点,其还可用于新序列的克隆。为了不同重组质粒的构建，包含编码没有其疏水C末端部分(E80%)-SEQ ID NO:6-的蛋白E的序列，或仅有对应于这个蛋白的区域III-SEQ ID NO :7 —的序列，使用NewGuinea C (NGC) DENV2 (M29095; gi :323447)的谱系。这种病毒从受感染的Vero细胞培养中获取。在质粒pcTPA中克隆的基因E片段从受DENV2 NGC感染的Vero细胞的总DNA中经PCR放大。RNA作为合成包含靶区域的cDNA的模板，使用特异性寡核苷酸。该cDNA接着作为靶序列经PCR放大的模板，使用其它寡核苷酸包含了克隆中使用的限制性内要酶的位点。经放大的片段在琼脂凝胶电泳中分辨，进一步收集，经树脂纯化(基因清洁(geneclean))。获取的片段，如质粒pcTPA，经特异性限制性内切酶消化，结合T4 DNA连接酶。重组克隆在大肠杆菌DH5-a菌株中获取，经这些质粒转染，由限制性内切酶消化，进一步地经测序列确认。为了评价如上所述获取的重组质粒的能力，介导没有C末端部分的疏水区域(E80%)，或它的区域111(域III)的蛋白E的表达，在体外使用经不同质粒转染的BHK-21细胞实施表达分析检测这些蛋白。重组质粒从质粒pcTPA中获取，其由质粒pcDNA3 (Invitrogen)中构建。这种载体在人细胞巨化病毒(CMV)启动子下促进重组蛋白的表达，包含编码人体组织血浆酶原的信号肽(t-PA)的序列，其将这些蛋白引入到细胞外空间。为了评价所感兴趣的蛋白的生产，BHK-21细胞培养经重组质粒转染，使用脂质体转染法(lipofectamine)，根据制造商的说明指导。重组蛋白的表达是经免疫荧光法分析，如 Costa SM et al. , 2006中所描述。为了重组质粒的大规模生产和控制,大肠杆菌,使用菌株DH5_a {E. coli bacteria, strain DH5_ a )经不同的质粒转染,在液体TB培养基中培养，37°C过夜。质粒在阳离子交换柱中使用由制造商推荐的QIAGEN tip 10. 000试剂盒经纯化，在水中悬浮，在分光光度计和琼脂凝胶电泳中定量。DNA疫苗储存在_20°C，直至使用。本发明的DNA疫苗在分离基础上检测其保护性能力。这些检测易于分析重组蛋白在体外表达的效力，评价在鼠类中产生的抗体应答，并实施致死剂量的病毒的大脑内接种的挑战性检测。血清中和检测如同Cafour et al.，2001中所述用前述的病毒在Vero细胞中实施。为了评估获取的构建，大约四个星期大的雄BALB/C鼠群经重组质粒组和对照组免疫。鼠在后腿四头肌部位经过肌肉内(im)途径用溶解在PBS中的这些质粒接种。在每个接种中，每个动物注射IOOPg的DNA (每条腿50呢)。在这个发明的新免疫方法中，例如，初免疫(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒)系统或同时免疫(共同施药)，本发明的DNA疫苗在嵌合体病毒(17D-D2)中联合免疫。这种嵌合体是由黄热疫苗病毒YF 17D用DENV2菌株NGC，SEQ ID NO :9的prM和E的基因取代编码prM和E蛋白的基因而构建成的。值得强调的是，这种新免疫方法是从DENV2 DNA疫苗的构建开始，并且挑战性检测其是实施这些疫苗的保护性能力的介导，尤其是当序列编码没有疏水C末端部分的E基因时。为了嵌合体17D-D2的构建，使用Rice et al.，1989开发的黄热感染cDNA方法，其由两个质粒组成pYF5’ 3’ IV和pYFM5. 2。在这个方法中，考虑到在高复制数量质粒中一些病毒序列缺乏稳定性，黄热病毒基因组在前述两种方法中分离。这些质粒经特异性限制内切酶消化，产生的片段结合，重新组成黄热病疫苗病毒全基因组。然而，为获取更减毒的病毒(Marchevsky et al. , 1995),在猴子中用这个病毒的检测表明需要对于cDNA进行基因修饰。如此的修饰通过Galler和Freire (US 6，171，854)的方法实施，导致质粒pYF5，3，IV和pYFM5. 2的新版本，分别命名为G1/2和T3/27。随后，使用质粒pACNR1180(Ruggli et al., 1996)，其具有限制这个质粒的复制数量的复制源(P15A)，从而减少在细菌中质粒DNA的拷贝数量。质粒pACNR1180在克隆猪瘟病毒基因组时被认为是理想的质粒，其大小类似于黄热病毒基因组，保证克隆基因组的稳定性，黄热病毒的全基因组在经修饰的PACNR1180质粒中克隆(去除某些限制性内切酶位点)，产生PYF17D/14质粒。质粒PYF17D/14分两步骤产生首先，质粒G1/2用作插入经修饰的pACNR1180质粒的不同片段经PCR放大的模板，产生质粒NSK7。然后，质粒NSK7用于克隆包含在质粒T3/27中的疫苗病毒17D基因组的剩余部分，产生质粒pYF17D/14。所有质粒在疋coli MC1061中繁殖，经Qiagen柱纯化。为构建嵌合体17D-D2，使用DENV2病毒，New Guinea菌株。cDNA以与前述DNA疫苗克隆类似的方法合成，包含登革热病毒基因组区域，其从相应与编码蛋白prM的基因的第一个核苷开始到对应于蛋白E的氨基酸205的序列。这个区域经PCR放大，插入质粒G1/2的限制性酶如al和舱(1的酶切位点之间，产生质粒pGl/2 DEN2。包含17D-D2全基因组的cDNA是从片段的结合而构建的由质粒pGI/2 DEN2的消化而产生的I/NsiI (启动子SP6，黄热病毒区域5'NTR-C和DENV2 prM_2/3E)、由质粒pYFD/Fll/12的消化而产生的Afeil/#7yl (编码DENVl的E蛋白的3'区域和黄热病毒基因NSl的启始序列)，由质粒PYF17D/14的消化而产生的(其包含了黄热病毒基因组的剩余部分)。所有这些质粒在疋 coli XL-I BLUE 中繁殖，经 Concert High Purity System(Invitrogen)纯化。 全质粒经通ol线性化，通过启动子区域SP6用于体外转录。在体外合成的RNA以与US6，171，854中所述的相类似方法经Vero细胞的电穿孔法用于病毒再生。除用分离的DNA疫苗接种以外，还分析了鼠经联合免疫的免疫应答初免(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒17D-D2)系统，和两种疫苗类型的同时免疫(共同施药)。在初免/加强免疫的系统中，BALB/c鼠如如所述的在最后剂量的两个星期后受到DNA和DENV2疫苗的两种剂量，它们经皮下(sc)或肌肉(im)途径给予4 IoglO PFU的嵌合体病毒(17D-D2)的接种。在这个同时免疫法(共同免疫法)中，这两种疫苗(DNA和嵌合体17D-D2)在缓冲盐溶液(PBS)中混合，经im途径接种，在两周内分为两种剂量给药。由DNA疫苗单独地或与嵌合体病毒一起产生的免疫应答通过产生抗体和中和抗体来进行评价。在弟_■种DNA剂量的两周后或者在最后免疫之后的两周通过后眼球途径对于动物的取血。在免疫开始之前的那天获取预免疫血清。在这个中和检测中，DENV病毒在经过受免疫鼠血清的不同稀释液中培养，然后，这些病毒感染Veix)细胞的能力通过溶解板(lysisplate)的形式进行评估。从这些分析中，滴定中和抗体的水平是可能的。BALB/c鼠经过不同质粒单独地或者与病毒17D-D2联合免疫是通过DENV2大脑内接种来挑战的(大约4. 3 IoglO PFU,相应于3. 8的LD5tl)，在最后的DNA疫苗免疫后25天 或者在嵌合体病毒接种后10天。在挑战之前，动物经氯胺酮-赛拉嗪的混合物麻痹。病毒的滴定如Caufour et al, 2001中所述的,在动物内接种后很快通过在Vero细胞内实施。鼠的测评是在病态的挑战之后直至21天每天检测，尤其是在后腿的瘫痪和致死率的发展方面。垂死的动物与在挑战试验后21天后存活的那些动物一起被处死。为了血清中和检测而收集这些动物的血。本发明现将通过实施例进行阐明。以下实施例是用于解释本发明，并代表优选方式，使用不多于常规性试验，本领域技术人员知晓或者能够发现如何使用其它合适的材料和技术。实施例I-表达载体pcTPA的构建新的表达质粒通过将编码人组织血浆酶原活动子(t-PA)-SEQ ID NO :8的信号肽的序列插入到原始质粒pcDNA3 (Invitrogen)中而构建。这个序列的片段使用特异性启动子(图I)经PCR放大。以下是用于经PCR放大反应的寡核苷酸。限制酶切位点III和&0RV各自具有下划线。SEQ ID NO: I -正义核苷酸链(TPAl)
5，GGGGAAGCTTATGGATGCAATGAAGAGG3，
SEQ ID NO:2 -反义核苷酸链(TPA2)
5， GGGGATATCGCTGGGCGAAACGAAGAC3，
PCR产物，包含69个pb，经消化，并在质粒pcDNA2内_ind III和&oRV酶切位点之间克隆。这个序列通过测序确认，重组质粒命名为pcTPA(图1A)。实施例2_pElD2和pE2D2的构建
两个质粒(PE1D2和pE2D2)从pcTPA质粒中构建。质粒pcTPA是从附加有编码人体组织血衆酶原活动子(t-PA)的信号肽的序列的质粒pcDNA3 (Invitrogen)中构建的,在限制性酶切位点(包含在质粒pcDNA3中的从人细胞巨化病毒中的启动子区域的下游的历'/^III e BcoRY)。质粒PE1D2是由插入编码登革热病毒亚型2(DENV2)的病毒核包膜蛋白(E)不具备蛋白E的C末端部分的80%的序列构建的。这个序列，包含了 DENV2全基因组的核苷酸937 和 2131 之间的核苷酸，New Guinea C (NGC)菌株(Genebank: M29095)经 PCR 放大，使用正义和反义寡核苷酸链，如下SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4中所述的，分别具有下划线的限制酶切位点&oRV和XbaI
SEQ ID NO:3 - 5^GGGGGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC3^
SEQ ID NO:4 - 5^GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3^
进一步地，根据图1B，在质粒pcTPA中序列的克隆是在限制性酶切位点&0RV和油<31之间进行的，在编码信号肽t-PA的序列的相同的开放阅读框，产生质粒PE1D2。质粒pE2D2经插入编码DENV2蛋白E的区域III的序列构建，包含在DENV2 NGC菌株的(Genebank: M29095)全基因组的核苷酸1822和2131之间的核苷酸。这个序列使用如下所示的SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6的正义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链经PCR技术放大，限制酶切位点AcoRV和ZhI各自具有下划线
SEQ ID NO:5 - 5^GGGGGATATCGGAATGTCATACTCTATG3^
SEQ ID NO: 6- 5^GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3^
进一步地，质粒pcTPA中的序列的克隆是在限制性酶切位点&01^和ZhI之间实施，在编码信号肽t-PA的序列的相同的开放阅读框内，产生如图IC所示的质粒pE2D2。每个克隆产物经测定序列确认。大肠杆菌，DH5-Q菌株，用于小规模和大规模的质粒的克隆和生产。质粒根据制造商的说明指示，通过碱性提取方法分离，经交换柱(Qiagen)纯化，悬浮在无菌mi I iQ水中，储存在-20 0C，直至使用。实施例3-嵌合体病毒17D-D2
嵌合体病毒17D-D2是通过将编码DENV2，NGC菌株的蛋白prM和蛋白E的基因取代编码黄热病疫苗病毒YF17DD的膜蛋白(prM)和核包膜蛋白(E)的基因而构建的。嵌合体病毒17D-D2构建的细节可在Cafour et al.，2001找到。为了嵌合体17D-D2的构建，使用Rice et al.，1989发展的黄热病感染性cDNA方法，其由两个质粒组成pYF5'3'IV和pYFM5. 2。在这个方法中，考虑到大拷贝量的质粒中某些病毒的序列稳定性的缺乏，黄热病毒基因分离在两个前述的质粒中。这些质粒经特异性限制性内切酶消化，产生结合的片段，重新组成黄热疫苗病毒全基因组。然而，在猴群的这个病毒的检测表明，为获取更减毒的病毒(Marchevsky et al.，1995)，需要对于cDNA的基因进行修饰。这样的修饰经Galler和Freire (US6，171,854)所揭示的方法，导致质粒pYF5，3，IV and pYFM5. 2 的新版本，分别命名为 G1/2 和 T3/27。质粒 pACNR1180 (Ruggliet al., 1996)其具有限制这个质粒的复制数量的复制源(pl5A)，从而减少在细菌中的质粒DNA的拷贝数量，而使用该质粒。质粒pACNR1180被描述为一种克隆猪瘟病毒基因组的理想的质粒，其大小类似于黄热病毒基因组，保证了克隆的基因组的稳定性。基于这些结果，黄热病毒全基因组在经修饰的PACNR1180质粒中克隆(某些限制性酶切位点经去除)，产生质粒PYF17D/14。质粒pYF17D/14通过两个步骤产生首先，质粒G1/2用作为插入在 经修饰的质粒PACNR1180的不同片段的经PCR技术放大的模板，产生质粒NSK7。进一步地，质粒NSK7用于克隆包含在质粒T3/27中的疫苗病毒17D基因组的其余部分，然后，产生了质粒PYF17D/14。所有在万.co7i MC1061中繁殖的质粒经Qiagen柱纯化。为构建嵌合体17D-D2，使用DENV2病毒，New Guinea菌株。cDNA在与前述的DNA疫苗克隆相似的方法合成，包含登革热病毒基因组区域，其从对应于编码蛋白PrM的基因的第一个核苷酸至对应于蛋白E的氨基酸205的序列。这个区域经PCR技术放大，插入质粒G1/2的两个限制性酶切位点如al和舱打之间，产生质粒pGl/2 DEN2。包含17D-D2全基因组的cDNA从片段的结合中构建由质粒pGl/2 DEN2的消化中产生的(具有启动子SP6，黄热病毒5’ NTR-C 区域和 DENV2 prM_2/3E)，经质粒 pYFD/Fll/12 消化产生的 Afeil/#2wl (编码从DENVl中的蛋白E的3’区域和黄热病毒基因NSl的初始)，经质粒pYF17D/14的消化中产生的其包含黄热病毒基因组的其余部分)。所有质粒在疋coli XL-I BLUE中繁殖，经Concert High Purity系统(Invitrogen)纯化。整个质粒沿袭ZAoI,通过启动子区域SP6用于体外转录。体外合成的RNA以US 6. 171. 854的文献中所述的类似的方法通过Veix)细胞的电穿孔法用于病毒再生。实施例4-重组蛋白的表达的评估
亚洲大颊幼鼠的肾脏(BHK-21)在体外经不同质粒转染，从而评估重组蛋白的表达，根据制造商的说明指示使用脂质体(Invitrogen)转染法。在转染的BHK细胞中的蛋白El和蛋白E2的表达通过免疫荧光检测法检测，使用抗DENV2腹腔液体(ATCC)和鼠抗IgG的抗体经突光素(Southern biotechnology)共轭后在突光光学显微镜下观察。根据图2,仅有经质粒PE1D2和pE2D2转染的细胞显示荧光，表明这些构建的质粒是能够介导登革热病毒蛋白在哺乳动物细胞中的表达。实施例5-免疫作用
为检测DNA疫苗单独或者与嵌合体病毒17D-D2 —起在初免/加强免疫系统中的保护性能力，使用大约四个星期大的BALB/c鼠进行两个独立的试验。经DNA疫苗免疫作用的，质粒稀释在PBS中(IX最终浓度)中，动物经肌肉途径(im)接种，在后腿四头肌上以lOOPg/lOOML的DNA疫苗接种每个动物(50l^g/50ML每个腿)。用嵌合体病毒17D-D2进行免疫作用，动物经皮下途径(sc)在足垫上接种，或者经肌肉途径(im)在后腿四头肌接种溶解在培养基M199 (Sigma)或者PBS中的4 IoglO PFU的病毒。质粒pcTPA用于阴性控制。第三个试验是实施DNA疫苗和17D-D2疫苗经im途径同时免疫(共同施药)。在这个情况下，两种疫苗混合在PBS的单个溶液中。动物分组(每组10个鼠)。然后动物每两个星期接受免疫，在最后一次免疫的两个星期后，动物经脑内途径(ic)接受致死剂量的DENV 2 NGC(3. 8 LD50)接种的挑战，在鼠中神经适应。进一步地，动物在病态和存活的第21天前每天接受评估(瘫痪的发展，尤其是后腿的瘫痪)。
免疫时间表如图3中所呈现。以下的表I、表2和表3显不免疫时间表。表I显示初免和加强免疫方案的第一次试验或者单独免疫的免疫时间表。
表I
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"..........................9.....—'.............................WDENV2fe^—￥￥￥fM.......................................................................................................................表2显示初免和加强免疫方案的第二次试验或者单独免疫的免疫时间表。
权利要求
1.诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法，其特征在于，包括给患者DNA疫苗和17D嵌合体病毒的施药。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，通过给患者联合施药，在初免(DNA疫苗)和加强免疫(嵌合体病毒)系统或者两个疫苗(以相同形式的DNA疫苗和嵌合体病毒疫苗)的同时共同施药的免疫策略。
3.抗登革热病毒的疫苗组合物，其特征在于，包含 (a)从包含编码蛋白E的基因或仅包含对应于这些蛋白的区域III的序列的不同重组质粒的构建中产生的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，蛋白E来自每个登革热病毒亚型，它们都融合到编码人组织血浆酶原活动子(t-PA)的信号肽的序列中； (b)嵌合体病毒包含经感染性克隆粘附技术修饰的黄热病疫苗病毒17D，由编码登革 热病毒不同亚型的蛋白PrM和蛋白E的序列取代编码黄热病毒蛋白prM和蛋白E的序列；以及 (c)药物上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述DNA疫苗包含 -质粒pEl，由插入编码来自登革热病毒病毒性包膜(E)蛋白80%的序列构建，不具有登革热病毒蛋白E的C末端部分。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述DNA疫苗包含 -质粒PE2，由插入编码登革热病毒蛋白E的包含登革热病毒全基因组的核苷酸1822和2125之间的区域III的序列构建。
6.试剂盒，其特征在于，包含 (a)来自包含编码每个登革热病毒亚型的蛋白E的基因或包含仅对应于这些蛋白区域III的序列的不同重组质粒的构建的抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，它们的序列都融合到编码人组织血浆酶原活动子的信号肽(t-PA)的序列中；以及 (b)嵌合体病毒包含经感染性克隆粘附技术修饰的黄热疫苗病毒17D，由编码不同亚型的登革热病毒的蛋白PrM和蛋白E的序列取代编码黄热病毒蛋白prM和蛋白E的序列。
7.重组质粒，包含蛋白E基因，并且来自每个登革热病毒亚型的蛋白E基因的序列融合到编码t-PA信号肽的序列，其特征在于，由插入每个登革热病毒的没有蛋白E的C末端部分的病毒性包膜(E)的蛋白的80%的序列构建，其中这样的序列是使用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO :4所示的正义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链放大的，然后介导在质粒pcTPA在编码信号肽t-PA的序列的相同的开放式阅读框内的限制性酶EcoRV和XbaII的酶切位点之间的序列的克隆，从而产生重组质粒。
8.根据权利要求7所述的质粒，其特征在于，编码登革热病毒的病毒性包膜蛋白(E)的80%的序列，该病毒包膜蛋白(E)的序列包含在DENV2，New Guinea C(NGC)菌株的全基因组的核苷酸 937 和 213125 之间(Genebank:M29095)。
9.重组质粒，包含蛋白E基因，并且来自每个登革热病毒亚型的蛋白E基因的序列融合到编码t-PA信号肽的序列，其特征在于，由插入编码登革热病毒蛋白E的区域III的序列构建的，其中这样的序列是使用如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 4所示的正义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链放大的，在限制性酶EcoRV和XbaI酶切位点之间的，进一步地克隆在限制性酶EcoRV和XbaI酶切位点之间的序列，在编码信号肽t_PA的序列的开放阅读框内，从而生成重组质粒。
10.根据权利要求9所述的质粒，其特征在于，编码登革热病毒蛋白E的区域II的序列，包含在DENV2，NGC菌株(Genebank: M29095)的全基因组的核苷酸1822和213125之间。
全文摘要
本发明涉及一种基于DNA疫苗和嵌合体病毒17D疫苗在联合免疫或者共同施药的免疫诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法。在本发明的范围内还包含抗四种登革热病毒亚型的从不同重组质粒的构建中产生的DNA疫苗，重组质粒包含编码蛋白E或者仅包含对应于这个蛋白的区域III的序列，蛋白E和对应于这个蛋白区域III的序列来自于每个登革热病毒亚型(DENV1-4)。本发明进一步提供一种疫苗组合物，由(a)抗四种登革热病毒亚型的DNA疫苗，(b)包含经修饰的黄热病疫苗病毒17D的嵌合体病毒；和(c)药物上可接受的载体，包含在本发明保护范围内。
文档编号C12N15/86GK102711817SQ201080052438
公开日2012年10月3日 申请日期2010年8月1日 优先权日2009年10月1日
发明者里卡多·盖勒, 阿德里玛·德·索萨·阿塞韦多, 阿达·玛丽亚·德·巴塞卢斯·阿尔维斯, 马可仕·达·席尔瓦·弗莱雷 申请人:奥斯瓦道·克鲁兹基金会