专利名称：腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用的制作方法
腺伴随病毒(AAV)进化支、序列、含有这些序列的载体及它
们的应用本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2004/(^8817，国际申请日为2004年9月 30日，进入中国国家阶段的申请号为“200480027905. 2”，发明名称为“腺伴随病毒(AAV)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用”的发明专利申请的分案申请。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本申请包括由国家卫生研究院(NIH)的NIDDK P30DK47757和NHLBI P01HL59407 拨款资助的工作。美国政府享有本发明的一定权力。
背景技术：
腺伴随病毒(AAV)是细小病毒科家族的成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4. 7千碱基(1Λ)到61Λ的单链线形DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现，AAV指定为依赖病毒属(D印endovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV 基因组在感染后位点特异性地整合进宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装进感染性病毒)。非致病性的特性、感染性的宽宿主范围(包括非分裂细胞)与潜在的位点特异性染色体整合使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。近来的研究表明AAV载体是用于基因递送的优选运载体。迄今为止，已从人或非人灵长类(NHP)分离了几种表征良好的不同AAV。已发现不同血清型的AAV表现出不同的转染效率，也表现出对不同细胞或组织的向性。然而，以前还未对这些不同血清型之间的关系进行研究。基于AAV的构建物用于递送异源分子是理想的。发明概述本发明提供AAV的系统发生相关序列的“超家族”或“进化支”。这些AAV进化支提供用于将分子靶向和/或递送至所需靶细胞或组织的AAV序列源。本发明一方面提供具有至少三个AAV成员的AAV进化支，这些成员是基于AAV VPl氨基酸序列对比，使用自引值为至少75% (基于至少1000次复制)的邻接启发式算法(Neighbor-Joining heuristic)与不大于0. 05的泊松校正距离测量值(Poisson correction distance measurement)确定为系统发生相关的。合适的AAV进化支由用于产生载体的AAV序列组成。本发明还提供以前未知的人AAV血清型，这些血清型在本文中称为克隆观.4/ hu. 14或AAV血清型9。因此，本发明另一方面提供一种由AAV衣壳组成的血清型9的AAV， 该衣壳在血清学上与SEQ ID NO :123的氨基酸1-736的序列的衣壳相关，在血清学上与 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7 或 AAV8 中的任一衣壳蛋白不同。用该huAAV9的衣壳构建的载体表现出的基因转移效率类似于肝脏中的AAV8、优于肌肉中的AAV并且比肺中的AAV5高200倍。此外，该新的人AAV血清型与以前所述的 AAVl到AAV8的序列同一性小于85%，并且不被任何这些AAV交叉中和。本发明也提供其它新的AAV序列、含有这些序列的组合物及它们的应用。有利的是，这些组合物特别适用于出于治疗或预防目的需要反复施用的AAV载体。本发明的这些和其它方面可通过以下发明详述得到明白。附图简述
图1是使用带泊松校正距离测量值的邻接启发式算法构建的系统发生关系树。基于分离的AAV vpl衣壳蛋白与分组于进化支中分离的AAV确定关系。单个衣壳克隆的组基于它们共同的祖先分类在进化支中。进化支以A到F命名；亚型以进化支字母加上一个数值表示。图2A-2AE对比了本发明的AAV vpl衣壳蛋白的氨基酸序列(公布了各个序列的编号)与以前公布的 AAVl [SEQ ID NO :219]、AAV2 [SEQ ID NO :221]、AAV3-3 [SEQ ID NO: 217]、AAV4-4[SEQ ID NO :218]、AAV5 [SEQ ID NO :216]、AAV6 [SEQ ID NO :220]、AAV7 [SEQ ID NO :222]、AAV8[SEQ ID NO :223]与 rh. 25/42_15、29. 3/bb. 1、cy. 2、29. 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前称为 41. 10)、 rh. 25(以前称为 41. 15)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、 rh. 37、rh. 36、rh. 23、rh. 8 和 ch5 [公开的美国专利申请号 2003/0138772A1 (2003 年 7 月 24 日)]。本发明的序列包括 hu. 14/AAV9[SEQ ID NO 123]、hu. 17[SEQ ID NO :83]、 hu. 6[SEQ ID NO :84]、hu. 42 [SEQ ID NO :85]、hu. 38 [SEQ ID NO :86]、hu. 40 [SEQ ID NO:
87]、hu.37 [SEQ IDNO :88]、rh. 40 [SEQ ID NO :92]、rh. 52 [SEQ ID NO :96]、rh. 53 [SEQ ID NO :97]、rh. 49 [SEQ ID NO :103]、rh. 51 [SEQ ID NO :104]、rh. 57 [SEQ ID NO :105]、 rh. 58[SEQID NO :106]、rh. 61 [SEQ ID NO : 107]、rh. 50 [SEQ ID NO : 108]、rh. 43 [SEQ ID NO :163]、rh.62[SEQ ID NO :114]、rh.48[SEQ ID NO :115]、4_9/rh. 54[SEQ ID NO :116]和 4-19/rh. 55[SEQ ID NO :117]、hu. 31[SEQ ID NO : 121]、hu. 32[SEQ ID NO : 122]、hu. 34[SEQ ID NO :125]、hu. 45 [SEQ ID NO : 127]、hu. 47 [SEQ ID NO : 128]、hu. 13 [SEQID NO :129], hu. 28 [SEQ ID NO :130]、hu. 29 [SEQ ID NO : 132]、hu. 19 [SEQ IDNO : 133]、hu. 20 [SEQ ID NO :134]、hu. 21 [SEQ ID NO : 135]、hu. 23. 2 [SEQ ID NO : 137]、hu. 22 [SEQ ID NO :138]、 hu. 27 [SEQ ID NO : 140]、hu. 4 [SEQ ID NO :141]、hu. 2 [SEQ IDNO : 143]、hu. 1 [SEQ ID NO: 144], hu. 3 [SEQ ID NO : 145]、hu. 25 [SEQ ID NO : 146]、hu. 15 [SEQ ID N0:147]、hu. 16 [SEQ ID NO :148]、hu. 18 [SEQ ID NO : 149]、hu. 7 [SEQID NO : 150]、hu. 11 [SEQ ID NO: 153]、 hu. 9 [SEQ ID N0:155]、hu. 10 [SEQ ID NO :156]、hu. 48 [SEQ ID NO :157]、hu. 44 [SEQ ID NO: 158],hu. 46[SEQ ID NO : 159]、hu.43[SEQID NO :160]、hu.35[SEQ ID NO :164]、hu.24[SEQ ID NO :136]、rh. 64 [SEQ ID NO :99]、hu. 41 [SEQ ID NO :91]、hu. 39 [SEQ ID NO: 102]、 hu. 67[SEQ ID NO : 198]、hu.66[SEQID NO :197]、hu. 51[SEQ ID NO :190]、hu. 52[SEQ ID NO: 191],hu.49[SEQ IDNO :189]、hu.59[SEQ ID NO :192]、hu.57[SEQ ID NO : 193]、hu.58[SEQ ID NO :194]、hu. 63 [SEQ ID NO :195]、hu. 64 [SEQ ID NO :196]、hu. 60 [SEQ ID NO :184]、 hu.61[SEQID NO :185]、hu. 53[SEQ ID NO :186]、hu. 55[SEQ ID NO :187]、hu. 54[SEQ ID NO:
88],hu. 6 [SEQ ID NO :84]与rh. 56 [SEQ ID NO :152]。这些衣壳序列也见引为参考的序列表中。图3A-3CN对比了本发明的AAV vpl衣壳蛋白的核酸序列(公布了各个序列的编号)与以前公布的 AAV5(SEQ ID NO 199)、AAV3-3 (SEQ ID NO :200)、AAV4-4 (SEQ ID NO: 201)、AAVl (SEQ ID NO :202)、AAV6 (SEQ ID NO :203)、AAV2 (SEQ ID NO :211)、AAV7 (SEQID NO 213)与 AAV8(SEQ ID NO :214)、rh. 25/42_15、29· 3/bb. 1、cy. 2、29· 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前称为 41. 10)、 rh. 25(以前称为 41. 15 ；GenBank 登录号 AY530557)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、 cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、rh. 36、rh. 37、rh. 23、rh. 8 与 ch. 5[公开的美国专利申请号 2003/0138772A1 (2003 年 7 月 24 日)]。本发明的核酸序列包括 hu. 14/AAV9 (SEQ ID NO 3)、LG-4/rh. 38 (SEQ IDNO 7)、LG-10/rh. 40 (SEQID NO 14)、N721-8/rh. 43 (SEQ ID NO 43) U-8/rh. 49 (SEQ IDNO :25)、2_4/rh. 50 (SEQ ID NO :23)、2_5/rh. 51 (SEQ ID NO :22)、 3-9/rh. 52(SEQ IDNO :18)、3_ll/rh.53(SEQ ID NO : 17)、5_3/rh.57(SEQ ID NO :26)、 5-22/rh. 58(SEQ IDNO :27)、2_3/rh. 61(SEQ ID NO :21)、4_8/rh.64(SEQ ID NO :15)、 3. 1/hu. 6(SEQ IDNO :5)、33. 12/hu. 17(SEQ ID NO :4)、106. 1/hu. 37 (SEQ ID NO :10)、 LG-9/hu. 39(SEQ IDNO :24)、114. 3/hu. 40(SEQ ID NO :11),127.2/hu. 41(SEQ ID NO :6)、 127.5/hu.42(SEQID NO :8)与 hu. 66(SEQ ID NO :173)、2_15/rh. 62(SEQ ID NO :33)、 1-7/rh. 48(SEQ IDNO :32)、4_9/rh. 54(SEQ ID NO :40)、4_19/rh. 55(SEQ ID N0:37)、52/ hu. 19 (SEQ IDNO 62) ,52. 1/hu. 20 (SEQ ID NO :63)、54. 5/hu. 23 (SEQ ID N0:60)、54.2/ hu. 22 (SEQ IDNO :67)、54. 7/hu. 24 (SEQ ID NO :66),54. 1/hu. 21 (SEQ ID NO :65)、54. 4R/ hu. 27(SEQ IDNO :64)、46.2/hu. 28(SEQ ID NO :68)、46.6/hu. 29(SEQ ID NO :69)、128.1/ hu. 43(SEQ IDNO :80)、128.3/hu.44 (SEQ ID NO :81)与130.4/hu. 48(SEQ ID NO :78)、3.1/ hu.9 (SEQ IDNO :58)、16.8/hu. 10(SEQ ID NO :56)、16. 12/hu. 11(SEQ ID NO :57)、145. 1/ hu.53 (SEQID NO :176),145.6/hu.55 (SEQ ID NO :178),145. 5/hu. 54(SEQ ID NO :177)、 7. 3/hu. 7 (SEQ ID NO :55)、52/hu. 19 (SEQ ID NO :62)、33. 4/hu. 15 (SEQ ID N0:50)、33.8/ hu.16 (SEQ ID NO 51),58. 2/hu. 25(SEQ ID NO :49)、161. 10/hu. 60(SEQ IDNO : 170)、H_5/ hu. 3 (SEQ ID NO :44)、H-1/hu. 1(SEQ ID NO :46)、161. 6/hu. 61(SEQ IDNO : 174)、hu.31 (SEQ ID NO 1),hu. 32 (SEQ ID NO 2),hu.46(SEQ ID NO :82)、hu.34 (SEQ ID NO :72)、hu.47 (SEQ ID NO :77)、hu. 63 (SEQ ID NO :204)、hu. 56 (SEQ IDNO :205)、hu. 45 (SEQ ID NO :76)、 hu. 57 (SEQ ID NO :206)、hu. 35 (SEQ ID NO :73)、hu. 58 (SEQ ID NO :207)、hu. 51 (SEQ ID NO: 208),hu. 49(SEQ ID NO :209)、hu. 52(SEQID NO :210)、hu. 13(SEQ ID NO :71)、hu. 64 (SEQ ID NO :212)、rh. 56 (SEQ ID NO :54)、hu. 2 (SEQ ID NO :48)、hu. 18 (SEQ ID NO :52)、hu. 4 (SEQ ID NO 47)与hu. 67 (SEQ IDNO :215)。这些衣壳序列也见引为参考的序列表中。图4A-4D提供了对基于AAV的新灵长类载体在体外和体内基因转移效率的评价。 AAV 载体是如[Gao 等，Proc Natl Acad Sci 美国，“11邪4_11859 O002 年，9 月 3 日)]所述具有 AAV1、2、5、7、8 和 6 与 ch. 5、rh. 34,cy. 5、rh. 20,rh. 8 和 AAV9 衣壳的假型。如图 4A 所示，为进行体外研究，接种于95-孔板的84-32细胞(表达腺病毒血清型E4的293细胞) 以每细胞1 X IO4GC的感染复数(MoI)用假型AAVCMVEGFP载体感染。感染后48小时使用紫外显微镜将相对EGFP转导效率估计为绿色细胞的百分比并显示在Y轴上。为进行体内研究，分别经门内(intraportal)(图4B)、气管内(图4C)和肌肉内(图4D)以每只动物 1 X IO11GC的剂量给予NCR裸鼠周龄)的肝(图4B)、肺(图4C)和肌肉(图4D)以表达分泌的报道基因AlAT的载体。在基因转移后第观天比较血清AlAT水平(ng/ml)并示于Y轴上。X轴表示所分析的AAV与它们所属的进化支。发明详述
在任何用于治疗或预防的载体库中，为所需应用选择载体源，需要能将大分子携带至靶细胞的各种不同载体。迄今为止，关于将AAV用作载体的一个问题是缺乏各种不同的病毒来源。本发明通过提供AAV的进化支来克服该问题，所述进化支用于选择系统发生相关的(或选择治疗方案所需的)，或系统发生不同的AAV并用于预测功能。本发明还提供新的AAV病毒。当术语“基本同源性”或“基本相似性”指核酸或其片段时意味着当合适的核苷酸插入物或缺失物与另一核酸(或其互补链)最佳对比时，对比序列中至少约95%到99%的核苷酸序列同一性。优选在全长序列、或其开放读框、或另一至少长15个核苷酸的合适片段上具有同源性。合适片段的例子描述于本文。文中用于核酸序列的术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”指当对比最大一致性时，两条序列中的残基相同。序列同一性比较的长度可是基因组全长、基因编码序列的的全长，或需要至少约500到5000个核苷酸的片段。然而，较小片段中的同一性也是需要的，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20到M个核苷酸、至少约28到32 个核苷酸、至少约36或更多个核苷酸的片段。类似地，氨基酸序列、蛋白全长、或其片段的 “序列同一性百分比”可容易地确定。合适片段的长度至少约8个氨基酸，也可达约700个氨基酸。合适片段的例子描述于文中。当术语“基本同源性”或“基本相似性”指氨基酸或其片段时意味着当合适的氨基酸插入物或缺失物与另一氨基酸(或其互补链)最佳对比时，对比序列中至少约95%到 99%的氨基酸序列同一性。优选在全长序列，或其蛋白质(例如，cap蛋白、r印蛋白)，或其至少8个氨基酸，或更希望至少15个氨基酸长度的片段上具有同源性。合适片段的例子描述于本文。术语“高度保守的”表示至少80%的同一性、优选至少90%的同一性、更优选超过 97%的同一性。本领域的技术人员可凭借本领域技术人员已知的算法和计算机程序容易地
确定同一性。—般当提及在两种不同的腺伴随病毒之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时， “同一性”、“同源性”或“相似性”是参考“对比”的序列确定的。“对比”的序列或“对比”指多核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，与参考序列相比，该序列通常含有缺失的或附加的碱基或氨基酸的校正。在实施例中，使用公开的AAV2或AAVl序列作为参考点进行AAV对比。然而，本领域的技术人员可容易地选择另一 AAV序列作为参考。可使用任何各种公用或市售可得的多序列对比程序进行对比。这种程序的例子包括通过因特网的万维服务器可得的“Clustal W”、“CAP序列组件”、“MAP”和“MEME”。这种程序的其它来源是本领域技术人员已知的。或者也可使用VectorNTI实用程序。许多本领域已知的算法，包括包含在上述程序中的算法也可用于测量核苷酸序列同一性。使用GCG6. 1 版中的程序hsta 来比较多核苷酸序列是另一个例子。hsta 提供在查询和检索序列之间最佳重叠区域的对比和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可使用GCG6. 1版提供的具有默认参数的i^staTM(字长为6和用于计分矩阵的NOPAM系数) 来确定，该程序纳入本文引作参考。多序列对比程序也可应用于氨基酸序列，例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME” 和"Match-Box” 程序。虽然本领域的技术人员可视需要改变这些设置，但通常这些程序以默认设置使用。或者，本领域的技术人员可利用另一种算法或计算机程序，该算法或程序提供的同一性或算法的水平至少同参考的算法和程序提供的一样。参见，例如J. D. Thomson等，Nucl. Acids. Res.，“多序列对比的综合比较，，(A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignments)，27 (13) 2682-2690(1999)。术语“血清型”区分具有在血清学上不同于其它AAV血清型的一种衣壳的AAV。血清学特殊性是基于与其它AAV相比，针对AAV的抗体之间缺乏交叉反应性来确定。交叉反应性通常在中和抗体试验中测定。就该试验而言，使用腺伴随病毒在家兔或其它合适的动物模型中产生抗特异性AAV的多克隆血清。然后在该试验中测试所产生的抗特异性AAV的血清中和相同(同源)或异源AAV的能力。达到50%中和作用的稀释度看作中和抗体滴度。如果就两种AAV而言，倒数形式的异源滴度除以同源滴度的商小于16，则此两种AAV可视为是相同的血清型。相反，如果倒数形式的异源滴度与同源滴度之比是16 或更大，此两种AAV视为是不同血清型。如本文所定义，为形成血清型9，所产生针对所选AAV衣壳的抗体必须与AAVl、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8中任一种不交叉反应。在一个实施方案中，本发明提供一种在本文中鉴定为人AAV血清型9的新血清型的AAV衣壳。本说明书与权利要求书使用的术语“含有”和“包括”是包括其它成分、元素、整数、 步骤等在内。相反，术语“由...组成”和其变体不包括其它成分、元素、整数、步骤等在内。1.进化支在一方面，本发明提供了 AAV的进化支。进化支是基于AAV vpl氨基酸序列对比， 使用自引值为至少75% (至少1000次复制)的邻接启发式算法与不大于0.05的泊松校正距离测量值确定为互相系统发生相关的一组AAV。邻接算法详细描述于参考文献。参见，例如M. Nei与S. Kumar,《分子进化与系统发生学》(Molecular Evolution and Phylogenetics)(牛津大学出版社，纽约 Q000)。计算机程序可用于执行该算法。例如，MEGA v2.1程序执行改进的Nei-Gojobori方法。使用这些技术与计算机程序，AAV vpl衣壳蛋白的序列，本领域的技术人员可容易地确定所选择的AAV是否包含在文中所鉴定的一种进化支内、另一种进化支内、或在这些进化支之外。虽然本文所定义的进化支主要基于天然的AAV vpl衣壳，这些进化支不限于天然的AAV。这些进化支可包括非天然AAV，包括(但不限于)重组、修饰、嵌合、杂交、合成、人工的等，基于AAV vpl氨基酸序列对比，使用自引值为至少75% (至少1000次复制)的邻接启发式算法与不大于0. 05的泊松校正距离测量值确定为系统发生相关的AAV。本文所述的进化支包括进化支A(以AAVl和AAV6表示)、进化支B(以AAV2表示)、进化支C (以AAV2-AAV3杂交体表示)、进化支D (以AAV7表示)、进化支E (以AAV8表示)与进化支F(以人AAV9表示)。这些进化支以前文所述AAV血清型的进化支的成员代表。前文所述的AAVl和AAV6是单一进化支(进化支A)的成员，该进化支中4种分离物回收自3种人。前文所述AAV3和AAV5血清型明显相互不同，但在本文所述的筛选中未检测到，并且未包括于任何这些进化支中。进化支B(AAV2)和进化支C(AAV2-AAV3杂交体)是在人中发现的AAV最丰富的 (AAV2有22种分离物来自12种个体，进化支C有17个分离物来自8种个体)。大量的序列分组于进化支D (AAV7)或进化支E (AAV8)。有趣的是，这些进化支普遍存在于不同物种中。进化支D对恒河猴与南美弥猴是独特的，具有分离自10种不同动物的 15个成员。由于进化支E在人和非人灵长类中发现，它是令人感兴趣的9种分离物回收自 7种人而21种分离物得自9种不同的非人灵长类，包括恒河猴、狒狒和豚尾弥猴(pigtail monkey)。在其它两种动物中证实了某些序列的杂交特性，虽然在该情况中所有的序列似乎具有起源于两种协同感染病毒(在两种动物中是进化支D与进化支E病毒)的独立而不同的重组。这些重组体无一在其它动物或受试对象中鉴定到。因为进化支C(AAV2_AAV3杂交体)在6种不同的人对象中鉴定到，重组甚至导致了合适的后代。另一方面，就AAV7-AAV8杂交体而言，仅有少数重组情况涉及AAV进化。这些重组情况说明AAV能重组，从而产生框内基因以及在一些情况中产生可包装和/或感染性衣壳结构。另一方面，进化支C(AAV2-AAV3杂交体进化支)是一组通过重组获得选择性优点的病毒，这种重组使它们忍受环境压力。A.进化支A (以AAVl禾Π AAV6表示)在另一方面，本发明提供进化支Α，其特征在于含有前文公开的AAVl和AAV6。 参见，例如2000年5月18日的国际
发明者G·高, J·M·威尔森, L·H·范登伯格, M·R·阿尔维拉 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会