专利名称：一株高自溶度乳酸菌及其在干酪中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株高自溶度乳酸菌及其在干酪中的应用。
背景技术：
细菌自溶是指菌体细胞在一定的条件，自身释放可水解细胞壁肽聚糖网络状结构的自溶酶，这些酶的表达导致了细菌细胞壁质的溶解和消失，形成一个细胞内物质向周围环境释放的过程。蛋白质水解是在干酪成熟中发生最基本的生化反应中最复杂的一种，Law 研究表明在未成熟干酪中发酵剂自溶速率和自溶度与蛋白水解呈正相关，且对切达干酪的风味形成有积极作用，在成熟期间残余的凝乳酶以及发酵剂菌株自溶释放胞内蛋白酶、肽酶等继续对蛋白产生一定作用，小肽及氨基酸混合物将直接影响干酪的味道和口感。在成熟期间残余的凝乳酶以及发酵剂菌株自溶释放胞内蛋白酶、肽酶等继续对蛋白产生一定作用，使释放的酶类对凝乳酶分解酪蛋白后产生的多肽进行进一步降解，并使凝块的硬度，弹性产生一定变化，如果制作干酪时只加凝乳酶，其成熟过程中Ph4. 6时只含可溶性氮很少(有小肽和氨基态氮)，相反加入发酵剂和凝乳酶的干酪含有相对大量的游离态氮，释放游离氨基酸，因而选择快速自溶的发酵剂菌种是加速成熟的方法，选用具有选择性的发酵剂或经遗传修饰的发酵剂生产干酪具有较强的应用前景。各种干酪中微生物菌群组成的不同，蛋白质水解的程度和速度也不同。6个月成熟的切达干酪(次生菌群相对简单)中游离氨基酸的氮只占总氮的3%。在干酪成熟过程中发酵剂对蛋白质水解这一过程的重要性因次生菌群、霉菌、表面菌或乳酸菌产生蛋白酶和肽酶的量不同而不同。酶的专一性决定了肽产生的氨基酸含量，因此对干酪的风味形成具有重要作用；例如疏水性肽超过一定浓度阈值可能会产生苦味干酪。乳球菌和乳杆菌的蛋白酶系统包括胞外蛋白酶以及胞内蛋白酶，而乳杆菌对蛋白水解有贡献的极有可能是胞内酶的作用，为了加速干酪成熟以及提高风味，已有许多将乳杆菌作为附属发酵剂加入到切达干酪中的报道，如Harmon等人将快速自溶的瑞士乳杆菌作为附属发酵剂添加制作切达干酪，可以加速干酪成熟且切达干酪风味强烈。嗜热乳杆菌单独或与嗜热乳链球菌混合做发酵剂，与乳酸乳球菌的水解效果很相近，且嗜热乳杆菌从干酪成熟期一开始就发生自溶。发酵剂和非乳酸菌发酵剂在干酪的制作和成熟阶段影响很大。对于切达干酪而言，其成熟期较长，成本较高，若能缩短成熟期，将具有一定的经济效益。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种副干酪乳杆菌(LactcAacillus paracasei) LBl。本发明提供了副干酪乳杆菌(LactcAacillus paracasei) LB1，保藏编号为 CGMCCNo. 4644。所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644在促进干酪蛋白质水解中的应用也是本发明保护的范围。所述促进干酪蛋白质水解体现在提高干酪pH4. 6可溶性氮含量和/或12 % (质量百分含量)三氯乙酸可溶性氮含量。所述促进干酪蛋白质水解具体为加入副干酪乳杆菌(LactcAacillus paracasei) LB1CGMCC No. 4644得到的干酪的pH4. 6可溶性氮含量和/或12% (质量百分含量)三氯乙酸可溶性氮含量高于不加入副干酪乳杆菌(Lactobacillu sparacasei) LBlCGMCCNo. 4644 得到的干酪。本发明的另一个目的是提供一种制备干酪的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤向原料乳中加入所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和发酵剂，进行培养，得到干酪。所述发酵剂为R704。上述发酵剂R704购自CHR HANSEN,产品目录号为100096，其为 Lactococcuslactis sub sp. cremoris 禾口 Lactococcus lactis subsp. Iactis 的冻干粉；所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 是通过如下凝乳加入所述原料乳中用副干酪乳杆菌(LactcAacillus paracasei) LB1CGMCC No. 4644 发酵脱脂乳得到的凝乳；所述用副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644发酵脱脂乳得到凝乳按照包括如下步骤的方法进行将副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei) LBl CGMCC No. 4644在脱脂乳培养基中发酵，得到凝乳。所述原料乳、所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 和所述 R704 的配比为 ikg (ixio6-ixio7)cfu (ο. ι-ο. 15)υ ；所述原料乳、所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) LBl CGMCC No. 4644 和 R704 的配比具体为 Ikg (1 X 106、5 X IO6 或 1 X IO7) CFU (0. 1、0. 12 或 0. 15)U。所述副干酪乳杆菌培养的温度为30°C _32°C，所述副干酪乳杆菌培养的温度具体为 30°C、31°C或 32°C ；所述副干酪乳杆菌培养的时间为5_6h，所述培养的时间具体为5h、5.证或他；所述发酵的温度为35°C _37°C，所述发酵的温度具体为37°C ；所述发酵时间为36h_48h，所述发酵时间具体为48h ；每IL脱脂乳培养基按照如下方法制备将IOOg脱脂乳粉溶于少量蒸馏水中，用蒸馏水补充至1L，得到的培养基。由上述的方法生产得到的干酪也是本发明保护的范围。本发明第三个目的是提供一种制备干酪的组合物，由副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei) LB1CGMCC No. 4644 和发酵剂组成。所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei) LBl CGMCC No. 4644 和所述发酵剂的配比为(ixio6-IXIO7)CFU (ο. ι-ο. 15)υ ；所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei) LBl CGMCC No. 4644 和所述发酵剂的配比具体为(1X106、5X106或1X107)CFU (0. 1、0. 12 或 0. 15)U ；所述发酵剂和所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644 均为独立包装。
所述发酵剂为R704 ；所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 是通过如下凝乳体现在所述菌剂中用副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644 发酵脱脂乳得到的凝乳；所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 发酵产物按照如下方法制备将副干酪乳杆菌(LactcAacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644在脱脂乳培养基中发酵，得到凝乳。所述发酵的温度为35°C _37°C，所述发酵的温度具体为37°C ；所述发酵时间为36h_48h，所述发酵时间具体为48h ；每IL脱脂乳培养基按照如下方法制备将IOOg脱脂乳粉溶于少量蒸馏水中，用蒸馏水补充至1L，得到的培养基。菌株LBl已于2011年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 4644，分类命名为副干酪乳杆菌(LactcAacillus paracasei)。本实验的实验证明，本发明发现一株高自溶度的副干酪乳杆菌LB1，将其作为附属发酵剂添加至干酪，结果发现副干酪乳杆菌LBl得到的干酪脂肪含量高，在pH4. 6SN和12% TCA SN的含量高，可有效提高蛋白分解程度，成熟周期短，可以节约贮藏成本。
图1为菌株的自溶度图2为成熟期间各干酪中乳酸菌总数变化图3为成熟期间pH值变化图4为干酪在成熟期内非酪蛋白氮含量的变化图5为干酪在成熟期内非蛋白氮含量的变化
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。分离培养基(MRS琼脂培养基)蛋白胨lO.Og、牛肉膏lO.Og、酵母浸出粉5.0g、葡萄糖20. 0g、醋酸钠5. 0g、磷酸氢二钾2. 0g、柠檬酸二铵2. 0g、吐温-80 lg、硫酸镁0. 58g、 硫酸锰0. 25g、碳酸钙5. 0g，使用蒸馏水定容至IOOOmL,加入1. 2% 1. 5%琼脂，121°C灭菌 15min。MRS计数培养基蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、酵母浸出粉5. 0g、葡萄糖20. 0g、醋酸钠5. 0g、磷酸氢二钾2. 0g、柠檬酸铵2. 0g、吐温-80 lg、硫酸镁0. 2g、硫酸锰0. 54g,使用蒸馏水定容至IOOOmLdjffpHG. 5，加入1. 2%~ 1. 5%琼脂，121°C灭菌15min牛肉膏购自北京奥博星生物技术有限公司，产品目录号为01-009。酵母浸出粉购自北京奥博星生物技术有限公司，产品目录号为01-012。MRS肉汤培养基(购自北京路桥技术有限公司，产品目录号CM187)。
实施例1、菌株的分离及鉴定、特性1、菌株的分离1)、样品稀释液的制备及细菌分离用Iml无菌枪头吸取样品液(来自于传统发酵制品(酸奶)，来源于内蒙古省。)1ml，放入9ml灭菌生理盐水中，震荡混勻即成KT1稀释液。依次类推，连续稀释至10_8。 在10-6、10_7、10-8梯度分别吸Iml稀释液至于培养皿中，并到入45°C左右MRS琼脂培养基， 混勻。37°C培养48h。2)、菌株初步纯化用接种针挑取平皿表面及底部圆形或梭形的乳酸菌疑似单菌落，在MRS平板培养中划线接种，37°C培养48h。3)、革兰氏染色挑取单菌落，做革兰氏染色实验，在光学显微镜下观察并记录现象。将革兰氏阳性菌平板纯化四代，镜检后转斜面贮藏，分离得到菌株LBl。2、菌株的耐酸和耐盐特性将供试菌株LBl以2%的量分别接入pH为3、4、5、6的灭菌MRS肉汤培养基(检测耐酸性)以及氯化钠浓度分别为0^,2% ,4^,6% ,8^,10%的灭菌MRS肉汤培养基(检测耐盐性)中，于37°C恒温培养Mh，观察其生长情况。结果如表1、表2。菌株耐盐性如下表1耐盐性试验
权利要求
1.副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LBl，保藏编号为 CGMCC No. 4644。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644在促进干酪蛋白质水解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述促进干酪蛋白质水解体现在提高干酪PH4. 6可溶性氮含量和/或12% (质量百分含量)三氯乙酸可溶性氮含量。
4.一种制备干酪的方法，包括如下步骤向原料乳中加入权利要求1所述的副干酪乳杆菌(LactcAacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和发酵剂，进行培养，得到干酪。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于 所述发酵剂为R704 ；所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644是通过如下凝乳加入所述原料乳中用副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644发酵脱脂乳得到的凝乳；所述用副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644发酵脱脂乳得到的凝乳按照包括如下步骤的方法进行将副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644在脱脂乳培养基中发酵，得到凝乳。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述原料乳、所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和 R704 的配比为 Ikg (1 X 106-1 X 107) CFU (0. 1-0. 15) U ；所述原料乳、所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和 R704 的配比具体为 Ikg (1X106、5X106或1X107)CFU: (0. 1、0. 12 或 0. 15)U。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述培养的温度为30°C _32°C，所述培养的温度具体为30°C、31°C或32°C ； 所述培养的时间为5-6h，所述培养的时间具体为5h、5.证或他； 所述发酵的温度为35-37°C，所述发酵的温度具体为37°C ； 所述发酵时间为36h-48h，所述发酵时间具体为48h ；每IL脱脂乳培养基按照如下方法制备IOOg脱脂乳粉溶于少量蒸馏水中，用蒸馏水补充至1L，得到的培养基。
8.由权利要求4-7中任一所述的方法生产的干酪。
9.一种制备干酪的组合物，由权利要求1所述的副干酪乳杆菌 (Lactobacillusparacasei)LBlCGMCC No. 4644 和发酵剂组成。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) LBl CGMCC No. 4644和所述发酵剂的配比为(IXIO6-IXIO7)CFU (ο. ι-ο. 15)υ ；所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) LBl CGMCC No. 4644和所述发酵剂的配比具体为(1X106、5X106或1X107)CFU (0. 1、0. 12 或 0. 15)U ；所述发酵剂和所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644均为独立包装；所述发酵剂为R704。
全文摘要
本发明公开了一株高自溶度乳酸菌及其在干酪中的应用。本发明提供了一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB1，保藏编号为CGMCC No.4644。还提供一种制备干酪的方法，包括如下步骤向原料乳中加入所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB1 CGMCC No.4644和发酵剂，进行培养，得到干酪；本发明发现一株高自溶度的副干酪乳杆菌LB1，作为附属发酵剂添加至干酪，结果发现副干酪乳杆菌LB1得到的干酪脂肪含量高，成熟周期短，可以节约贮藏成本。
文档编号C12N1/20GK102181393SQ20111008968
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月11日 优先权日2011年4月11日
发明者刘鹭, 吕加平, 孙卓, 孙洁 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所