专利名称：一株耐高温石蜡降解菌及其在清防蜡中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于石油微生物领域，具体涉及ー株具有清防蜡功能的菌株及其在清防蜡中的应用。
背景技术：
对于溶有一定量石蜡的原油，在开采过程中，随着温度、压カ的降低和气体的析出，溶解的石蜡便以结晶体析出、长大聚集并沉积在管壁等固相表面上，即出现所谓的结蜡现象。结蜡会堵塞产油层，降低油井产量，同时也会増大油井负荷，造成生产事故。在含蜡原油的开采过程中，虽然可采用各类防蜡方法，但油井仍不可避免地存在有蜡沉积的问题。 蜡沉积严重地影响着油井正常生产，所以必须采取措施将其清除。目前，油井常用的清蜡方法有机械清蜡、热カ清蜡、化学清蜡等。清防蜡技术就是根据原油物性及油井开采状况的复杂性，并根据不同区块、不同油井、区块开采的不同时期以及油井结蜡状况的不同，为清蜡、阻止蜡沉积而采取的一种有效的エ艺。微生物清防蜡技术则是针对原油含蜡的特点以及结蜡机理，筛选合适的细菌组合注入井筒，利用微生物细菌及其代谢产物的作用，阻止石蜡结晶，防止或缓解井筒结蜡，达到代替或逐渐替代传统清防蜡措施的目的。目前，虽然国内外已经分离筛选出大量的石油降解菌株，但是耐高温高效的石蜡降解菌株却不多见，这也是开发利用微生物技术进行清防蜡エ艺的最大障碍，在实际应用中受到很大的限制，所以开发高效清防蜡菌株具有重要的创新性和应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前缺少耐高温高效的石蜡降解菌株的问题，而提供一株耐高温石蜡降解菌及其在清防蜡中的应用。本发明的耐高温石腊降解菌为微杆菌(Microbacterium sp. ) JNS02,保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO M 2012022。本发明微杆菌JNS02是从大庆油田被原油污染的水样中经分离、纯化获得。该微杆菌JNS02在LB平板上生长I天形成直径约I 3mm的菌落，菌落圆形，凸起，表面湿润，边缘整齐，半透明。单细胞，呈短杆状，革兰氏阳性。呼吸代谢，产荧光、不产生H2S、吲哚、甲基红；具有硝酸盐还原性和反硝化能力，具有液化明胶能力，能利用葡萄糖、蔗糖。本发明的的耐高温石腊降解菌,它为微杆菌sp. )JNS02,其16SrDNA 基因序列參照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology))VoI. VtO 内容，根据其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通过NCBI BLASTn程序比对，本发明微杆菌JNS02与Microbacterium sp. A95的16S rDNA基因序列同源为99%，因此鉴定本发明的菌株为微杆菌属的ー个新菌种。本发明的耐高温石腊降解菌,它为微杆菌iMi crobac teri um sp. ) JNS02,属于微杆菌属(#icrc^aci6 riw ),保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2012年2月16日，保藏编号为CCTCC NO M 2012022。本发明微杆菌NS02能够使凝固在管壁等固体上的石蜡溶解成网状并剥离，并且剥离下的固体石蜡变软或已经溶解，经测定，清蜡率可达59%。因此，该微杆菌JNS02可用于油田生产过程中的清蜡操作，也可用于防止结蜡情况的发生。本发明微杆菌JNS02能够在3(T70°C条件下生长，在70°C时菌液的OD62tl仍可达到O. 42，该菌株能够适应较高及较广的温度范围，因此该菌株的耐高温性能使其在油田的实际生产中具有广泛的应用价值。
图I为微杆菌JNS02在不同温度条件下的生长情況。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的耐高温石腊降解菌为微杆菌
sp. XJNS02，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO M 2012022。该微杆菌JNS02在LB平板上生长I天形成直径约I 3mm的菌落，菌落圆形，凸起，表面湿润，边缘整齐，半透明。单细胞，呈短杆状，革兰氏阳性。呼吸代谢，产荧光、不产生H2S、吲哚、甲基红；具有硝酸盐还原性和反硝化能力，具有液化明胶能力，能利用葡萄糖、蔗糖。该微杆菌JNS02是从大庆油田被原油污染的水样中经分离、纯化获得。具体步骤如下取被原油污染的水样5ml加入50ml含有质量体积比为1%的原油的液体无机盐基本培养基中，在30°C、转速200r/min条件下震荡培养7天，然后以10%的体积比的接种量接种到新的含有质量体积比为1%的原油的液体无机盐基本培养基中，在30°C、180r/min条件下震荡培养7天，再继续转接，重复这ー过程3 5次。将培养的菌液稀释1000000倍涂布到含有质量体积比为I. 6%的琼脂LB固体培养基上，30°C条件下静止培养36小吋。选取长出的单菌落继续接50ml含有质量体积比为1%的原油的液体无机盐基本培养基中，在30°C、180r/min条件下震荡培养7天，筛选能够利用原油作为唯一碳源和能源生长的菌株，最終获得ー株降解能力较好的菌株。经过稳定性实验表明，该菌株具有非常高的稳定性，连续培养后降解原油的能力没有降低。所述的无机盐培养基的配方为=KH2PO4 O. 5g/L, K2HPO4 4 g/L，NH4Cl I g/L，质量百分比为1%的CaCl2 2 ml/L，质量百分比为10%的MgCl2 · 6H20 2 ml/L，质量百分比为1%的FeCl3 200 μ 1/L，维生素混合液200 ml/L，离子混合液5 ml/L，配制好后在121で条件下灭菌20 mirio所述的离子混合液的配方为姆升蒸懼水含有=ZnCl2 O. 5g, FeCl2 0.5 g,MnCl2 · 4H20 O. 5g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg, CuCl2 · 2H20 0. 05g, Na2WO4 · 2H20 0. 05g, HCl 120mmol/Lo所述的维生素混合液的配方为姆升蒸懼水含有400 mg泛酸 丐,200 mg肌醇，400 mg尼克酸/畑酸，400 mg VB6,200 mg对氨基苯甲酸，O. 5 mg VB12。所述的LB培养基配方为1升蒸懼水中含10g蛋白胨,5g酵母粉，IOg Nacl ;固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为I. 6%的琼脂粉，在121で条件下灭菌20分钟。将上述菌株进行16S rDNA基因提取并测序，其基因序列长度为1452 bp，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。该菌株的16S rDNA基因序列參照《Bergey’ s Mannual ofSystematic Bacteriology)) Vol. VtO内容,根据其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通过NCBI BLASTn程序比对,本实施方式的菌株与#icroAacteritt sp. A95的16S rDNA基因序列同源为99%，鉴定本发明的菌株为微杆菌属的ー个新菌种，并将其命名为微杆菌{Mi crobac teri um sp.)JNS02o具体实施方式
ニ 本实施方式将具体实施方式
一的微杆菌
sp. ) JNS02用于清蜡实验，具体步骤如下实验组将ー小段钢管的表面包裹固体石蜡，然后放入装有微杆菌JNS02发酵液的三角瓶中，静置培养36小吋。对照组将ー小段钢管的表面包裹固体石蜡，然后放入装有蒸馏水的三角瓶中，静置培养36小吋。实验结果见表I。通过观察实验结果及表I中的数据可知，空白组的钢管上的石蜡基本没有变化，清蜡率仅 为2. 4%，基本可以忽略，而浸泡在微杆菌JNS02发酵液中的钢管上包裹的固蜡已经呈网状，有的固体石蜡已经剥离，并且剥离下的固体石蜡变软或已经溶解，经测定，清蜡率可达59%。因此，该微杆菌JNS02可用于油田生产过程中的清蜡操作，也可用于防止结蜡情况的发生。表I清蜡实验結果。
m试驗次数1ig)声用前后固体<g> 細率
杆菌 INS02 I 2J39IJMl59%
2umI·545%
33.m1J2849J%
—空 __I__2-7 __2703__2Λ%_具体实施方式
三本实施方式对具体实施方式
一的微杆菌sp.)JNS02在不同温度下的生长情况进行了測定，实验具体步骤如下(I)斜面培养将微杆菌JNS02接种于含有质量体积比为I. 5%的琼脂的LB固体培养基中，在30°C条件下，静止培养24h；(2)种子培养将步骤(I)中培养的菌株在无菌条件下用接种环接I 2环于5ml液体培养基中，在30°C条件下，振荡培养12h，将培养物用无菌的O. 85%生理盐水洗涤三次，制得种子液；(3)将步骤(2)中制得得种子液按照5%接种量接种到IOml含有2% (w/v)柴油的无机盐培养基中，在30°C、37 °C、40 V、45 °C、50 V、55 °C、60 V、65 V和70 V条件下，振荡培养24h，測定620nm吸光度，实验结果见图I。所述的无机盐培养基及LB固体培养基的配方同具体实施方式
一。由图I中的实验结果可知，微杆菌JNS02能够在3(T70°C条件下生长，最适生长温度为45°C，在此温度下OD62tl达到I. 5 ;随着温度的升高生长变慢，但在70°C时OD62tl仍可达到O. 42，说明微杆菌JNS02能够适应较高及较广的温度范围，因此该菌株的耐高温性能使其在油田的实际生产中具有广泛的应用价值。
权利要求
1.一株耐高温石腊降解菌，该菌株为微杆菌sp. )JNS02,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012022。
2.如权利要求I所述的耐高温石蜡降解菌在清防蜡中的应用。
全文摘要
一株耐高温石蜡降解菌及其在清防蜡中的应用。属于石油微生物领域。它解决了目前缺少耐高温高效的石蜡降解菌株的问题。本发明耐高温石蜡降解菌为微杆菌(Microbacteriumsp.)JNS02，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNOM2012022。本发明微杆菌NS02的清蜡率可达59%，并能够在30~70℃条件下生长，能够适应较高及较广的温度范围，因此该菌株的耐高温性能使其在油田的实际生产中具有广泛的应用价值。
文档编号C12R1/01GK102660475SQ20121013727
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者盖忠辉, 蒋立民 申请人:黑龙江吉纳森生物工程股份有限公司