专利名称：一种激光显微切割染色体标本制作液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于染色体激光显微切割技术领域，具体涉及一种激光显微切割染色体标本制作液及其应用。
背景技术：
染色体切割的方法目前可以分为两种，即显微玻璃针分离法和激光切割法。显微玻璃针分离法是借助显微操作仪，在显微镜下用尖端直径约2微米的玻璃针对完整的目标染色体或者目标带纹区段进行切割和分离。该技术使用范围广泛，但是需要调节性能好、放大倍数足够大的显微操作仪，而且要求实验者要有非常高的操作技术。激光切割法是利用热效应较低的波长为340 355nm的激光微束，通过计算机控制其轨迹，切割目标染色体。 与玻璃针切割法相比，该方法精确、高效、操作方便、容易掌握。但是到目前为止，激光显微切割系统更多的是被用于各种细胞及组织的切割分离，而对于染色体的显微切割，却仅有很少的研究报道。究其原因，大多数的激光显微切割系统在进行显微切割时，采用了特殊的专用表面覆膜载玻片，而在这种载玻片上制备出形态好、数量多且能够用于切割的染色体分裂相具有很大的难度。目前进行激光显微切割的染色体制备，仍然在使用通用的制片方法，因此迫切需要从染色体标本的制作液等方面进行改进，以方便进行染色体激光显微切割操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种激光显微切割染色体标本制作液及其应用，即提供一种有效的激光显微切割染色体标本制作液，并建立了一种新的染色体标本制备技术，使用该技术在激光显微切割系统所使用的专用表面覆膜载玻片上制备的分裂相，染色体分散得很好，完全适合于进行染色体显微分离。本发明的激光显微切割染色体标本制作液，其特征在于，所述的标本制作液包含有甲醇、冰醋酸和氯仿，其体积比为5 10 1 3 1 3。上述的标本制作液中甲醇、冰醋酸和氯仿的体积比优选为8 1 1。本发明的染色体标本制作液在制备激光显微切割染色体标本中的应用，包括有1) 染色体的制备和2、制片两个步骤其中1)染色体的制备步骤如下a、将实验样品通过酶消化或物理破碎的方法制成细胞悬液，用0. 005%秋水仙素处理1. 5小时；b、将a中样品离心收集后，用0. 075M的KCL低渗溶液低渗处理30分钟；C、将b中处理后的样品再次离心收集，用卡诺固定液固定3次，每次20分钟，最后一次固定后置于-20°C中存放；d、制片前，将c中的样品离心收集，重新悬浮于染色体标本制作液中，细胞浓度约为1 X IO6左右，制成染色体标本工作液；
步骤2)制片具体步骤如下e、将激光显微切割表面覆膜载玻片置于紫外灯下照射30分钟；f、然后将e中处理过的载玻片置于染色体标本制作液中浸泡1分钟；g、用吸管吸取少量d中的染色体标本工作液，在距离玻片上方IOcm处垂直滴下一至几滴，待膜上的染色体样品在空气中完全干燥后，使用经0. 2 μ m滤膜抽滤后的Giemsa染液染色10分钟，再用超纯水冲洗掉多余的染液，空气中完全干燥即制得激光显微切割染色体标本。本发明的染色体标本制作液制备的激光显微切割染色体标本，各条染色体均分散得很好，方便后续的显微切割操作。同时本发明的制备方法简单实用，易于操作，方便普通技术人员的使用。
图1 使用不同的制片方法得到的半滑舌鳎染色体标本的分裂相。A，使用本发明的染色体标本制作液(比例为8 1 1)制备的染色体标本；B，使用通用的染色体制片方法制备的染色体标本；C，使用本发明的染色体标本制作液(比例为5 1 幻制备的染色体标本；D，使用本发明的染色体标本制作(比例为10 2 1)制备的染色体标本。图2 以切割分离的半滑舌鳎W染色体的PCR产物为探针进行的染色体荧光原位杂交结果，箭头所示为W染色体。
具体实施例方式下面结合半滑舌鳎雌鱼W染色体切割为例对本发明的染色体标本制作液和制备方法进行详细的描述(1)、染色体的制备①、取半滑舌鳎的头肾组织通过物理破碎的方法制成细胞悬液，用0. 005%秋水仙素处理1. 5小时；②、细胞离心收集后，用0. 075M的KCL低渗溶液低渗处理30分钟；③、再次离心收集，用卡诺固定液(无水己醇冰醋酸=3 1)固定3次，每次20 分钟，最后一次固定后置于-20°C中存放；④、制片前，将细胞离心收集，重新悬浮于激光显微切割染色体标本制作液中，细胞浓度约为IXlO6左右，制成染色体标本工作液。O)、制片①、将切割专用表面覆膜载玻片置于紫外灯下照射30分钟；②、然后置于激光显微切割染色体标本制作液中浸泡1分钟；③、用吸管吸取少量染色体标本工作液，在距离玻片上方IOcm处垂直滴下一至几滴，待膜上的染色体样品在空气中完全干燥后，使用经0. 2 μ m滤膜抽滤后的Giemsa染液染色10分钟，再用超纯水冲洗掉多余的染液，空气中完全干燥。显微镜下观察制片效果，发现染色体分散得非常好，很少有染色体相互重叠的情况出现，可以顺利的进行染色体的显微切割分离(图1A)。④、对照组的设定按照通用的制片方法，用吸管吸取少量含有染色体材料的卡诺固定液直接滴在表面覆膜载玻片上，待样品在空气中完全干燥后，Giemsa染液染色10分钟，显微镜下观察制片效果。经观察发现，染色体分散的效果非常不好，几乎所有的分散相中染色体均有相互重叠的情况出现，无法进行激光显微切割(图1B)。⑤、不同比例的染色体标本制作液的效果比较本发明对染色体标本制作液中甲醇、冰醋酸和氯仿的比例进行了筛选，经显微镜观察发现，8 1 1的标本制作液具有最好的效果，而其他比例的染色体标本制作液的制片效果都没有8 1 1比例的好，出现了染色体相互重叠(图1)。(3)、激光显微切割利用激光显微切割系统对制好的染色体标本进行显微切割分离，共分离得到40 条半滑舌鳎的W染色体。使用DOP-PCR方法扩增得到了大量的PCR产物，经染色体荧光原位杂交实验验证了这些产物为W染色体的部分片段(图2箭头所示)，证实了该制作液及激光显微切割方法对染色体切割分离的有效性。
权利要求
1.一种激光显微切割染色体标本制作液，其特征在于，所述的标本制作液包含有甲醇、 冰醋酸和氯仿，其体积比为5 10 1 3 1 3。
2.如权利要求1所述的标本制作液，其特征在于上述的标本制作液中甲醇、冰醋酸和氯仿的体积比为8 1 1。
3.权利要求1或2所述的染色体标本制作液在激光显微切割染色体标本制备中的应用。
4.权利要求3所述的激光显微切割染色体标本制备，包括有1)染色体的制备和2)制片两个步骤，其中1)染色体的制备步骤如下a、将实验样品通过酶消化或物理破碎的方法制成细胞悬液，用0.005%秋水仙素处理 1. 5小时；b、将a中样品离心收集后，用0.075M的KCL低渗溶液低渗处理30分钟；c、将b中处理后的样品再次离心收集，用卡诺固定液固定3次，每次20分钟，最后一次固定后置于-20°C中存放；d、制片前，将c中的样品离心收集，重新悬浮于染色体标本制作液中，细胞浓度为 1 X IO6,制成染色体标本工作液；步骤2)制片具体步骤如下e、将激光显微切割表面覆膜载玻片置于紫外灯下照射30分钟；f、然后将e中处理过的载玻片置于染色体标本制作液中浸泡1分钟；g、用吸管吸取少量d中的染色体标本工作液，在距离玻片上方IOcm处垂直滴下一至几滴，待膜上的染色体样品在空气中完全干燥后，使用经0. 2 μ m滤膜抽滤后的Giemsa染液染色10分钟，再用超纯水冲洗掉多余的染液，空气中完全干燥即制得激光显微切割染色体标本。
全文摘要
本发明涉及一种激光显微切割染色体标本制作液及其应用，所述的标本制作液包含有甲醇、冰醋酸和氯仿，其体积比为5～10∶1～3∶1～3，优选比例为8∶1∶1。本发明的染色体标本制作液用于制备激光显微切割染色体标本。本发明的染色体标本制作液制备的激光显微切割染色体标本，各条染色体均分散得很好，方便后续的显微切割操作。同时本发明的制备方法简单实用，易于操作，方便普通技术人员的使用。
文档编号C12Q1/68GK102251024SQ201110100728
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者于海洋, 张全启, 王志刚, 王旭波, 齐洁 申请人:中国海洋大学