一种用功能蛋白质组技术研究hbo对nscs分化调控的方法
【专利摘要】一种用功能蛋白质组技术研究HBO对NSCS分化调控的方法，包括在体研究和离体研究，制作脑缺血缺氧大鼠模型，运用免疫荧光染色分别双标神经干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，利用激光捕获显微切割技术分别获取分化的神经细胞及未分化的神经干细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取各种细胞各组分的总蛋白质，通过Internet网进行搜寻已确定蛋白质的归属，运用生物信息学技术和MS-Fit软件方法，进行蛋白质鉴定和功能分析。
【专利说明】—种用功能蛋白质组技术研究HBO对NSCS分化调控的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试验方法，特别是涉及一种用功能蛋白质组技术研究HBO对NSCS分化调控的方法。
【背景技术】
[0002]神经干细胞(NSC)是一类存在于神经系统中具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，它们在一定条件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并表现有相应的形态和电生理特征。经过10余年的研究，人们发现成年脊椎动物和成人的神经干细胞集中在脑内的三个特定区域:一个是位于脑室区和脑室下区(SVZ)，这两个区域的室管膜细胞是由神经母细胞组成的混合细胞群，他们可以迁移到嗅球产生前体细胞、星形细胞；另一个在连接侧脑室和嗅球的区域；第三个是海马。神经干细胞的发现使得人们对中枢神经系统的发育、神经的再生等都有了新的认识，为脑血管疾病的治疗带来了新的希望。有研究表明当脑内出现某些病理变化或在某些细胞因子作用下这些NSC被激活，发生增殖、迁徙和分化。脑缺血不但可以促使齿状回(DG)的神经干细胞增殖，也可以影响脑室下区的神经干细胞，而且未缺血侧大脑半球NSC的增殖也有增加，其中缺血侧大脑半球NSC增殖最为明显。研究还发现脑缺血能激活NSC分化，而分化的神经元能部分的替代和修复损伤的神经元。以上研究证实了脑缺血情况下NSC可被激活，发生增殖、迁移和分化，说明了 NSC可参与脑血管疾病的病理生理过程。从而提示我们，探讨神经干细胞增殖与分化的分子机制及干预手段(如高压氧、康复等)对NSC的增殖与分化和神经元再生的促进作用对于脑血管疾病的研究具有十分重要的意义。
[0003]随着人类基因组计划(HGP)的胜利完成，使得生命科学进入了后基因组时代，研究热点转移到蛋白质组学，有研究发现基因的存在和多样性与蛋白质的存在和多样性之间是不均衡的。因此，利用基因组的研究成果进行大规模的蛋白质组研究已经成为必然。1994年澳大利亚学者Wilkins和Williams首先提出“蛋白质组”(PR0TE0ME)的概念，蛋白质组学就是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域。可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白质，这些蛋白质既可以为认识疾病发病机理提供线索，也可以作为疾病诊断的分子标记，还可以作为治疗和药物开发的靶点。
[0004]蛋白质组学是指基因组表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等，而鉴于蛋白质组学研究的难度，许多学者提出了功能蛋白质组的研究思路，即研究在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质，功能蛋白质组是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，不仅能阐明某一群体蛋白质的功能，也可研究某一生理、病理状态下蛋白质表达的情况，丰富总蛋白质组数据库，并最终描绘出接近于“全体蛋白质”的蛋白质组学。在细胞分化等重大生命活动中，蛋白质不仅具有表达时间、表达量的差异，而且具有对外界的环境刺激，包括生理信号、病理信号及外界物理、化学因素等刺激，能动地产生反应的能力，这是生命现象区别于非生命现象的基本特征之一。
[0005]高压氧(HBO)是指机体处于高气压环境中所呼吸与环境等压的纯氧，而利用吸入高压氧治疗疾病的方法称为高压氧疗法。大量临床和实验研究证实HBO可提高脑组织的氧含量及氧储量，减少脑细胞因缺氧而变性坏死；提高有氧代谢，减少无氧酵解，降低脑内乳酸盐浓度，从而纠正酸中毒，改善脑内环境；可收缩脑血管，减少脑组织的血流量，从而减轻脑水肿，降低颅内压；可提高超氧化物歧化酶(SOD)的含量，加强清除自由基和抗氧化能力，减少再灌注对脑组织的损伤；可恢复“缺血半影区”功能，促进神经细胞的恢复与再生。远期和近期的临床和实验均已表明，高压氧对脑血管疾病的急性症状和后遗的运动、感觉、语言、智力和记忆障碍有较好的疗效。最近研究发现HBO可动员骨髓中的干细胞，使血液外周循环中的⑶34+细胞增加8倍，干细胞因子增加50%，并且高比率表达VEGF2和SDGF受体；可上调神经营养因子_3、碱性成纤维生长因子的表达，而这些因子的浓度改变能影响细胞周围微环境而激活NSC增殖和分化；可增加脑缺血缺氧大鼠神经干细胞Nestin蛋白的表达，使Brdu免疫染色阳性细胞大量增加；我们预实验也展示了高压氧可以上调脑源性神经干细胞向神经元分化。因此，我们认为HBO在对NSCs干预过程中的作用必然引起了从遗传信息到整体功能实现中的分子、细胞器、整体多层面的结构与功能状态的改变，而决定这些层面的结构与功能的基础是基因，而直接的决定因素主要是蛋白质。因此以蛋白质表达为指标，以蛋白质调控改变和功能修饰为研究方向，进行高压氧多环节、多靶点调整作用的研究，可望对高压氧治疗脑血管疾病的作用机理研究取得突破性进展。
[0006]目前我国脑血管疾病的患病率逐年增加，高压氧治疗对急性神经元保护和脑血管疾病后遗症的改善取得了重要的进展，但对神经干细胞分化调控的分子机制了解确很少。本项目采用功能蛋白质组学技术和生物信息学技术等方法，从离体和在体实验两个方面研究高压氧对神经干细胞分化调控的分子机制，建立功能蛋白质组学和生物信息学等技术平台，利用此平台将高压氧的多靶点、多途径作用特点与蛋白质表达关联起来，比较各自不同的表达差异谱，对应蛋白表达靶点，阐明高压氧治疗的作用机制。为高压氧治疗脑血管疾病开辟新的研究和应用领域，同时为其临床应用奠定坚实的理论基础。
【发明内容】
[0007]脑缺血缺氧动物模型制作:除正常对照组、假手术组外，其余各组均造模，脑缺血缺氧模型采用经典Rice模型；高压氧处理:大鼠模型制作后3h、6h、12h、24h内放入高压氧舱，压力为0.2MPa，舱内氧浓度为80%，每次lh，l次/d，连续7d ;免疫荧光染色双标:取各组大鼠脑组织，用多聚甲醛固定，将脑冠固定后的脑组织进行常规脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，切片，分别加入一抗fcdu、Nestin, GFAP, Tuj1、Galc，4°C过夜，再用PBS漂洗，在加入Cy3/FITC标记的二抗，37°C温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况；采用激光捕获显微切割技术分别游离各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关蛋白的表达影响；
[0008]离体研究包括以下步骤:
[0009]神经干细胞培养:无菌条件下分离新生鼠脑组织，机械分成Imm3大小组织，加入培养液吹打成单细胞悬液，取少量细胞悬液接种于培养瓶，添加有bFGF和B27的DMEM/F12的培养液，置于5%C02培养箱中，神经球形成后再次机械分离克隆制成单细胞悬液，将部分细胞悬液接种到新的培养瓶中培养，7d后机械分离克隆传代I次，方法同前，将培养的第3代神经干细胞制成单细胞悬液，分装在不同的25ml培养瓶中，分为正常对照组、模型对照组、高浓度氧组、高压空气组、高压氧组，I瓶/组；制造干细胞缺血缺氧模型:除正常对照组夕卜，其余各组均造模，当培养的神经干细胞达80%的融合时换为新鲜的完全培养基，次日将培养基弃去代之以新鲜的无血清DMEM/F12培养基，并将细胞置于93%N2，5%C02, 2%02的培养箱37°C培养；神经干细胞在此环境中作用3h、6h、12h、24h，再Brdu共孵育48h后被用于相关实验；神经干细胞活力的测定从每组取Iml细胞悬液移入96孔酶标板，细胞密度为每孔103?104个细胞，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37°C孵育4h，终止培养，吸去培养上清液，每孔加入150ulDMS0，震荡IOmin使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值，高压氧下诱导神经干细胞分化:将上述高压氧组缺血缺氧细胞悬液接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板中，将一部分细胞于贴壁2h后进行Nestin免疫荧光染色；另一部分加入去除生长因子的血清DMEM/F12培养基继续培养7d，并同时将之置于高压氧环境下，压力为0.2MPa，每次lh，I次/d，连续7d。其余各组即是将各组同时至于各组环境下；神经细胞特异免疫荧光染色:将上述各组细胞PBS充分漂洗，用多聚甲醛溶液固定。分别加入一抗Brdu、Nestin, GFAP, Tuj1、Galc，4°C过夜，用PBS漂洗，再加入Cy3/FITC标记的二抗，37°C温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况；应用流式细胞仪分别获取各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关的蛋白表达影响。
【具体实施方式】
[0010]下面对本发明作进一步的详细说明。
[0011]实施例1
[0012]脑缺血缺氧动物模型制作:除正常对照组、假手术组外，其余各组均造模，脑缺血缺氧模型采用经典Rice模型；高压氧处理:大鼠模型制作后3h、6h、12h、24h内放入高压氧舱，压力为0.2MPa，舱内氧浓度为80%，每次lh，l次/d，连续7d ;免疫荧光染色双标:取各组大鼠脑组织，用多聚甲醛固定，将脑冠固定后的脑组织进行常规脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，切片，分别加入一抗fcdu、Nestin, GFAP, Tuj1、Galc，4°C过夜，再用PBS漂洗，在加入Cy3/FITC标记的二抗，37°C温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况；采用激光捕获显微切割技术分别游离各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关蛋白的表达影响。
[0013]离体研究包括以下步骤:
[0014]神经干细胞培养:无菌条件下分离新生鼠脑组织，机械分成Imm3大小组织，加入培养液吹打成单细胞悬液，取少量细胞悬液接种于培养瓶，添加有bFGF和B27的DMEM/F12的培养液，置于5%C02培养箱中，神经球形成后再次机械分离克隆制成单细胞悬液，将部分细胞悬液接种到新的培养瓶中培养，7d后机械分离克隆传代I次，方法同前，将培养的第3代神经干细胞制成单细胞悬液，分装在不同的25ml培养瓶中，分为正常对照组、模型对照组、高浓度氧组、高压空气组、高压氧组，I瓶/组；制造干细胞缺血缺氧模型:除正常对照组夕卜，其余各组均造模，当培养的神经干细胞达80%的融合时换为新鲜的完全培养基，次日将培养基弃去代之以新鲜的无血清DMEM/F12培养基，并将细胞置于93%N2，5%C02, 2%02的培养箱37°C培养；神经干细胞在此环境中作用3h、6h、12h、24h，再Brdu共孵育48h后被用于相关实验；神经干细胞活力的测定从每组取Iml细胞悬液移入96孔酶标板，细胞密度为每孔103?104个细胞，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37°C孵育4h，终止培养，吸去培养上清液，每孔加入150ulDMS0，震荡IOmin使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值，高压氧下诱导神经干细胞分化:将上述高压氧组缺血缺氧细胞悬液接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板中，将一部分细胞于贴壁2h后进行Nestin免疫荧光染色；另一部分加入去除生长因子的血清DMEM/F12培养基继续培养7d，并同时将之置于高压氧环境下，压力为0.2MPa，每次lh，I次/d，连续7d。其余各组即是将各组同时至于各组环境下；神经细胞特异免疫荧光染色:将上述各组细胞PBS充分漂洗，用多聚甲醛溶液固定。分别加入一抗fcdu、Nestin、GFAP、Tuj1、Galc，4°C过夜，用PBS漂洗，再加入Cy3/FITC标记的二抗，37°C温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况；应用流式细胞仪分别获取各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关的蛋白表达影响。
[0015]总蛋白质的提取与定量:在体及离体的各种细胞各组分的总蛋白质提取参照《肿瘤蛋白质组学》操作，蛋白质定量按Ausubel所述的BradFord方法操作。
[0016]双向凝胶电泳技术(2-DE技术):将总蛋白质与重泡涨液混合，加入IPG持胶槽中，放在IPGphor电泳仪上水化，等电聚焦；将胶条移至SDS凝胶上端，恒电流电泳，样品中加入2D标准蛋白质作为内标。
[0017]凝胶染色与图像采集分析:按Hochstrasser等的银氨溶液染色法。染色后的凝胶用分子成像仪透射扫描，得到的数字化图像文件用TOQuest(Bi0-Rad)进行软件分析，利用内标2D-Marher的标准分子量和等电点来确定胶内蛋白质点的分子量和等电点。
[0018]蛋白质原位酶解:参照Bergman等的方法进行,取点器将感兴趣的蛋白质点切割下放于EP管中；加入脱色工作液，反复乙腈脱水，加入TPCK-胰蛋白酶IOuL置于冰浴中，酶解后上清液转移至EP管中,萃取液冻干后进行质谱分析。
[0019]MADL1-T0F肽质指纹图分析:按《肿瘤蛋白质组学》操作，选用基质，样品溶解；用美国Millipore公司的ZipTipTMC18器嘴脱盐；制备好的样品可使用美国Bruker公司的ProFlexTM III MADL1-T0F质谱仪进行分析，同时进行内部数据校正。
[0020]HPLC-Edman降解法测定多肽的氨基酸序列:按《肿瘤蛋白质组学》操作。酶解混合物溶液，离心后去上清液用ABI173AMiroBlotter毛细管HPLC系统分离，样品峰使用ABI173AMiroBlotter收集到PVDF膜上，刀片切下与出峰位置对应的PVDF膜，用ABI475气相蛋白质序列仪对PVDF膜上的样品进行序列测定。
[0021]生物信息学鉴定蛋白质图谱中差异蛋白质点的功能:按《肿瘤蛋白质组学》操作。通过Internet网进行搜寻以确定蛋白质的归属,运用生物信息学技术和MS-Fit软件方法，进行蛋白质鉴定和功能分析。
[0022]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，效果相似，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种用功能蛋白质组技术研究HBO对NSCS分化调控的方法，包括在体研究和离体研究，所述在体研究包括以下步骤:. 1)脑缺血缺氧动物模型制作:除正常对照组、假手术组外，其余各组均造模，脑缺血缺氧模型采用经典Rice模型； . 2)高压氧处理:大鼠模型制作后3h、6h、12h、24h内放入高压氧舱，压力为0.2MPa，舱内氧浓度为80%，每次lh，I次/d，连续7d ；. 3)免疫荧光染色双标:取各组大鼠脑组织，用多聚甲醛固定，将脑冠固定后的脑组织进行常规脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，切片，分别加入一抗fcdu、Nest in、GFAP、Tuj1、Galc，.4°C过夜，再用PBS漂洗，在加入Cy3/FITC标记的二抗，37°C温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况； . 4)采用激光捕获显微切割技术分别游离各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关蛋白的表达影响； 所述离体研究包括以下步骤:. 1)神经干细胞培养:无菌条件下分离新生鼠脑组织，机械分成Imm3大小组织，加入培养液吹打成单细胞悬液，取少量细胞悬液接种于培养瓶，添加有bFGF和B27的DMEM/F12的培养液，置于5%C02培养箱中，神经球形成后再次机械分离克隆制成单细胞悬液，将部分细胞悬液接种到新的培养瓶中培养，7d后机械分离克隆传代I次，方法同前，将培养的第3代神经干细胞制成单细胞悬液，分装在不同的25ml培养瓶中，分为正常对照组、模型对照组、高浓度氧组、高压空气组、高压氧组，I瓶/组； . 2)制造干细胞缺血缺氧模型:除正常对照组外，其余各组均造模，当培养的神经干细胞达80%的融合时换为新鲜的完全培养基，次日将培养基弃去代之以新鲜的无血清DMEM/F12培养基，并将细胞置于93%N2，5%C02，2%02的培养箱37°C培养；神经干细胞在此环境中作用.3h、6h、12h、24h,再Brdu共孵育48h后被用于相关实验； .3)神经干细胞活力的测定从每组取Iml细胞悬液移入96孔酶标板，细胞密度为每孔.103~104个细胞，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37°C孵育4h，终止培养，吸去培养上清液，每孔加入150ulDMS0，震荡IOmin使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值， . 4)高压氧下诱导神经干细胞分化:将上述高压氧组缺血缺氧细胞悬液接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板中，将一部分细胞于贴壁2h后进行Nestin免疫荧光染色；另一部分加入去除生长因子的血清DMEM/F12培养基继续培养7d，并同时将之置于高压氧环境下，压力为0.2MPa，每次lh，I次/d，连续7d。其余各组即是将各组同时至于各组环境下；. 5)神经细胞特异免疫荧光染色:将上述各组细胞PBS充分漂洗，用多聚甲醛溶液固定。分别加入一抗&*(111、他8衍11、6?4?、1\^丨、6&1(3，41:过夜，用PBS漂洗，再加入Cy3/FITC标记的二抗，37°C温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况； . 6)应用流式细胞仪分别获取各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关的蛋白表达影响。
【文档编号】G01N33/68GK104020292SQ201410059175
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】彭争荣 申请人:中南大学湘雅医院