白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白在denv2感染hacat细胞中的应用。

背景技术：

蚊虫唾液蛋白具有抗凝血、抗炎、免疫调控的功能，是当前研究的热点。唾液腺转录组学和蛋白质组学研究均发现在伊蚊属蚊虫唾液腺中有一组雌蚊特异性高表达、分子量大小为34kda但功能未知的唾液组分蛋白，故命名为34k蛋白家族。该蛋白编码基因均含有信号肽序列，表明其参与组成蚊虫唾液组分蛋白。白纹伊蚊俗称花脚蚊，因生性凶猛、攻击力强，也被称为“亚洲虎蚊”，是我国登革热的重要媒介。对白纹伊蚊唾液腺组学研究显示有两个34k蛋白存在于白纹伊蚊唾液内，分别命名为34k1，34k2。我们先前的研究发现蚊虫吸血可调控34k2蛋白的表达，但该蛋白在蚊虫吸血、传病中的作用并不清楚。为此，我们依据ncbi上白纹伊蚊34k-2成熟肽基因序列，原核克隆表达了该蛋白并分离纯化获得了有活性的重组蛋白，进而探讨了该重组蛋白在denv2感染hacat细胞(人角质形成细胞)中的应用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白(以下简称rab-34k2)在denv2感染hacat细胞中的应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白在denv2感染hacat细胞中的应用，其包括以下内容：

(1)包括白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白在denv2感染hacat细胞中细胞增殖和抑制病毒增殖中的应用；

a)上述应用是利用实时无标记细胞动态分析法监测不同浓度的白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白对hacat细胞生长的影响；

b)对denv2感染hacat细胞中抑制病毒增殖的应用，是通过denv2ns1基因/内参基因gapdhrna的比值对病毒核酸相对表达量进行统计学分析；

上述对病毒核酸相对表达量进行统计学分析，包括以下步骤：

①以感染denv2的hacat细胞的rna逆转录的cdna为模板，用引物nsif(seqidno：1)和ns1r(seqidno：2)、引物gapdhf(seqidno：3)和gapdhr(seqidno：4)分别对nsi基因和gapdh基因的进行pcr扩增；

②扩增产物经纯化回收后进行10^-3-10^-9的梯度稀释用作模板；

③用qrt-pcr检测不同浓度梯度下各基因的扩增参数，建立标准曲线；

④根据标准曲线对不同浓度白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白对denv2感染hacat细胞中病毒核酸进行动态检测并进行统计学分析；

(2)白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白在denv2感染hacat细胞中调控细胞表达因子的应用；

上述应用是利用qrt-pcr实时检测不同浓度的白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白对denv2感染hacat细胞中ifn-α/β、il-1β、tnf-α、及il-10的mrna变化的影响；qrt-pcr的反应程序为95℃，8min；95℃，30s；60℃，30s；72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；

(3)白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白在denv2感染hacat细胞中促进细胞凋亡的应用；

上述应用是是采用流式细胞术检测白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白对denv2感染前后hacat细胞凋亡的影响。

本发明的有益效果为：

本实验将已获得rab-34k2蛋白作用于人角质形成细胞，观察细胞内登革病毒的增殖作用。rab-34k2蛋白能促进denv2在hacat细胞中增殖，其机制是通过抑制感染denv2的hacat细胞表达ⅰ型干扰素ifn-α/β促进病毒增殖；同时rab-34k2蛋白还能诱导感染denv2的hacat细胞发生凋亡，促进病毒的扩散。研究结果对阐明白纹伊蚊唾液蛋白在病毒传播中的作用具有重要意义。

附图说明

图1、不同浓度的rab-34k2蛋白作用hacat细胞生长的最大ci；

图2、不同浓度的rab-34k2蛋白作用hacat细胞生长的cit50；

图3、rt-pcr扩增denv2感染hacat细胞ns1基因的表达，maker:dl2000；1：denv2感染hacat细胞；2：未感染病毒hacat细胞；3：空白对照；

图4、不同浓度的rab-34k2蛋白对denv2(moi＝1)感染hacat细胞最大ci值的影响；

图5、不同浓度的rab-34k2蛋白对denv2(moi＝1)感染hacat细胞cit50的影响；

图6、不同时间点不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后denv2ns1rna的相对表达量；

图7、不同时间点不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝0.1)作用hacat细胞后denv2ns1rna相对表达量；

图8、不同时间点不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后ifn-αmrna相对表达量(n＝4)；

图9、不同时间点不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后ifn-βmrna相对表达量(n＝4)；

图10、不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后il-1βmrna相对表达量(n＝4)；

图11、不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后tnf-αmrna相对表达量(n＝4)；

图12、不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后il-10mrna相对表达量(n＝4)；

图13、不同浓度的rab-34k2蛋白处理24h后对hacat细胞凋亡的影响(n＝3)；

图14、不同浓度的rab-34k2蛋白对denv2(moi＝1)感染的hacat细胞凋亡的影响(n＝3)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图。对本发明进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。应当指出的是，对本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：

rab-34k2蛋白对hacat细胞增殖的分析

为检测不同浓度rab-34k2蛋白对hacat细胞的增殖是否有直接影响，本实验用hepes缓冲液将rab-34k2唾液蛋白稀释后分为：1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml各组，同时设置相应浓度梯度的bsa蛋白对照、阴性对照(hepes缓冲液对照)及空白对照，以人角质形成细胞(hacat)数为2×104cells/100μl接种在e-plate检测板中，运用rtca动态监测细胞生长曲线的变化，检测不同浓度的rab-34k2唾液蛋白对hacat细胞生长的影响。

上述rtca动态监测细胞生长曲线的方法如下：

(1)在e-plate16板中加入dmem完全培养基于rtcastations上检测基线；

(2)在超净工作台内吸旧培养液，用pbs液清洗后向培养皿内加入1ml25％胰蛋白酶溶液，置于37°温箱中温育2-6min后，在倒置显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞质回缩，细胞间歇增大，终止消化。

(3)吸除消化液并加入10ml培养基，反复轻轻吹打后1000rpm离心5min，去除上清，加入新鲜培养基，吹打均匀。用计数板计数细胞悬液浓度后，分别配制成细胞浓度为5×10⁵、4×10⁵、2×10⁵、1×10⁵、5×10⁴cells/ml。

(4)取出e-plate16，在孔中分别加入100μl混合均匀的hacat细胞悬液，使每孔中细胞数目为5×10⁴、4×10⁴、2×10⁴、1×10⁴、5×10³cells/100μl。

(5)将e-plate16置于超净台中室温放置30min，将e-plate16放到培养箱中的rtcastation上，开始动态检测细胞增殖曲线。

结果显示各组细胞生长动态基本一致，最大平均ci值无显著差异(如图1、表1)，各组cit50(以空白对照组细胞最大ci下降至1/2所需时间)也无统计学差异(如图2、表1)

表1不同浓度的rab-34k2蛋白作用hacat细胞后最大ci及cit50

实施例2

rab-34k2蛋白对denv2感染hacat细胞中病毒增殖功能的分析

(1)rab-34k2蛋白对denv2感染hacat细胞产生细胞病变(cpe)的影响：

denv2的增殖及鉴定：将denv2ngc株病毒稀释50倍，接种处于对数生长期的c6/36细胞，同时设未接种病毒的细胞为阴性对照。37℃、5％co2温箱孵育，待细胞出现明显病变(细胞出现肿胀、融合、空泡等)后将其反复冻融3次，4000rpm，5min离心收集上清，得denv2病毒液并用引物ns1f(seqidno：1)和ns1r(seqidno：2)对ns1基因片段进行rt-pcr扩增，所述rt-pcr扩增的反应体系如表2所示，反应程序为95℃，8min；95℃，30s；60℃，30s；72℃延伸30s，35个循环，取5μlpcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测(图3)。

表2rt-pcr反应体系

denv2效价的滴定(tcid50法)：

将bhk细胞制成单细胞悬液加入96孔板内，24小时后细胞生长密度达70％，将病毒液稀释至10^-1-10^-77个稀释度，分别接种到bhk细胞板中，100μl/孔，同时以未接病毒孔为阴性对照，37℃、5％co2培养连续观察7天，记录结果，reed-muench法计算tcid50。计算方法如下：距离比例＝(高于50％的病变百分数-50％)/(高于50％的病变百分数-低于50％的病变百分数)；tcid50＝高于50％病变稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。

对各实验组和对照组最大ci值及cit50进行统计学分析(如图4、图5和表3)，发现10μg/ml的rab-34k2唾液蛋白感染实验组所致的cpe效应较阳性对照组(denv2对照组)严重，且具有统计学差异(10μg/ml组ci峰值较病毒对照组低1.3798倍，p<0.05；到达50％ci值时间(cit50)较对病毒照组缩短5.9小时(p<0.05))，提示rab-34k2蛋白具有促进denv2在hacat细胞内增殖的可能。

(2)rab-34k2唾液蛋白对denv2感染hacat细胞中病毒核酸变化的影响

①、denv2ns1基因、内参基因(gapdh)标准品制备：以感染denv2的hacat细胞的rna逆转录的cdna为模板，用引物nsif和ns1r、引物gapdhf(seqidno：3)和gapdhr(seqidno：4)分别对nsi基因和gapdh基因的进行pcr扩增(表3)，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物经纯化回收后用作标准品，将标准品梯度稀释至10^-3-10^-99用作模板。

②、denv2ns1基因、内参基因(gapdh)标准曲线的制定：稀释后的标准品作为模板，用qrt-pcr检测不同浓度梯度下各基因的扩增参数，建立标准曲线，qrt-pcr反应体系见表4。

③、denv2感染hacat细胞中病毒ns1基因的检测：对感染复数(moi)分别为1和0.1的感染模型中，不同浓度rab-34k2唾液蛋白(1μg/ml、10μg/ml)中病毒核酸进行动态检测。以ns1/gapdhrna的比值对各组中病毒核酸相对表达量进行统计学分析。

上述步骤③中感染模型建立的方法为：以hacat细胞数为1.3×105cells/孔接种在24孔板中，在对数生长后期约8h时更换各分组的培养基，分别收集denv2moi＝1时12h、24h、36h的hacat细胞；moi＝0.1时48h、60h、70h的hacat细胞；运用qrt-pcr检测denv2ns1基因片段及内参基因gapdhmrna的含量，以ns1基因初始rna含量c0/内参基因gapdhc0值进行统计学分析。

结果显示当moi＝1，感染12h时rab-34k2实验组中病毒核酸相对较高，其中rab-34k2(10μg/ml)组中病毒增殖约为病毒对照组(denv2组)的2.35倍，但各组间无统计学差异。随感染时间延长，各组胞内病毒核酸逐渐下降，但在感染36h后rab-34k2组与denv2组比较病毒核酸下降显著缓慢(其中1μg/ml组病毒核酸高于对照组2.6509倍，p<0.05；10μg/ml组高于对照组3.5527倍，p<0.01)(见表5；图6)。

在moi＝0.1时，在48h、60h、70h各时间点均以rab-34k2组胞内病毒核酸含量显著增高，与denv2组及相应bsa组比较均具有统计学差异(见表6；图7；其中48h时1μg/ml组高于denv2对照组2.3333倍，p<0.001，高bsa(1μg/ml)对照组1.75倍，p<0.05；10μg/ml组高于denv2对照组3.625倍，p<0.001，高于bsa(10μg/ml)对照组1.8125倍，p<0.05；60h时1μg/ml组高于denv2对照组2.7778倍，p<0.001，高于bsa(1μg/ml)对照组1.9231倍，p<0.01；10μg/ml组病高于denv2对照组4倍，p<0.001，高于bsa(10μg/ml)对照组1.8倍，p<0.01；70h时1μg/ml组高于denv2对照组2.8846倍，p<0.001，高于bsa(1μg/ml)对照组1.5625倍，p<0.05，10μg/ml组高于对照组4.1538倍，p<0.001，高于bsa(10μg/ml)对照组1.7419倍，p<0.05)。

表3ns1、gapdh基因pcr扩增反应体系

表4qrt-pcr反应体系

表5不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后denv2ns1rna相对表达量

表6不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后denv2ns1rna相对表达量

实施例3

rab-34k2蛋白对denv2感染hacat细胞调控细胞因子表达的分析

(1)rab-34k2唾液蛋白对denv2感染hacat细胞表达i型干扰素的影响ifn-α/β基因检测标准品制备方法同实施例2中(2)的①，标准曲线的制备同同实施例2中(2)的②，核酸的检测同实施例2中(2)的③。

表7不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用hacat细胞后ifn-α、ifn-βmrna相对表达量

本实验定量检测denv2感染复数moi＝1时各感染组在感染12h和24h的ifn-α/βmrna的相对表达量，结果显示moi＝1时，ifn-α在感染12h各组中表达量低，组间差异不明显；而感染24h时各组表达均表达上调，但以rab-34k2实验组相对表达低下，与denv2对照组相比，具有统计学差异(表7、图8，其中1μg/ml组低于对照组1.7512倍，p<0.05；10μg/ml组低于对照组2.2531倍，p<0.05)。

在整个检测时间点中各组细胞内ifn-β相对表达水平低于ifn-α，且随感染时间延长ifn-β表达呈下降趋势(denv2组除外)，特别是rab-34k2实验组ifn-β表达抑制显著(见图9，表7，其中1μg/ml组低于对照组3.7380倍，p<0.01；10μg/ml组低于对照组4.7230倍，p<0.01)。

(2)rab-34k2唾液蛋白对denv2感染hacat细胞表达炎性细胞因子il-1β/tnf-α/il-10的影响。

同实施例2中(2)的基因检测标准品制备方法同实施例2中(2)的①，标准曲线的制备同同实施例2中(2)的②，核酸的检测同实施例2中(2)的③。

检测denv2感染复数moi＝1时各组细胞感染24h后il-1β、tnf-α及il-10mrna的相对表达量发现：以il-1β相对表达最高，tnf-α次之，il-10最少；其中il-1β的相对表达量以rab-34k2蛋白感染组升高最为显著，1μg/ml和10μg/mlrab-34k2蛋白组所产生il-1β均与denv2对照组相比具有统计学差异(其中1μg/ml组高于对照组5.6929倍，p<0.001；10μg/ml组高于对照组3.9384倍，p<0.001)；相对denv2对照组，tnf-α的产生在蛋白感染组被下调(1μg/ml组低于对照组1.8294倍，p<0.05)，但rab-34k2组与bsa组间无显著差异；il-10的相对表达在rab-34k2感染组中有上调趋势，但各组间无统计学差异(见表8、图10、图11、图12)。

表8不同浓度的rab-34k2蛋白与denv2(moi＝1)作用后hacat细胞后il-1β/tnf-α/il-10相对表达量

实施例4

rab-34k2唾液蛋白促进denv2感染hacat细胞凋亡功能的分析

(1)用不含edta的胰酶消化，2000rpm离心5min收集细胞；

(2)冰上轻柔操作：用预冷pbs洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1～5×105细胞；

(3)加入500μl的bindingbuffer(873b616)悬浮细胞；

(4)加入5μlannexinv-fitc混匀后，加入5μlpropidiumiodide，混匀；

(5)冰上、避光、反应5-15min；反应完成后冰上存放并在1h内进行流式细胞仪检测hacat细胞凋亡情况。

利用标准品所制的标准曲线方程对实时定量pcr检测各组中目的基因及内参基因的rna含量进行计算。采用grahpadprism5.0统计软件进行统计学分析并制图。数据用表示，组间分析采用独立样本t检验处理数据，p<0.05为差异有统计学意义。每次样本数n≧2，独立实验重复3次。

实验结果显示，未感染时，与细胞对照组及bsa对照组相比，仅10μg/mlrab-34k2蛋白作用24h后细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)有升高趋势，但各组间无差异无统计学差异(如图13，表9)；denv2(moi＝1)感染24h后，与denv2感染组及相应浓度的bsa对照组(如图14、表10)比较，rab-34k2蛋白1μg/ml、10μg/ml感染组的细胞凋亡率明显增加，具有统计学差异(1μg/ml组凋亡率为(9.1767±2.6303)％，较对照组高2.1989倍，p<0.05；10μg/ml组凋亡率为(10.6633±2.8243)％，较对照组高2.5551倍，p<0.05)。

表9不同浓度的rab-34k2蛋白处理24h后对hacat细胞凋亡的影响

表10不同浓度的rab-34k2蛋白处理24h后对hacat细胞凋亡的影响(n＝3)

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

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<110>贵州医科大学

<120>白纹伊蚊唾液34k2重组蛋白在denv2感染hacat细胞中的应用

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