专利名称：NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法
技术领域：
本发明涉及应用NBS Profiling分子技术，调查植物品种或资源与潜在亲本的起源关系。本发明描述了 NBS Profiling在植物杂交育种中杂交后代的杂种真实性的早期鉴定、及具有重要经济和研究价值植物品种或材料的亲本起源鉴定中的方法。
背景技术：
NBS Profiling是一种基于生物核苷酸结合位点-亮氨酸富集重复序列 (nucleotide-binding site-leucine-rich repeat, NBS-LRR)高度保守的特点，设计 NBS 引物，通过PCR扩增获得特异性分子片段或标记的方法。已知植物抗病基因都具有几个高度保守的NBS-LRR区域，针对植物抗病基因和抗病基因同源序列NBS-LRR保守序列设计发明的NBS Profiling技术，是一种高度可靠的DNA多位点文库构建、且可以免费使用的技术，具有与AFLP、ISSR分子标记技术相似的显性多位点标记体系的特点。自C. G van der Linden (Theoretical and Applied Genetics (2004) 109: 384 - 393 "Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS profiling"(禾用 NBS Profi 1 ing有效标定植物病害抗性位点))建立NBS Profi 1 ing技术以来，已成功的应用于许多重要作物，如马铃薯、番茄、水稻、大麦、莴苣、葡萄等的抗病基因的分离鉴定和序列分析。现代植物育种，经常利用野生资源与栽培品种的杂交，将野生资源中的抗逆、抗病等重要性状的基因转移到栽培种中。但由于种间杂交亲缘关系远、且无法完全去雄或隔离授粉，杂交后获得的后代有些不是真正的杂交种。对于像球根花卉水仙、郁金香、百合，木本植物金丝桃、杜鹃花、苹果等生长周期长的植物，如果能在种子苗早期将非杂交后代的自交苗识别去除，可以节省栽培管理这些材料的大量人力、物力，将大大的降低育种成本。此外， 了解和弄清一些长期使用，但亲本来源不清、性状优良栽培品种的亲本来源，有助于这些品种的性状改良。现有鉴定植物杂交后代或品种与亲本遗传关系的方法中，传统的形态学方法存在从种子播种到植株长成、开花结果耗时长，受环境因素影响大等缺点；分子细胞遗传学方法-基因原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH )虽然能够有效的鉴定亲本与杂交后代的遗传关系，但该方法从染色体制片开始到完成鉴定至少需要一周以上，非常耗时耗力，操作人员必须具有丰富的经验和好的操作技能才能应用这项技术，因此实际应用受到了极大的限制。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有鉴定技术周期长、费时费力、或技术要求高等缺点， 提供一种新的鉴定杂交后代杂种性、物种起源的方法。本发明的发明人研究得出通过比较NBS Profiling扩增片段的相似性，可高效准确地分析鉴定植物杂交后代的杂种性或栽培品种与潜在亲本的遗传关系。本发明所述的一种NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，按以下步骤进行
(1)供DNA提取的幼叶的采集与保存；
(2)总DNA的分离纯化；
(3)进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接；
(4)NBS Profiling扩增，包括两步PCR反应；
(5)扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定。采用本发明方法，可以早期快速地鉴定植物育种杂交后代的杂种性，提高育种效率；可以比较鉴定一些亲本来源不清、性状优良栽培品种的亲本起源，辅助这些品种的性状改良；可以追溯鉴定一些重要植物资源的亲本起源，促进这些资源的进一步应用。NBS Profiling可以鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源，理论推导可能是由于NBS序列高度保守、能够稳定遗传给后代的特点，杂交后代的NBS序列应该和其母本和(或)父本一致。
附图1 NBS特异引物NBS-GLPL及限制性内切酶TfeaI组合的水仙花yVarci^^s tazetta (cv. iSoleil d，or，)(泳道 1,2)，iTete-Q-Tete'(泳道 3，4)， 和 Narcissuscyclamineus (泳道 5，6) NBS profiling 的带型特征‘T6te-(5-T6te，所有的条带都能追溯到Ar. iazeiia和Λ的条带中。附图2 NBS特异引物NBS5A及限制性内切酶i&el组合的金丝桃 perforatum (HP)与 Elite amber (EA)及其杂交后代(泳道 I、2、3)的 NBS profiling 带型特征杂交后代的带型与其母本(HP)的带型完全相同。
具体实施例方式本发明提供了一种NBS Profiling鉴定杂交后代杂种性、植物起源的方法，具体的方法如下
1.供DNA提取的幼叶的采集与保存
采集待鉴定基因型，如杂交亲本及其杂交后代、或品种及其潜在亲本的幼嫩叶片，立即放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到_18°C _80°C低温下贮存供DNA分离提取；
2.总DNA的分离纯化
DNA的质量是影响NBS Profiling成功最重要的因子之一；
采用常用的 Fulton 法(Plant Molecular Biology Reportor, 1995, 13(3) 207-209) 或 CTAB 法(Nucleic Acids Research, 1980, 8(19) 4321-43 )提取幼嫩植物组织的 DNA，用0. 8% 1. 5%琼脂糖电泳和紫外检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度应达到1 μ 1 100 ng 以上，DNA纯度0D26Q/28Q值应介于1. 8 2. 0之间；提取DNA贮藏于_20°C冰箱，于反应前取部分稀释用于NBS Profiing鉴定；
3.DNA的限制性酶消解和末端受体连接 (1)酶切反应
取上述步骤2获得的植物总DNA，用7&al、i&el等四碱基识别位点的限制性内切酶将其切割为不同大小的DNA片段；以TfeaI为例的10 μ 1酶切反应体系如下1 μ + Rsal 缓冲液 1 μ 1 + 蒸馏水 7 μ 1 + DNA 1 μ 1 (100 ng 400 ng)；酶切反应于37°C恒温条件下反应4h4h或过夜，将反应板置于65°C水浴锅中IOmin 20min中止反应；
(2)酶切反应产物检测
采用0. 8%-1. 5%琼脂糖电泳检测酶切反应产物，选择能够把植物总DNA切割成不同长度、连续分散的DNA片段的内切酶，用于下一步酶切、末端受体连接反应；
(3)DNA限制性酶消解和末端受体连接
这一步是在使用限制性内切酶切割总DNA的同时，将一个末端受体连接到新产生的 DNA末端上。末端受体分为平端受体(适用于i&el外的限制性内切酶)和i&el特异的受体两种；
平端受体(blunt adapter)序列为
5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3，
3' NH2TTCATATCTAGGGT 5' -P; Msel特异的受体序列为
5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3' 3' NH2TTCATATCTAGGGTAT 5'；
酶切和受体连接的反应体系(60 μ 1体系为例):5x AFLP缓冲液12 μ 1 +末端受体 3 μ 1 + 蒸馏水 36 μ 1 +ATP (10 mM)6 μ 1 + 限制性酶 1 μ 1 + Τ4 连接酶(5 U/μ 1) 1 μ 1 + DNA (100 ng 400 ng) 1 μ 1 ；酶在加完所有试剂后最后一步加入；
酶切和连接反应于37°C恒温条件下反应4h4h或过夜，将反应板置于65°C水浴锅中 IOmin 20min中止反应；反应产物置于4 °C或-20 °C冰箱贮藏；
加60 μ 1蒸馏水到上述酶解-连接反应产物将其稀释一倍后，供下一步的NBS Profiling扩增反应使用； 4. NBS Profiling 扩增 NBS Profiling扩增包括两步PCR反应 (1)第一次PCR扩增
第一步PCR扩增反应是线性的，25 μ 1反应体系为步骤3稀释的酶解-连接反应产物 5 μ 1 + NBS 特异引物 2 μ 1 + 受体引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 1 μ 1 + IOx PCR 缓冲液 2. 5 μ 1 + DNA Taq 聚合酶 0. 08 μ 1 + 蒸溜水 12. 42 μ 1 ；
PCR扩增反应为95°C 预变性 15 min ；95°C 变性30s，55°C-60°C退火 100s，72°C 延伸2 min，共30个循环；72°C延伸20min后10°C保存。其中退火温度NBSl、NBS5、NBS6、NBS GLPL 引物为 55° C，NBS2、NBS3 引物为 60° C ； 受体引物序列为
5' GTTTACTCGATTCTCAACCCGAAAG 3'； NBS特异引物序列如下
NBSGLPL 5，TGYRRAGGAYTRCCWYTAGC3 NBS1:5，GCIARffGTffGTYTTI C C Y R A I CC 3'；NBS2:5，GTffGTYTTICCYRAI C C I S S C AT 3'；NBS3:5，GTffGTYTTI CC YRAIC C I S S C A TI C C 3，NBS5A5YYTKRTHGTMITKGA T G A T G T ]T G G 3NBS 6: 5' YYTKRTHGTMITKGATGATATITGG3'； 其中 Y=C 或 T ；R=A 或 G ；W=A 或 T ;S=C 或 G ；K=G 或 T ；H=A 或 C 或 T ；M=A 或 C ；A=Adenine (腺嘌呤)！I=Is0Ieucine (异亮氨酸)； (2)第二次PCR扩增
第二步PCR扩增反应是指数性扩增，以4 (1)中第一次扩增的PCR产物为DNA模板， 加入NBS特异引物和标记受体引物进行PCR反应。10 μ 反应体系为4 (1)中第一次扩增的PCR产物5μ1 + IRD 700标记的受体引物(1 pmolM)0. 6 μ 1 + NBS特异引物(10 pMol/ul)2 μ 1 + dNTP (5mM) 0. 4 μ 1 + IOx PCR 缓冲液 1 μ 1 + DNA Taq 聚合酶 0. 04 μ 1 +蒸馏水2. 66 μ 1，除延伸温度由100s减为40s，PCR循环减为20个循环外，其余与第一次PCR反应条件相同；
5.扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定将上述4 (2)中标记的PCR产物进行聚丙烯酰胺胶电泳分离，以LiCor DNA分析仪 (LI-COR Inc, Lincoln, USA)上的操作为例，操作技术如下加入0. 5 1. 5倍体积的溴酚蓝上样缓冲液到4 (2)中标记的第二次PCR产物中，混勻样品于94° C条件下变性5 min 后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4° C或-20° C冰箱；根据待鉴定材料的不同，在进行植物杂交后代杂种性鉴定时，即鉴定育种中杂交后代是否为真杂种的情况时， 上样时按亲本1 -杂交后代-亲本2的顺序排列样品；对于鉴定某个品种或资源的起源亲本的情况，上样时按已知亲本或潜在亲本1 -待鉴定的品种或资源-潜在亲本2的顺序排列样品；每一样品的加样量为0.4 μ Γ0. 5 μ 1 ；所述的植物杂交后代杂种性、物种起源的判定是如果杂交后代的扩增条带一部分与父本相同和一部分与母本相同，且所有条带都能追溯到杂交亲本中，说明这一杂交后代为真杂种；如果杂交后代的扩增条带与母本的条带完全相同，说明这一杂交后代为自交种；具有待鉴定的品种或资源的所有条带的潜在亲本组合是该待鉴定的品种或资源的亲本。针对上述第一种情况，分析亲本1-后代-亲本2样品聚丙烯酰胺胶电泳分离的带型特征，如果杂交后代的扩增条带一部分与父本相同、一部分与母本相同，且所有条带都能追溯到杂交亲本中，说明这一杂交后代为真杂种，应该保留做进一步的分析观察；如果杂交后代的扩增条带与母本的条带完全相同，说明这一杂交后代为自交种，应将其拔出扔掉，节省后期工作相应的人力物力。同理，针对上述第二种情况中那些亲本起源不详的重要栽培品种或资源，将可能的亲本按上述方式一一排列，具有待鉴定的品种或资源所有条带的那一对潜在亲本组合既是该品种或资源的亲本。在第二种情况中，由于该方法只是在最后一步聚丙烯酰胺胶电泳分离NBS Profiling扩增片段时，将不同潜在亲本按不同组合上样，因此可以大量的比较鉴定不同的潜在亲本材料，工作效率高。实施例
实施例1 水仙花品种Narcissus ‘Tgte_di-Tgte’未知亲本的鉴定水仙花品种Narcissus ‘TgteHgte’，是一个早春栽培品种，由于其多花、花色亮丽 (金黄色)、株型矮化适于盆栽、抗性好、易于栽培管理等优点，自1949年培育至今仍然非常流行，占有当今欧洲早春市场40%的份额。由于‘Tgte-0-Tgte’是一个完全不育的三倍体， 使其难于在进一步的育种中应用。育种家试图根据‘Tgte-0-Tgte’原来的培育途径，利用其亲本重新合成具有‘Tgte-0-Tgte’优点的不同花色的新品种。但培育‘Tgte-0-Tgte，的一个亲本一直是未知的。根据记载，‘Tgte-0-Tgte’来自分属于两个不同亚属的水仙花Λ cyclamineus (Narcissus subgenus)禾口tazettaSoleil d ' Or (Hermione subgenus)的杂交后代N.
'Cyclataz',从N. ‘ Cyclataz'开放式授粉后代中选育获得。由于开放式授粉中供给花粉的亲本是随机的，所以培育‘Tgte-0-Tgte’的一个亲本一直是未知的。因此‘Tgte-0-Tgte’ 未知亲本的鉴定对于培育更多具有‘Tgte-0-Tgte’优良性状的新品种具有重要意义。根据‘Tgte-0-Tgte，的性状及染色体数推测与N. ' Cyclataz'杂交的未知亲本可能为况 cyclamineus (species), N. papyraceus (species)、Topolino (cultivar)或与它们相关的种或品种。利用NBS Profiling鉴定其亲本的具体方法如下
1.植物材料
采集已知亲本况 cyclamineus, N. tazettaSoleil d Or 禾口潜在亲本Λ cyclamineus (同前)、Λ papyraceus (species)、Topolino (cultivar)白勺幼嫩口十片，立艮口放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到_80°C低温下贮存供DNA分离提取； 供试的所有水仙花材料由荷兰瓦赫宁根大学、植物育种组提供；
2.总DNA的分离纯化
米用 Fulton 法(Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants (Microprep 法提取番禾口其它草本植物 DNA 的操作)，Plant Molecular Biology Reportor, 1995, 13(3) 207-209)提取水仙花幼嫩植物组织的 DNA， 1%琼脂糖电泳和紫外检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度达到1 μ 300 ng -1 μ 1 2000 ng，DNA纯度0D26(1/28(1值介于1. 85-1. 95之间；提取DNA贮藏于_20°C冰箱，于反应前取部分稀释用于NBS Profiing鉴定；
3.DNA的限制性酶消解和末端受体连接
(1)酶切反应
取上述步骤2获得的植物总DNA，用7&al、i&el限制性内切酶将其切割为不同大小的 DNA片段。酶切反应体系为10 μ 1体系，以T&al为例的反应体系(10 μ 1体系)如下-.Rseil 1 μ 1 + Rsal 缓冲液 1 μ 1 + 蒸馏水 7 μ 1 + DNA 1 μ 1 (300 ng)；
酶切反应于37°C恒温条件下反应4h4h或过夜，将反应板置于65°C水浴锅中15 min 中止反应；
(2)酶切反应产物检测
采用1%-1. 5%琼脂糖电泳检测酶切反应产物，限制性内切酶7&al、i&el均能把水仙花幼叶总DNA切割成不同长度、连续分散的DNA片段；
(3)DNA限制性酶消解和末端受体连接
在上述3 (2)确定适宜限制性内切酶的基础上，在限制性内切酶切割总DNA的同时， 将一个末端受体连接到新产生的DNA末端上-,Rsal的酶切-连接反应体系使用平端受体， Msel酶切-连接反应体系使用i&eI的特异受体；
酶切-受体连接的反应体系(60 μ 1体系)为5x AFLP缓冲液12 μ 1 +末端受体3 μ 1 + 蒸馏水 36 μ 1 +ATP (10 mM) 6 μ 1 + 限制性酶 1 μ 1 + Τ4 连接酶(5 U/μ 1) 1 μ 1 + DNA (300 ng) 1 μ 1 ；酶在加完所有试剂后最后一步加入；
酶切和连接反应于37°C恒温条件下反应Mi或过夜，将反应板置于65°C水浴锅中15min中止反应。反应产物置于4 °C或-20 °C冰箱贮藏；
加60 μ 1蒸馏水到上述酶解-连接反应产物将其稀释一倍后，供下一步的NBS Profiling扩增反应使用；
4.NBS Profiling 扩增
(1)第一次PCR扩增
第一次PCR扩增反应体系为(25 μ 1体系):步骤3稀释的酶解-连接反应产物5 μ + NBS 特异引物 2 μ 1 + 受体引物(10 pMol/ul)2 μ 1 + dNTP (5mM) 1 μ 1 + IOx PCR 缓冲液 2·5μ1 + DNA Taq 聚合酶(Hotstart，购于 Qiagen 公司)0.08 μ 1 + 蒸馏水 12. 42 μ ；
PCR扩增反应为95°C 预变性 15 min ；95°C 变性30s，55°C-60°C退火 100s，72°C 延伸2 min，共30个循环；72°C延伸20min后10°C保存；其中退火温度NBS1、NBS5、NBS6、NBS GLPL 引物为 55° C，NBS2、NBS3 引物为 60° C ；
(2)第二次PCR扩增
以4( 1)中第一次扩增的PCR产物为DNA模板，加入相应的NBS特异引物和标记受体引物进行第二次PCR反应；反应体系为(10 μ 1体系)4 (1)中第一次扩增的PCR产物5 μ 1 + IRD 700 标记的受体引物(1 ρπιο1/μ1)0. 6 μ 1 + NBS 特异引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 0.4 μ 1 + IOx PCR 缓冲液Ιμ + DNA Taq 聚合酶(Dreams，购于BioChain 公司)0.04 μ 1 +蒸馏水2. 66 μ 1 ;PCR扩增反应与第一次PCR反应条件相似，但延伸温度由IOOs减为40s、PCR循环减为20个循环；
5.扩增片段的聚丙烯胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定
上述4 (2)中标记的第二次PCR产物于LiCor DNA分析仪(LI-COR Inc, Lincoln, USA)上进行聚丙烯胺胶电泳分离；加入10 μ 1溴酚蓝上样缓冲液到第二次PCR产物中，与样品混勻总体积20 μ 于94° C条件下变性5 min后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4° C或-20° C冰箱；
聚丙烯胺胶电泳按已知亲本或潜在亲本1 - Tgte-0-Tgte’ -已知亲本或潜在亲本2 的顺序上样，每一样品的加样量为0.5 μ ；
用不同的NBS引物与限制性酶组合，NBS Profiling在iTete-Q-Tete'上获得358条多态性条带，见表表1 ；如附图1 :NBS-GLPL/7&aI组合的例子所示，N. cyclamineus和Λ tazettaSoleil d ’ Or 具有 ‘Tgte-di-Tgte，的所有 NBS Profiling 条带，iTete-Q-Tete'的所有条带都能追溯到况cyclamineus和Λ tazettaSoleil d，Or中，其它的材料则不具有这一带型特征。因此给N. ' Cyclataz'提供花粉的未知亲本是Λ cj^^^i/^m，水仙花育种人利用已知亲本或来自相同组系的其它种或品种重新合成类似‘Tgte-0-Tgte’特征的新品种成为可能。 表1不同的限制性酶/NBS引物组合在‘Tgte-0-Tgte’上扩增的多态性条代数及其与亲本况cyclamineus禾Π N. tazetta，Soleil d’Or’的相似性
权利要求
1.NBSProfiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，按以下步骤进行(1)供DNA提取的幼叶的采集与保存；(2)总DNA的分离纯化；(3)进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接；(4)NBS Profiling扩增，包括两步PCR反应；(5)扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定。
2.根据权利要求1所述的NBSProfiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法， 其特征在于所述的(1)供DNA提取的幼叶的采集与保存是采集待鉴定的杂交亲本及其杂交后代、或品种及其潜在亲本的幼嫩叶片，立即放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到-18°C _80°C低温下贮存供DNA分离提取；所述的(2)总DNA的分离纯化是采用常用的Fulton法或CTAB法提取幼嫩植物组织的 DNA,用0. 8% 1. 5%琼脂糖电泳和紫外检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度达到100 ng/ μ 1 以上，DNA纯度OD26W值介于1. 8 2. 0之间，所提取的DNA贮藏于_20°C冰箱，于反应前取部分稀释用于NBS Profiing鉴定；所述的(3)进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接是①酶切反应是取步骤(2)获得的植物总DNA，用feal或i&el四碱基识别位点的限制性内切酶将其切割为DNA片段，酶切反应于37°C恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于 65°C水浴锅中IOmin 20min中止反应；②酶切反应产物检测是采用0. 8%_1· 5%琼脂糖电泳检测酶切反应产物，选择能够把植物总DNA切割成不同长度、连续分散的DNA片段的内切酶，用于下一步酶切、末端受体连接反应；③DNA限制性酶消解和末端受体连接是在使用限制性内切酶切割总DNA的同时，将一个末端受体连接到新产生的DNA末端上，末端受体分为平端受体和i&el特异的受体两种；所述的平端受体的碱基序列为 5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3，， 3， NH2 TTCATATCTAGGGT 5' -P 所述的i&el特异的受体的碱基序列为 5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3' 3' NH2- TTCATATCTAGGGTAT 5'酶切和受体连接的反应体系60 μ 1总体系中有切AFLP缓冲液12 μ 1 +末端受体 3 μ 1 + 蒸馏水 36 μ 1 + ATP (10 mM)6 μ 1 + 限制性酶 1 μ 1 + Τ4 连接酶(5 U/μ 1) 1 μ 1 + DNA (100 ng 400 ng) 1 μ 1，酶在加完所有试剂后最后一步加入；酶切和连接反应于37°C恒温条件下反应4h4h或过夜，将反应板置于65°C水浴锅中 IOmin 20min中止反应，反应产物置于4 °C或-20 °C冰箱贮藏；加60 μ 1蒸馏水到所述的酶解-连接反应产物将其稀释一倍后，供下一步的NBS Profiling扩增反应使用； 所述的(4)NBS Profiling扩增，包括两步PCR反应是 ①第一次PCR扩增第一步PCR扩增反应，25 μ 1反应体系为步骤(3)稀释的酶解-连接反应产物5 μ + NBS 特异引物 2 μ 1 + 受体引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 1 μ 1 + IOx PCR 缓冲液2. 5 μ 1 + DNA Taq聚合酶0. 08 μ 1 +蒸馏水12. 42 μ 1 ；PCR扩增反应条件为95°C预变性15 min ;95°C变性30s，55 °C -60 °C退火 100s, 72°C延伸2 min，共30个循环；72°C延伸20min后10°C保存；其中退火温度NBS1、 NBS5、NBS6、NBS GLPL 引物为 55° C，NBS2、NBS3 引物为 60° C ； 受体引物序列为5' GTTTACTCGATTCTCAACCCGAAAG 3'； NBS特异引物序列如下NBS LPL 5' TGYRRAGGAYTRCCffYTAGC 3' NBS 1: 5' GCIARWGTWGTYTTICCYRAICC3' NBS 2: 5' GTWGTYTTICCYRAICCISSCAT3' NBS 3: 5' GTffGTYTTI CC YRAICCISSCATICC 3' NBS 5A: 5' YYTKRTHGTMITKGATGATGTITGG3' NBS 6: 5' YYTKRTHGTMITKGATGATATITGG3'； ②第二次PCR扩增第二步PCR扩增反应是以步骤(4)①中第一次扩增的PCR产物为DNA模板，加入NBS特异引物和标记受体引物进行PCR反应，10 μ 1反应体系为步骤(4)①中第一次扩增的PCR 产物5μ1 + IRD 700标记的受体引物(1 pmolM)0. 6 μ 1 + NBS特异引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 0. 4 μ 1 + IOx PCR 缓冲液 1 μ 1 + DNA Taq 聚合酶 0. 04 μ 1 + 蒸馏水2. 66 μ 1 ；PCR扩增反应条件除延伸温度由IOOs减为40s，PCR循环减为20个循环外， 其余与第一次PCR反应条件相同；所述的(5)扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析是将步骤(4)②中标记的PCR产物进行聚丙烯酰胺胶电泳分离，加入0. 5^1. 5倍体积的溴酚蓝上样缓冲液到步骤(4)②中标记的第二次PCR产物中，混勻样品于94° C条件下变性5 min后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4° C或-20° C冰箱；当鉴定植物杂交后代杂种性时，上样按亲本1 -杂交后代-亲本2的顺序排列样品；当鉴定物种起源时，上样按已知亲本或潜在亲本1 -待鉴定的品种或资源-潜在亲本2的顺序排列样品；每一样品的加样量为0.4 μ Γ0. 5 μ ； 所述的植物杂交后代杂种性、物种起源的判定是如果杂交后代的扩增条带一部分与父本相同、一部分与母本相同，且所有条带都能追溯到杂交亲本中，说明这一杂交后代为真杂种； 如果杂交后代的扩增条带与母本的条带完全相同，说明这一杂交后代为自交种；具有待鉴定的品种或资源所有条带的潜在亲本组合是该待鉴定的品种或资源的亲本。
3.根据权利要求1或2所述的NBSProfiling鉴定植物杂交后代杂种性、 物种起源的方法，其特征在于所述的鉴定物种起源的品种是鉴定水仙花品种 Narcissus iTete-O-Tete^。
4.根据权利要求1或2所述的NBSProfiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，其特征在于所述的鉴定植物杂交后代杂种性的鉴定金丝桃种间杂交后代。
全文摘要
本发明是NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，涉及应用NBS Profiling分子技术领域。该方法(1)提供DNA提取的幼叶的采集与保存；(2)总DNA的分离纯化；(3)进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接；(4)NBS Profiling扩增，两步PCR反应；(5)扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定。该方法可早期快速地鉴定植物育种杂交后代的杂种性，提高育种效率；比较鉴定一些亲本来源不清、性状优良栽培品种的亲本起源，辅助这些品种的性状改良；追溯鉴定一些重要植物资源的亲本起源，促进这些资源的进一步应用。
文档编号C12Q1/68GK102191331SQ201110118999
公开日2011年9月21日 申请日期2011年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者吴景芝, 吴红芝, 金寿林, 陈溪 申请人:云南农业大学