专利名称：单链化的人凋亡素2配体三聚体蛋白质的制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和生物技术药物领域。更具体地，本发明涉及用氨基酸连接臂将人凋亡素2配体(Apo2L)三个单体串联起来,形成单链化(single chain)的人凋亡素2配体三聚体(scApo2L)蛋白质，以及编码scApo2L的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该蛋白质的方法，以及该蛋白质在如肿瘤等疾病治疗中的应用。
背景技术：
1995年，国外报道从人表达标签序列文库(expressed sequence tag,EST)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白质的基因，该基因编码的蛋白质称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又称凋亡素 2配体(apoptotin-21igand,Apo2L),其通过启动细胞固有的凋亡程序,可有效地诱导肿瘤和 转化细胞凋亡，而对正常细胞无影响[Immunity，1995 ;3 (6) =673-682 ；J Biol Chem, 1996 ；271 (22) :12687-12690.]。现国际上将Apo2L统一命名为肿瘤坏死因子(配体)超家族成员 10[tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10],在各大生物数据库中的ID 为HGNC :11925 ；Entrez Gene :8743 ；Ensembl ENSG00000121858 ；UniProtKB :P50591。人Apo2L基因的编码序列有846个核苷酸(SEQ ID NO. I)，编码的Apo2L蛋白质由281个氨基酸组成(SEQ ID NO. 2)。业已证明Apo2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第95或114位开始的胞外区可形成游离的可溶性凋亡素2配体蛋白，同样具有特异启动肿瘤凋亡作用。与肿瘤坏死因子(配体)超家族其他成员一样，Apo2L必须形成三聚体才能发挥生物学作用。三个同源Apo2L分子利用其单体分子内唯一的第230位半胱氨酸与Zn2+螯合，形成三聚体，这是其发挥生物学作用的关键。将该半胱氨酸突变为丝氨酸或甘氨酸后，其结构改变，形成无功能的二聚体，无诱导细胞凋亡的作用；去除螯合的Zn2+，三聚体转换为二聚体，Apo2L的促凋亡活性也基本丧失。结晶结构表明Apo2L分子中的Tyrl83、Tyr243、Phe278对Cys230与Zn2+结合也起到重要作用。现已明确没有形成三聚体的Apo2L具有显著的肝毒性，并与其它毒副作用有关。因此Apo2L的活性形式是必需形成同源三聚体才能与其受体结合，而天然Apo2L三聚体是以非共价方式——依赖三个单体分子各自的第230位半胱氨酸与Zn2+螯合形成同源三聚体，这导致在重组蛋白质的正确折叠、稳定性等方面成为限制性因素。2008年,Krippner-Heidenreich等报道了利用柔性氨基酸将三个TNF a单体融合串联重组表达，即单链化的TNF a三聚体，显示了较原型TNF a在结构稳定性、生物学活性、系统毒性、半衰期延长等方面的明显优势[J Immunol, 2008 ； 180 (12) :8176-83]。这一策略在抗体单链化中也早已成功应用。因此用合适的氨基酸连接臂将Apo2L三个单体分子串联表达，由此所产生的重组蛋白质可以保持Apo2L特异启动肿瘤细胞固有的凋亡程序而发挥抗肿瘤作用，而且具有结构稳定、半衰期延长等特性。因此，本发明所得到的蛋白质可以为抗肿瘤等疾病的治疗提供新的药物或制剂。此外，本领域还迫切需要开发成本低廉和/或步骤简便的单链化Apo2L三聚体的生产工艺。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的具有Apo2L生物活性的药物，它是单链化的Apo2L三聚体蛋白质。本发明的另一目的是提供编码所述蛋白质的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本发明的另一目的是提供一种成本低廉和\或步骤简便的生产所述单链化Apo2L三聚体蛋白质的方法。在本发明的第一方面，提供了一种蛋白质，它包括(a)有三个相同的人凋亡素2配体(Apo2L)元件，该元件具有人凋亡素2配体或其 活性片段的氨基酸序列；(b)三个人Apo2L之间由2段0-20个氨基酸的连接臂序列连接，形成单链化的Apo2L 三聚体(scApo2L)；更佳的，所述的Apo2L元件具有SEQ ID NO. 2中第95-281位或114-281位的氨基酸序列；而且，所述的连接序列为含4-14个氨基酸的接头肽；更佳的，所述的蛋白质具有SEQ ID NO. 4中所示的氨基酸序列；更佳的，所述的蛋白质具有SEQ ID NO. 6中所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明上述的蛋白质；较佳地，所述的DNA分子编码包括SEQ ID NO. 4或6中所示的氨基酸序列的蛋白质；更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO. 3或5中所示的核苷酸序列。在本发明第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。在本发明第四方面，提供了一种产生本发明蛋白质的方法，它包括步骤在适合表达所述蛋白质的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的蛋白质；和分离纯化所述的蛋白质。在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明的蛋白质。在本发明的第六方面，提供了本发明蛋白质的用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物。
图I显示了不同长度的Apo2L以不同氨基酸连接臂拼接的8种单链化Apo2L三聚体蛋白质。其中表示Apo2L氨基酸序列；……表示柔性氨基酸连接臂氨基酸序列；表示金属蛋白酶切位点氨基酸连接臂氨基酸序列。图2显示了一种特征性的由柔性氨基酸连接臂连接的单链化Apo2L三聚体蛋白质重组表达及纯化过程的电泳分析(SDS-PAGE)。其中，A S200进一步纯化的scApo2L蛋白质；B :CM纤维素进一步纯化的scApo2蛋白质；C :蛋白质分子量标记(kD) ；D :金属亲和纯化的ScApo2L ；E :金属亲和纯化ScApo2L蛋白质洗出液；F :表达上清经40%硫酸铵盐析后的沉淀；G :诱导表达3小时后的细菌破碎上清；H :未诱导表达的全菌。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，将三个Apo2L编码序列用氨基酸连接臂编码序列连接在一起，产生由合适的氨基酸连接臂连接的单链化Apo2L的三聚体蛋白质。所述蛋白质具有Apo2L特异启动肿瘤细胞凋亡程序杀伤肿瘤，而且较原型Apo2L结构更为稳定，半衰期明显延长。因此，本发明所得到的单链化Apo2L蛋白质可以为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。定义如本文所用，术语蛋白质中“凋亡素2配体元件”或“Apo2L元件”可互换使用，指在所述蛋白质中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的凋亡素2配体或其可溶性 活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然凋亡素2配体基本上相同的生物活性。优选的Apo2L元件是人凋亡素2配体，更佳的是人凋亡素2配体可溶性活性片段，如SEQ ID NO. 2中第95-281位或114-281位的氨基酸序列。凋亡素2配体的序列可以源自人，也可以源自非人的动物，优选的是来源于人的凋亡素2配体序列。如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于凋亡素2配体元件之间的氨基酸序列，起连接作用的短肽或氨基酸。连接肽的长度通常为0-20个氨基酸，较佳地为3-16个氨基酸,最佳地为6-10个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法[如参见 PNAS1998 ；95 :5929-5934 ；Protein Eng, 2000 ；13(5) :309-312 ；Protein Eng,2003 ；15(11) :871-879等文献]设计连接肽。通常，连接肽不影响或不严重影响凋亡素2配体元件的三个单体分子的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。优选的连接肽例子包括(但并不限于)①为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用GGGGSGGGGS等序列作为连接臂是合适的，如SEQ ID NO. 4中第170-179位和350-359位；②为了有利于蛋白酶把单链化Apo2L三聚体蛋白质切割成3个独立的单体蛋白质分子，可用活性X因子的酶切位点IEGR、肿瘤特异高表达的金属蛋白酶的酶切位点PLGLffA 作连接臂，相似的，chymotrypsin I, papain, plasmin, thrombin, trypsin 等酶的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；③为了有利于纯化，可把6His作为纯化标签或作为连接臂，以用金属亲和层析纯化蛋白质，相似的，麦芽糖结合蛋白(MBP)，谷胱甘肽-S转移酶(GST)等也可设计作为纯化的标签或作为连接臂；④上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如NVVVHQAHHHHHHEFTYK连接臂就是融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His。编码本发明蛋白质的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR扩增或合成的方法获得，甚至从市场购买(如Origene的Cat. No. RC207596)，然后将其拼接在一起，形成编码本发明蛋白质的DNA序列。在获得了编码本发明新蛋白质的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的蛋白质。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)能在真核细胞如CH0、C0S系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。如，选用市售的载体，然后将编码本发明新蛋白质的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽作为前体表达并参与多肽的分泌，那么编码信号肽(分泌前导序列)的DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分 泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明蛋白质的条件下培养该细胞，从而表达出蛋白质。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型单链化Apo2L三聚体蛋白质，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服或局部给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明蛋白质施用于人，其中该安全有效量通常至少约I微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳的该剂量是约10微克/千克体重到约I毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的蛋白质还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物，紫杉醇等微管抑制的药物，及某些激素等各类药物。综上所述，本发明的主要优点如下(I)单链化Apo2L三聚体蛋白质具有Apo2L特异性启动肿瘤细胞凋亡的功能,是一种治疗肿瘤的新型药物。(2)给药方便由于单链化Apo2L三聚体蛋白质结构更为稳定、半衰期的延长,可以较原型Apo2L减少给药濒率。(3)具有靶向性利用特定氨基酸连接臂与肿瘤细胞的特异结合，可以将单链化 Apo2L三聚体蛋白质运抵肿瘤局部发挥作用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照所用材料制造厂商所建议的条件。实施例I建立cDNA文库，筛选得到Apo2L基因I.制备人外周血单个核细胞总RNA按常规用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞，用RPMI-1640培养基(GIBC0公司)，加10%新生小牛血清(杭州四季青生物公司)及青霉素和链霉素培养至贴壁，得单个核细胞，然后用IOii g/L的大肠杆菌R595的内毒素刺激2h，以激活单个核细胞，收集IO7细胞，用总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA，得人外周血单个核细胞总RNA。2 建立cDNA文库，筛选Apo2L基因上述所得的总RNA,用01igo-dT柱(Qiagen公司)纯化得总mRNA,用cDNA合成试剂盒(Clontch公司)按说明书进行cDNA第一链和第二链的合成，加上EcoR I接头后连接到AgtlO载体中，并用\噬菌体包装试剂盒(Clontech公司)包装成\噬菌体文库，建成XgtlOcDNA文库，文库的滴度为6 XlO6。此\ gtIOcDNA文库以IX IO5菌落/LB平板上铺板，在20 X 20cm的硝酸纤维素滤膜上制作重复的印模。用Apo2L理论序列设计随机引物，制备基因探针，杂交筛选文库。含有菌落的重复印膜在含10%硫酸葡聚糖、100 u g/ml tRNA和6X 105cpm/ml探针的平板筛选缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 7. 5, lmol/L NaCl，0. I %焦磷酸钠，0. 2%聚乙烯吡咯烷酮和 0. 2% Ficoll)中 65°C杂交过夜。65°C平板筛选，2X SSC(0. 3mol/L NaCl，30mmol/L柠檬酸钠，PH7. 0)、0. 1% SDS缓冲液洗两次。然后在_40°C与胶片紧密接触，筛选40小时。双份阳性的样品从主平板上挑出对应菌落，转到添加了明胶的缓冲液(lOOmmol/LNaCl, 10mmol/L MgSO4, 50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)的 LB 平板上，得到 12 个阳性噬菌斑。12个纯化的\ DNA用Not I消化，I %琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹确认与探针杂交。挑选与上述探针杂交时，放射性强度最大的克隆(约1.7kp)进行DNA纯化。这些克隆的插入部分被亚克隆到PSP0RT1 (GIBC0公司)的Not I位点。测定质粒中插入部分的DNA序列。从序列分析的结果中得到，其中一个质粒中的插入序列为1769bp，根据Kozak定义的翻译起始位点要求，第88-90位核苷酸(ATG，编码蛋氨酸)为翻译起始位点，所以其包含87bp的5’非翻译区，846bp开放阅读框和3’非翻译区(含多聚腺苷酸化信号或称polyA尾)，其中的编码序列如SEQID NO. I。由此得到所编码的281个氨基酸序列如SEQ ID NO. 2。实施例2RT-PCR得到Apo2L的编码序列I.制备人外周血单个核细胞总RNA(I)按常规方法从人外周血中分离淋巴细胞，进而用贴壁法获得单个核细胞；(2)用细菌内毒素激活单个核细胞以刺激细胞表达更多的基因和提高RNA的丰度，用RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA。
2.逆转录(RT)获得Apo2L的cDNA第一链以上述总RNA为模板，以Pl为引物，逆转录酶催化合成Apo2L cDNA第一链。引物Pl :5’ -TCC AGG TCA GTT AGC CAA C-3’ (SEQ ID NO. 8)3.聚合酶链反应(PCR)扩增获得Apo2L编码序列以上述cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，Tag DNA聚合酶催化合成和扩增Apo2L编码序列。经序列分析，所得DNA序列与各大数据库所显示的Apo2L编码序列一致，即得到了 Apo2L编码核苷酸序列。引物P2 :5，-CTG ACT TAC AGC AGT CAG-3’ (SEQ ID NO. 9)实施例3构建表达蛋白质的表达载体及工程菌通过改建载体pBV220，构建高效表达Apo2L的重组质粒，所构建的表达Apo2L的原核表达载体，命名为pBV-Apo2L。本发明相应的蛋白质的重组表达以同样的方法实施。具体实施步骤如下I.设计并合成寡聚核苷酸双链合成寡聚核苷酸双链，序列如下(未给出互补链的序列)P3 :5，-AAA GAT CTC TCA CCT ACC AAA CAA TGC CCC CCT GCA AAA AAT AAATTCATA TAA AAA ACA TAC AGA TAA CCA TCT GCG GTG ATA AA T TAT CTC TGG CGG TGTTGA CATAAA TAC CAC TGG CGG TGA TAC TGA GCA CA T CAG CAG GAC GCA CTGACCACC ATG MG GTG ACG CTC TTA AM ATT AAG CCC TGA AGA AGG GCA GCA TTCAAAGCA GAA GGC TTT GGG GTG TGT GATACG AAA CGA AGC ATT GG T TAA AAATTA AHnAGG AAT TCA CA-3’ (SEQ ID NO. 10)其中，斜体部分为XPJr串联启动子序列，阴影部分为Cl抑制蛋白结合位点，黑体部分为优化的SD序列，5’端引入BglII酶切位点AGATCT，3’端引入EcoR I酶切位点GAATTC。2.构建表达载体pBV_Apo2L以实施例1、2中得到的、或市售的Apo2L编码序列为模板，P4、P5为引物PCR扩增得5’端带EcoR I、翻译起始密码子ATG、并且优化了与核糖体结合序列之间的距离为7个核苷酸，3’带Pst I酶切位点的Apo2L第114-281位得编码序列，然后以EcoR I和Pst I酶切(工具酶皆购自美国NEB公司)。
P4(pll4Ef) :5，_gc gaa ttc aca atg gtg aga gaa aga ggt c_3，(SEQ ID NO. 11)P5 (p281rP) :5，-acg ctg cag tta gcc aac taa aaa ggc_3’ (SEQ ID NO. 12)接着以Bgl II和EcoR I酶切P3，以Bgl II和Pst I双酶切pBV220质粒。上述各酶切片段琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4DNA连接酶连接各片段，所得到的重组质粒即凋亡素2配体的表达载体，命名为pBV-Apo2L。pBV_Apo2L相比pBV220具有以下特征Apo2L编码序列受上游入噬菌体PlPk串联启动子控制，优化的核糖体结合序列(SD序列)，插入EcoR I酶切位点及翻译起始密码子ATG,同时优化了与SD序列之间的距离为7个核苷酸。该质粒与PBV220同样，在启动子序列中含有clts857结合序列；带有氨苄青霉素抗性基因；转录终止序列rrnB ;质粒上含有编码温度敏感蛋白因子clts857基因，在42°C时该编码产物失活，从而失去对启动子的抑制，启动子控制的下游外源基因被表达。上游调控序列、优化的SD序列、Apo2L编码序列及 翻译终止序列等特征核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。3.引入限制性内切酶酶切位点构建单链化的人凋亡素2配体三聚体蛋白质表达载体用上述同样的方法，以表I所列序列为引物(所列引物只部分列举了扩增图I中所列8种蛋白质)，以上述实施例或市售(如Origene的Cat. No. RC207596)所得的人凋亡素2配体编码序列为模板，分别PCR扩增各单体人凋亡素2配体编码DNA片段，相应限制性内切酶酶切各PCR产物，T4DNA连接酶连接入已用限制性内切酶EcoR I与Pst I酶切的上述改建的PBV220载体，转化感受态细胞，筛选含重组质粒的克隆，DNA序列测定证实，即可得到表达各蛋白质的表达工程菌。以构建图I中B形式(柔性氨基酸连接臂连接)的scApo2L表达载体为例，首先分别以 SEQ ID NO. 11 与 SEQ ID NO. 14，SEQ ID NO. 18 与 SEQ ID NO. 16，SEQ ID NO. 19 与SEQID NO. 12为引物，以人凋亡素2配体编码序列为模板，分别PCR扩增三个单体人凋亡素2配体编码DNA片段，EcoR I与BamH I酶切SEQ ID NO. 11与SEQ ID NO. 14的PCR扩增产物，BamH I 与 Sal I 酶切 SEQ ID NO. 18 与 SEQ ID NO. 16 的 PCR 扩增产物，Sal I 与 Pst I酶切SEQ ID NO. 19与SEQ ID NO. 12的PCR扩增产物，T4DNA连接酶连接各片段，然后插入已用限制性内切酶EcoR I与Pst I酶切的上述改建的PBV220载体，转化感受态细胞，筛选含重组质粒的克隆，DNA序列测定证实，即可得到表达各蛋白质的表达工程菌，相应重组质粒即为柔性氨基酸连接臂连接的scApo2L表达质粒。同样的，为获得金属蛋白酶切位点(PLGLWA)连接的ScApo2L(例如图1_D所示)，就以 SEQ ID NO. 11 与 SEQ ID NO. 20，SEQ ID NO. 18 与 SEQ ID NO. 21，SEQ ID NO. 19 与 SEQIDN0. 12为引物，以人凋亡素2配体编码序列为模板，分别PCR扩增三个单体人凋亡素2配体编码DNA片段，EcoR I与BamH I酶切SEQ ID NO. 11与SEQ ID NO. 20的PCR扩增产物，BamH I 与 Sal I 酶切 SEQ ID NO. 18 与 SEQ ID NO. 21 的 PCR 扩增产物，Sal I 与 Pst I 酶切SEQ IDN0. 19与SEQ ID NO. 12的PCR扩增产物，T4DNA连接酶连接各片段，然后插入已用限制性内切酶EcoR I与Pst I酶切的上述改建的PBV220载体，转化感受态细胞，筛选含重组质粒的克隆，DNA序列测定证实，即可得到表达各蛋白质的表达工程菌，相应重组质粒即为金属蛋白酶切位点连接的scApo2L表达质粒。同样的，Apo2L三个单体间2段氨基酸连接臂序列可以不同，如图I所示的E-F。制备这些ScApo2L表达载体时，就是PCR扩增时引物间的组合不同，其余构建条件是一致的。表I引物核苷酸序列表以Apo2L编码序列为模板，PCR扩增以不同氨基酸连接臂的单链化Apo2L(如图I所示)各单体所用引物。P表示引物，中间数字表示所编码的氨基酸的起始或终止位置，f表示正向引物，r表示反向引物，E表示引入EcoR I酶切位点，G表示引入柔性氨基酸连接臂编码序列，B表示引入BamH I酶切位点，S表示引入Sal I酶切位点，M表示引入金属蛋
白酶酶切位点编码序列
名称 Wn序列号^
p95Ef 5’-gc gaa ttc aca atg acc tct gag gaa acc att tc-39SEQ ID NO. 13
5，-aa gga tcc get tcc gcc ccc gcc get ccc gcc tcc gcc gcc aac taa aaa ggc^
p281 rBG^，SEQ ID NO. 14
ccc g-3
p95Bf 5’-aa gga tcc acc tct gag gaa acc att tc-3’SEQ ID NO.15
*01S5-aa gtc gac get tcc gcc ccc gcc get ccc gc^tcc gcc gcc aac taa aaa ggc
p2oxro(jaby IJJ InU. Io ccc g-3
p95Sf5，_aa gtc gac acc tct gag gaa acc att tc-3 ’SEQ ID NO. 17
pi l4Bf5，-aa gga tcc gtg aga gaa aga ggt cct c-3，SEQ ID NO. 18
pll4Sf5’-aa gtc gac gtg aga gaa aga ggt cct o3’SEQ ID NO. 19
p281rBM 5，-aa gga tcc tec cca taa tcc taa tgg gcc aac taa aaa ggc ccc g-3’SEQ ID N0.20
p281rSM5’-aa gtc gac tgc cca taa tcc taa tgg gcc aac taa aaa ggc ccc g-3’SEQ ID N0.21注所需pll4Ef 即为 P4(SEQ ID NO. 11)，p281rP 即为 P5 (SEQ ID NO. 12)由此得到了一系列分别表达不同连接方式的scAp02L蛋白质的重组质粒。特别的，用所列举的引物制备得到的如图I所示的8种scApo2L重组蛋白质可直接表现出在体外杀伤肿瘤细胞，在体内抑制移植的肿瘤生长的生物学作用。一种优选的表达scApo2L蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所推断的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。另一种优选的表达scAp02L蛋白质的核苷酸序列可以如SEQ ID NO. 5所示，所推断的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。至此，本发明所涉及的所有核苷酸或氨基酸序列均已列出，见核苷酸和氨基酸序列表。序列表编号说明如下SEQ ID NO. I :Apo2L编码核苷酸序列SEQ ID NO. 2 Apo2L 氨基酸序列SEQ ID NO. 3 :柔性氨基酸连接臂连接的scApo2L编码核苷酸序列SEQ ID NO. 4 :柔性氨基酸连接臂连接的scApo2L氨基酸序列SEQ ID NO. 5 :金属蛋白酶切位点连接的scApo2L编码核苷酸序列SEQ ID NO. 6 :金属蛋白酶切位点连接的scApo2L氨基酸序列SEQ ID NO. 7 :pBV_Apo2L 特征核苷酸序列SEQ ID NO. 8-21 :引物和接头的核苷酸序列实施例4
转化大肠杆菌，建立工程菌按常规将实施例3中获得的pBV-Apo2L等一系列重组表达质粒转化大肠杆菌BL21[基因型hsdS gal(A clts857indl Sam 7 nin 5 lacUV5_I7)](可购自上海生工生物工程公司)，从氨苄抗性菌落中分离质粒DNA，酶切鉴定，测序确认，所得的阳性克隆即为表达相应蛋白质的工程菌。实施例5制备scApo2L蛋白质各种培养基如下LB培养基用作试管种子培养，2XYT培养基用作二级种子培养，半合成培养基用于发酵，补料分批加入培养。LB培养基配方(g/L):蛋白胨酵母粉NaCl = 10 5 5 ； 2XYT培养基配方(g/L):蛋白胨酵母粉NaCl = 16 10 5 ；半合成发酵培养基中配方(g/L):蛋白胨酵母粉KH2PO4 K2HPO4 Na2HPO4. 12H20 (NH4)2SO4 NH4Cl = 5:5:2:4:7: I. 2:0. 2;各种微量元素溶液，浓度为(g/L)=MnSO4. 5H20 CaCl2. 6H20 Na2MoO4. 2H20 ZnCl2CuSO4. 5H20 H3BO4 FeSO4. 7H20 CaCl2. 2H20 MgSO4. 7H20 = 0. 001 0.004 0.002 0.0
02 0. 001 0. 0005 0. 02 0. 02 0. 3 ；发酵补料配方(g/L):葡萄糖酵母粉蛋白胨MgSO4. 7H20 =200 : 70 : 70 : 5.7。培养基的pH值全部调为7. 2。各种培养基高温灭菌后加入氨苄青霉素终浓度至100 Ii g/ml。一级种子培养过夜后，以I : 20 100的比例转接至二级种子，发酵罐按工作体积的I 5%接种入培养过夜的二级种子。培养分两个阶段进行，32°C培养5-7小时；升温至42°C培养4-5小时。恒流泵添加补料，溶解氧控制在30-50%之间。可得到约30-100克/升发酵液的湿菌体。超声破碎发酵菌体,离心取上清,过0. 22 u m的滤膜；用NTA Supperf low (Qiagen公司)或TALON Metal Affinity Rsins (Clontech公司)等金属亲和层析柱行亲和层析，5 10mmol/L咪唑，pH7. 0洗脱杂蛋白，再以80 100mmol/L咪唑，pH7. 0，洗脱重组蛋白质；洗脱液过CM纤维素,收集活性组分；再过Sephacryl S-200进一步纯化,即可得到高纯度的重组蛋白质。结果以图I-B所示的一种蛋白质(即scApo2L)进行原核重组表达为例，所构建的工程菌经热诱导表达，超声破碎后，离心所分离的上清行SDS-PAGE，可见所表达的蛋白质占上清总蛋白的10%以上，进一步纯化后达电泳纯，结果见图2。其余的各种ScApo2L诱导表达后可取得类似结果，得到相应分子量大小的重组蛋白。实施例6蛋白质的生物学活性确定在本实施例中，测定蛋白质所具有的scApo2L活性。scApo2L的活性在体外可以人胰腺导管上皮细胞癌1990株细胞、人大细胞肺癌NCI-H460、小鼠黑色素瘤B16等为靶细胞，确定scApo2L的生物学活性，体内以抑制裸鼠的人结肠癌HCT-8移植瘤等在体外对ScApo2L敏感、在体内能成瘤的小鼠移植瘤为模型，验证scApo2L的生物学功能。具体测试操作如下I、scApo2L活性分析杀伤各种肿瘤细胞各种靶细胞来源于中国科学院细胞研究所或上海长海医院。主要有人胰导管上皮细胞癌1990、8898株，人大细胞肺癌NCI-460，人结肠癌HCT-8，人胃癌M85株、人神经母细胞瘤SK-N-SH株、人喉癌Hep-2株、人鼻咽癌CNE-2株、人内皮细胞CEV304株、人成纤维细胞株、人结肠癌AT-29、人卵巢癌3A0、鼠成纤维L929株、人神经胶质瘤U251、人乳癌、人肝癌IfepG-2、SMMU7721、人血液学肿瘤(U937、Jukart、HL60 等)、黑色素瘤 B16_MB、Ehrlich 腹水瘤、Lewis肉瘤等。以H460细胞为例，将培养细胞以2X IO8细胞/L种入96孔细胞培养板，37°C 5%CO2孵箱中孵育4-6小时，弃上清；用完全培养基将样品做梯度稀释后加入细胞板；同时观 察加入I. 5 u g/ml放线菌素D后对各种因子杀伤细胞的影响；活性单位定义使培养板孔中的细胞50%死亡为I个单位，效价即达到50%杀伤时样品稀释度的倒数。以结晶紫法作定量分析贴壁细胞弃上清，以结晶紫固定液(5g/L结晶紫，80mL/L甲醛，lg/L NaCl,200mL/L乙醇)染色15分钟，蒸馏水洗去结晶紫，晾干，被染色者为活细胞。每孔再加入200 u L 330mL/L的乙酸，摇床旋转使结晶紫溶解，置酶联仪于波长595nm读出A值，以未加细胞的空白孔为A本底。悬浮细胞以MTT法确定活细胞数。其活性效价以样品稀释度的对数与A595nm的均数作直线回归，得到常数A、B，以(A对照-A本底)/2为50%杀伤终点(Y) o按Y = A+BlgX算出样品的活性单位，即X值。同时,该细胞scApo2L蛋白质作用下呈典型的凋亡形态，如IOii g/L的scApo2L作用下，2小时即观察到细胞发生典型变化。2.蛋白质抑制小鼠移植瘤各种肿瘤细胞的体内外的扩增液氮冻存的肿瘤细胞复苏后培养或接种入昆明种小鼠腹腔(IO7细胞/小鼠)。10天后处死小鼠，无菌条件下吸取小鼠腹水，用PBS调节细胞浓度为108/ml。以该细胞悬液0.2ml接种于实验小鼠皮下。随机分组，每组6只小鼠，皮下接种的小鼠分别给予0 (PBS，对照组)、10、100、1000 U g (样品)/kg (小鼠体重)，隔天给药，2周。停药I周后，处死小鼠，剥离肿瘤称重，计算每组平均瘤重和抑瘤率，分析结果。抑瘤率以下式计算
.对照组平均瘤重一给药组平均瘤重
抑瘤率(％)= - X100%
、’对照组平均瘤重结果人结肠癌细胞HCT-8移植瘤的结果如表2。表2 HCT-8测试结果表
权利要求
1.一种蛋白质，其特征在于它由下列元件组成 (a)有三个相同的人凋亡素2配体(Apo2L)元件，该元件具有人凋亡素2配体或其活性片段的氨基酸序列，即具有SEQ ID NO. 2中第95-281、或114-281位的氨基酸序列； (b)三个人Apo2L之间由2段0-20个氨基酸的连接臂序列连接，形成单链化的Apo2L三聚体(scApo2L)。
2.如权利要求I所述的蛋白质，其特征在于，所述的连接序列各含6-14个氨基酸。
3.如权利要求I所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质具有SEQID N0.4、6中所示的氨基酸序列。
4.一种人工合成的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求I所述的蛋白质。
5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有SEQID NO. 3、5中所示的核苷酸序列。
6.—种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.—种产生权利要求I所述蛋白质的方法，其特征在于步骤如下(1)建立cDNA文库，筛选得到Apo2L基因；(2)RT-PCR得到Apo2L的编码序列；(3)构建单链化Apo2L表达载体；(4)转化大肠杆菌，建立工程菌；(5)制备蛋白质；(6)蛋白质的生物学活性确定。
9.一种药物组合物，其特征在于，由药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求I所述的蛋白质组成。
10.权利要求I所述蛋白质的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明提供了以不同氨基酸连接臂连接的单链化(single chain)的人凋亡素2配体(Apo2L)三聚体蛋白质(scApo2L)，以及编码这些蛋白质的DNA序列，含编码这些DNA序列的载体，含这些载体的宿主细胞，用基因工程制备这些蛋白质的方法，以及含这些蛋白质的药物组合物。本发明的单链化Apo2L三聚体蛋白质具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，所以可以用于制备治疗如肿瘤等疾病的药物。
文档编号C12N5/10GK102775491SQ20111011887
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者焦炳华, 王梁华 申请人:中国人民解放军第二军医大学