专利名称：北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工培养合成北冬虫夏草多糖工艺，具体就是一种采用生物两阶段发酵法合成北冬虫夏草多糖的方法。
背景技术：
北冬虫夏草菌[Cordyc印s militaris](通称蛹虫草)是鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属幼虫被中国被毛孢寄生后形成的虫菌复合体，属国家二级保护的名贵药材，与人参、鹿茸并列为中国的“中药三大宝”之一。它含有多种有效成分(如虫草菌丝、多糖、虫草素等)，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化及降血糖的作用，市场需求极大。但是，野生冬虫夏草生长周期过长，而且由于对野生虫草的滥挖滥采，不但严重破坏生态环境，而且造成天然虫草濒临灭绝。因此，必须找出既能满足市场需求又能不破坏野生虫草资源的有效方法。目前，对虫草的人工培养方法主要有人工栽培和液体深层培养两种方法。人工栽培周期长，获得的虫草产量低，难以满足生产需求。液体深层培养具有周期短，设备利用率高等优点，更有利于大规模工业化生产。但主要是生产菌体，而生物活性物质(多糖)产量相对较低。因此，如果能开发一种既能获得大量动冬虫夏草菌体、又能生产大量生物活性物质(多糖)的培养方法，将对于提高虫草生产效率，开发高附加值的虫草产品，实现工业化大规模生产具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，它操作工艺简单，适合大规模工业化生产。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现本发明一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，它包括以下步骤a.保存菌种将生长在马铃薯斜面培养基的北冬虫夏草菌种保存在4°C冰箱中备用。b.斜面菌种活化将上述步骤a中保存的北冬虫夏草菌种用灭菌后的接种铲转接到马铃薯斜面培养基，在25°C恒温箱中培养7天得到活化后的北冬虫夏草菌种，备用。C.种子培养将上述步骤b活化后的北冬虫夏草菌种用灭菌的接种钩切约lcm2 带培养基的斜面菌丝转入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床中25°C、150r/ min震荡培养4-5天，得到种子液备用。所述种子培养基的营养成分及加入量如下葡萄糖蛋白胨 KH2PO4
30g IOg O.lg 0.5g
MgS04.7H20按上述组分及加入量配成液体的种子培养基，在121°C，0. IMI^a下加热灭菌20分钟后冷却，待用。d.发酵培养将上述步骤c培养好的种子液以10%接种量接入含发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵培养过程包括两个阶段第一阶段发酵条件包括发酵罐温度25°C，通风量lvvm，搅拌转速100-150rpm，发酵罐压0. 05MPa的条件下培养4-5天。第二阶段发酵条件发酵罐罐温25°C，通风量0vvm(不通气)，搅拌转速30-50rpm 条件下培养2-3天，得冬虫夏草菌体培养液。所述发酵培养基的营养成分及加入量如下按上述组分及加入量配成液体的发酵培养基，在121°C，0. IMI^a下加热灭菌20分钟后冷却，待用。e.过滤分离菌体将上述步骤d发酵结束后的冬虫夏草菌体培养液用不锈钢板框过滤机过滤冬虫夏草菌体，得冬虫夏草菌体和上清液，过滤收集的冬虫夏草菌体用蒸馏水冲洗三次，于60-70°C干燥，冬虫夏草菌体含水量控制在7-8%。f.乙醇醇析将上述步骤e得到的上清液加入两倍体积的95%的乙醇醇析，在磁力搅拌机上以200r/m搅拌30分钟后，在4°C过夜。g.离心干燥将上述步骤f过夜后的液体进行12000rpm离心，收集沉淀物，在 70-80°C恒温烘箱烘干，含水量控制在7-8%，获得干燥的北冬虫夏草多糖。h.粉碎储存将上述步骤g干燥后的北冬虫夏草多糖粉碎过筛，置于通风干燥处储存，得本发明产品北冬虫夏草多糖。所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，所述马铃薯斜面培养基的制备包括先将200g 土豆去皮切成小块，加入水1. OL煮沸30min，用6层布过滤，取滤液，获得马铃薯汁，然后将制备好的马铃薯汁定容至1. 0L，在121°C灭菌20分钟备用；之后再加入葡萄糖20g和琼脂20g，获得马铃薯斜面培养基。优选的，所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，所述发酵培养基的营养成分及加入量如下
葡萄糖蛋白胨 KH2PO4
阼相g f 4 1 1· O
O
MgS04.7H20葡萄糖酵母粉蛋白胨 K2HPO4
40g IOg IOg O.lg 0.5 g
MgS04-7H20 pH6.8-7.0优选的，所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，所述发酵培养过程中，种子液以5%接种量接入含发酵培养基的发酵罐中，发酵培养过程包括两个阶段第一阶段发酵条件包括发酵罐温度25°C，通风量lvvm，搅拌转速100-150rpm，发酵罐压 0. 05MPa的条件下培养6-7天；第二阶段发酵条件发酵罐罐温25°C，通风量Ovvm，搅拌转速20-30rpm条件下培养1_2天。所用北冬虫夏草菌是保藏于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”，保藏登记号为=CICC 14015 ；分类命名=Cordyceps militaris。本发明将北冬虫夏草菌种接种在马铃薯斜面培养基上恒温培养7天后接入含种子培养基的三角瓶中震荡培养4-5天。然后接入含发酵培养基的发酵罐中，发酵过程如下 恒温通风搅拌条件下培养北冬虫夏草4-5天，此阶段主要是提供给适合北冬虫夏草菌体生长的培养条件，使北冬虫夏草大量的繁殖；然后在恒温不通风，轻微搅拌条件下培养2-3 天，此过程是为了使北冬虫夏草大量合成多糖；培养液离心，获得的上清液中加入两倍体积的乙醇，搅拌4°C过夜，再次离心获得的沉淀物经过干燥获得北冬虫夏草多糖。所用北冬虫夏草菌是斜面菌株特征在马铃薯斜面培养基上，培养三天可以见到白色绒毛状菌体，培养七天基本长满斜面，本发明给出的方法所生产的北冬虫夏草多糖药用价值和营养价值均与天然北冬虫夏草相同，该工艺可显著缓解对冬虫夏草药用资源紧张的局面。本发明与现有技术相比具有的有益效果为本发明根据北冬虫夏草生长和代谢特征设计了两阶段发酵培养工艺合成多糖，利用本发明工艺既能获得大量北冬虫夏草菌体，又能够获得高产量的北冬虫夏草多糖。因此， 本发明的两阶段液体深层发酵工艺合成虫草多糖的效率远高于传统的液体深层发酵工艺。 比传统液体深层培养工艺北冬虫夏草多糖产量提高75%。此外，本发明工艺设计合理，操作简单，适合大规模工业化生产，能解决药源紧缺的局面，满足市场需求，效益显著。
具体实施例方式下面对本发明作进一步的详细说明。实施例一本发明一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，它包括以下步骤a.保存菌种将生长在马铃薯斜面培养基的北冬虫夏草菌种保存在4°C冰箱中备用。b.斜面菌种活化
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菌种活化将上述步骤a中保存的北冬虫夏草菌种用灭菌后的接种铲转接到马铃薯斜面培养基，在25°C恒温箱中培养7天得到活化后的北冬虫夏草菌种，备用。c.种子培养将上述步骤b活化后的北冬虫夏草菌种用灭菌的接种钩切约lcm2 带培养基的斜面菌丝转入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床中25°C、150r/ min震荡培养4-5天，得到种子液备用。所述种子培养基的营养成分及加入量如下
葡萄糖30g
蛋白胨IOg
KH2PO4O.lg
MgS04.7H200.5g按上述组分及加入量配成液体的种子培养基，在121°C，0. IMPa下加热灭菌20分钟后冷却，待用。d.发酵培养将上述步骤c培养好的种子液以10%接种量接入含发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵培养过程包括两个阶段第一阶段发酵条件包括发酵罐温度25°C，通风量lvvm，搅拌转速100-150rpm，发酵罐压0. 05MPa的条件下培养4-5天。第二阶段发酵条件发酵罐罐温25°C，通风量0vvm(不通气)，搅拌转速30-50rpm 条件下培养2-3天。所述发酵培养基的营养成分及加入量如下
葡萄糖40g
蛋白胨IOg
KH2PO4O.lg
MgS04.7H200.5g按上述组分及加入量配成液体的发酵培养基，在121°C，0. IMPa下加热灭菌20分钟后冷却，待用。e过滤分离菌体将上述步骤d发酵结束后的冬虫夏草菌体培养液用不锈钢板框过滤机(SHXBCRA150-10C，上海信步科技有限公司生产的)过滤冬虫夏草菌体，得冬虫夏草菌体和上清液，过滤收集的冬虫夏草菌体用蒸馏水冲洗三次，于60-70°C干燥，冬虫夏草菌体含水量控制在7-8%。f乙醇醇析将上述步骤e得到的上清液加入两倍体积的95 %的乙醇醇析，在磁力搅拌机上以200r/m搅拌30分钟后，在4°C过夜。g离心干燥将上述步骤f过夜后的液体进行12000rpm离心(SS600，12000rpm，沈阳化工学院机械厂生产的离心机)，收集沉淀物，在70-80°C恒温烘箱烘干，含水量控制在 7-8 %，获得干燥的北冬虫夏草多糖。h粉碎储存上述步骤g干燥后的北冬虫夏草多糖粉碎过筛，置于通风干燥处储存，得本发明产品北冬虫夏草多糖。实施例2本实施例的两阶段发酵培养工艺方法，与实施例1的不同之处在于所述发酵培养基的营养成分及加入量如下实施例3本实施例的两阶段发酵培养工艺方法，与实施例1的不同之处在于发酵培养过程中，种子液以5%接种量接入含发酵培养基的发酵罐中，发酵培养过程包括两个阶段: 第一阶段发酵条件包括发酵罐温度25°C，通风量lvvm，搅拌转速100-150rpm，发酵罐压 0. 05MPa的条件下培养6-7天；第二阶段发酵条件发酵罐罐温25°C，通风量0vvm(不通气)，搅拌转速20-30rpm条件下培养1_2天。本发明与现有技术相比具有的优点为本发明根据北冬虫夏草生长和代谢特征， 设计建立了两阶段发酵培养工艺合成北冬虫夏草多糖，利用本发明工艺既能获得大量北冬虫夏草菌体，又能够获得高产量的北冬虫夏草多糖。在发酵培养过程的第一阶段，由于通风和搅拌作用，发酵液中溶解氧供应充足，北冬虫夏草菌体生长快，接菌4天后葡萄糖基本被耗净，在此阶段，北冬虫夏草菌体快速生长，但此北冬虫夏草多糖合成较慢。在第二阶段，此阶段培养基中的葡萄糖被大量消耗，北冬虫夏草菌体基本进入稳定期，此时停止通风，并将搅拌转速降低，使发酵液中的溶解氧下降，北冬虫夏草菌体在此阶段不再生长，开始大量合成胞外北冬虫夏草多糖，而发酵液中低的溶解氧环境又有利于北冬虫夏草多糖的合成，因此，本发明的两阶段液体深层发酵工艺合成北冬虫夏草多糖的效率远高于传统的液体深层发酵工艺。比传统液体深层培养工艺北冬虫夏草多糖产量提高75%。本发明与传统液体深层培养北冬虫夏草多糖工艺比较见下表。表1两阶段液体深层培养北冬虫夏草多糖与传统液体深层培养工艺的比较
权利要求
1. 一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，其特征是，它包括以下步骤a.保存菌种将生长在马铃薯斜面培养基的北冬虫夏草菌种保存在4°C冰箱中备用；b.斜面菌种活化将上述步骤a中保存的北冬虫夏草菌种用灭菌后的接种铲转接到马铃薯斜面培养基， 在25°C恒温箱中培养7天，得到活化后的北冬虫夏草菌种，备用；c.种子培养将上述步骤b活化后的北冬虫夏草菌种用灭菌的接种钩切约lcm2带培养基的斜面菌丝转入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床中25°C、150r/min震荡培养4-5天，得到种子液备用；所述种子培养基的营养成分及加入量如下葡萄糖30g蛋白胨1OgKH2PO4O.lgMgS04-7H200.5g按上述组分及加入量配成液体的种子培养基，在121°C，0. IMPa下加热灭菌20分钟后冷却，待用；d.发酵培养将上述步骤c培养好的种子液以10%接种量接入含发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵培养过程包括两个阶段第一阶段发酵条件包括发酵罐温度25°C，通风量lvvm，搅拌转速100-150rpm，发酵罐压0. 05MPa的条件下培养4-5天；第二阶段发酵条件发酵罐罐温25°C，通风量Ovvm (不通气)，搅拌转速30-50rpm条件下培养2-3天，得冬虫夏草菌体培养液；所述发酵培养基的营养成分及加入量如下葡萄糖40g蛋白胨1OgKH2PO4O.lgMgS04-7H200.5g按上述组分及加入量配成液体的发酵培养基，在121°C，0. IMPa下加热灭菌20分钟后冷却，待用；e.过滤分离菌体将上述步骤d发酵结束后的冬虫夏草菌体培养液用不锈钢板框过滤机过滤冬虫夏草菌体，得冬虫夏草菌体和上清液，过滤收集的冬虫夏草菌体用蒸馏水冲洗三次，于60-70°C干燥，冬虫夏草菌体含水量控制在7-8% ；f.乙醇醇析将上述步骤e得到的上清液加入两倍体积的95%的乙醇醇析，在磁力搅拌机上以200r/m搅拌30分钟后，在4°C过夜；g.离心干燥将上述步骤f过夜后的液体进行12000rpm离心，收集沉淀物，在70-80°C 恒温烘箱烘干，含水量控制在7-8%，获得干燥的北冬虫夏草多糖；h粉碎储存将上述步骤g干燥后的北冬虫夏草多糖粉碎过筛，置于通风干燥处储存， 得本发明产品北冬虫夏草多糖。
2.如权利要求1所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，其特征是， 所述马铃薯斜面培养基的制备包括先将200g 土豆去皮切成小块，加入水1. OL煮沸30min,用6层布过滤，取滤液，获得马铃薯汁，然后将制备好的马铃薯汁定容至1. 0L,在 121°C灭菌20分钟备用；之后再加入葡萄糖20g和琼脂20g，获得马铃薯斜面培养基。
3.如权利要求1所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，其特征是， 所述发酵培养基的营养成分及加入量如下葡萄糖40g酵母粉IOg蛋白胨IOgK2HPO4o.igMgSO4JH2O0.5 gpH6.8-7.0
4.如权利要求1所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，其特征是， 所述发酵培养过程中，种子液以5%接种量接入含发酵培养基的发酵罐中，发酵培养过程包括两个阶段第一阶段发酵条件包括发酵罐温度25°C，通风量lvvm，搅拌转速100-150rpm，发酵罐压0. 05MPa的条件下培养6-7天；第二阶段发酵条件发酵罐罐温 25 0C，通风量Ovvm，搅拌转速20-30rpm条件下培养1_2天。
全文摘要
本发明属微生物领域，具体涉及一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺，本发明将北冬虫夏草菌种接种在马铃薯斜面培养基上恒温培养后接入含种子培养基的三角瓶中震荡培养，然后接入含发酵培养基的发酵罐中，发酵过程如下恒温通风搅拌条件下培养北冬虫夏草4-5天，此阶段主要是提供给适合北冬虫夏草菌体生长的培养条件，使北冬虫夏草大量的繁殖；然后在恒温不通风、轻微搅拌条件下培养2-3天，将培养液离心，获得的上清液中加入两倍体积的乙醇，搅拌，4℃过夜，再次离心获得的沉淀物经过干燥获得北冬虫夏草多糖，本发明工艺设计合理，操作简单，适合大规模工业化生产，能解决药源紧缺的局面，效益显著。
文档编号C12P19/04GK102154407SQ201110134499
公开日2011年8月17日 申请日期2011年5月24日 优先权日2011年5月24日
发明者孙立梅, 崔建东, 张思 申请人:河北科技大学