专利名称：一种仔稚鱼快速分类鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种仔稚鱼快速分类鉴定方法。
背景技术：
鱼类处于早期发育阶段时形态和生理均会发生显著变化，从而具有明显的阶段性特征，目前得到普遍认可的观点为早期发育阶段包含胚胎期、仔鱼期及稚鱼期，鱼类早期资源调查即以处于这一阶段的鱼类个体为对象进行的资源调查工作。开展鱼类早期资源调查，既能推算鱼类繁殖群体数量，又可以估算补充群体数量，进而科学地预测鱼类种群数量变动，为渔业资源保护和合理开发利用提供科学依据。国内的相关工作进展缓慢，现有的研究主要集中于鱼类早期发育过程中的生理生态研究，关于仔稚鱼区系组成、种群结构以及分布特征等资源层面的生态学研究开展较少。由于早期发育阶段的鱼类个体极小，各种外部形态尚未发生分化，个体间差异很难通过目测加以区分，因此样本分类鉴定工作已经成分制约仔稚鱼生态学研究发展的技术瓶颈。在以往的研究中，为了提高鉴定的准确性，通常采用先对苗种进行短期培育，待形态发生分化后再行鉴定的方法，但在苗种采集量较大、死亡率较高以及调查水域距离较远时，常规方法具有明显的局限性。
发明内容
本发明的目的即为克服常规方法的不足之处，提供一种仔稚鱼快速分类鉴定方法。本发明为实现上述目的，采用如下技术方案
一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，包括以下步骤
(1)在调查水域采集可以准确分类鉴定的鱼类样本，提取样本DNA，通过对特征片段进行扩增、测序，获得相应序列，从而建立该水域鱼类DNA指纹库；
(2)在调查水域采集仔稚鱼样本，提取样本DNA，对特征片段进行PCR扩增、测序；
(3)将获得的仔稚鱼特征片段序列与事先建立的DNA指纹库进行比对，判断仔稚鱼种类。步骤(1)中所述DNA提取方法为取背部新鲜肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常规方法抽提DNA，-20°C保存备用。所述的特征片段为线粒体16S rRNA。所述特征片段通用扩增引物为
Forward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ； Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT。所述的PCR扩增的反应体系为94°C预变性2分钟；每一循环94°C 1分钟，57 °C 30秒，72 °C 1分钟；共35个循环，最后72°C延伸8分钟；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用glassmilk纯化试剂盒回收，测序。本发明在采集仔稚鱼后仅需要用70%的酒精保存，不需要复杂的保存条件，同时选择线粒体16S rRNA这一相对保守的片段为特征片段建立调查水域鱼类DNA指纹库，对仔
3稚鱼特征片段进行扩增、测序并将序列与DNA指纹库进行比对的方法对调查水域仔稚鱼进行分类鉴定。该方法鉴定准确度高，实验周期短，对样本要求低，克服了现有方法的局限性， 显示了其准确、便捷、快速的优势。
具体实施例方式
本发明为一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，采用以下步骤
1、在调查水域通过定点捕捞、市场购买等方法获取可以准确分类鉴定的鱼类样本，取背部新鲜肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常规方法抽提DNA，-20°C保存备用；
2、选择相对保守的线粒体16SrRNA片段为特征片段，选择通用扩增引物为；Reward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ；
Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT ；
3、PCR扩增的反应体系为94°C预变性2分钟；每一循环94°C1分钟，57°C 30秒，72°C 1分钟，共35个循环，最后72°C延伸8分钟；
4、PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用glassmilk纯化试剂盒回收，测序；
5、将各鱼类的线粒体16SrRNA片段序列汇总，建立DNA指纹库；
6、在调查水域采集仔稚鱼样本，保存于70%酒精中带回实验室，首先在显微镜或解剖镜下观察，将目测初筛后无法准确辨认的样本编号，按步骤1所述的实验程序分别提取DNA 并保存于_20°C冰箱中备用；
7、对制备好的仔稚鱼样本DNA按步骤2-4所述的实验程序，通过扩增、测序获得各个样本线粒体16S rRNA片段序列；
8、将仔稚鱼线粒体16SrRNA片段序列与已经建立的DNA指纹库进行比对，并对仔稚鱼样本进行分类鉴定。
权利要求
1.一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，包括以下步骤(1)在调查水域采集可以准确分类鉴定的鱼类样本，提取样本DNA，通过对特征片段进行扩增、测序，获得相应序列，从而建立该水域鱼类DNA指纹库；(2)在调查水域采集仔稚鱼样本，提取样本DNA，对特征片段进行PCR扩增、测序；(3)将获得的仔稚鱼特征片段序列与事先建立的DNA指纹库进行比对，判断仔稚鱼种类。
2.根据权利要求1所述的一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，其特征在于步骤(1)中所述DNA提取方法为取背部新鲜肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常规方法抽提 DNA, _20°C保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，其特征在于所述的特征片段为线粒体16S rRNA。
4.根据权利要求1所述的一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，其特征在于所述特征片段通用扩增引物为Forward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ； Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT。
5.根据权利要求1所述的一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，其特征在于所述的PCR扩增的反应体系为94°C预变性2分钟；每一循环940C 1分钟，57 °C 30秒，72 °C 1分钟；共 35个循环，最后72°C延伸8分钟；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用glassmilk纯化试剂盒回收，测序。
全文摘要
本发明涉及一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，其特征是采集调查水域中可以准确分类鉴定的鱼类样本，对各种鱼类的线粒体16SrRNA片段分别进行PCR扩增、测序，并据此建立调查水域鱼类DNA指纹库，然后将经目测后无法从外观形态加以区分的仔稚鱼样本编号后分别提取DNA，使用相同的方法对特征片段进行扩增、测序并与已建立的DNA指纹库进行比对，从而快速判断仔稚鱼种类。本发明可以对处于早期发育阶段、尚难以通过形态区分的仔稚鱼进行快速分类鉴定，克服了以往目测误差较大、需要大量培育待分类样本的困难，体现了其快速、准确的优势。
文档编号C12Q1/68GK102229997SQ20111014548
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者刘凯, 周彦锋, 张敏莹, 徐东坡, 施炜纲, 段金荣 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心