专利名称：一种复合酶制剂及其用于提取植物多糖的应用和方法
技术领域：
本发明涉及一种复合酶制剂及其用于提取植物多糖的应用和方法，特别是涉及一种从中药桑叶中提取桑叶多糖的方法。
背景技术：
天然多糖是一类重要的生物活性物质，具有多方面的生物活性和保健功能，可作为各种药物和保健品的有效成分，对于预防和治疗包括癌症在内的多种疾病都具有巨大的潜力。常见的植物多糖有银耳多糖、苦瓜多糖、黄芪多糖、茶多糖、香菇多糖、灵芝多糖、银杏多糖、连翘多糖等。由于植物类中药成分十分复杂且很多贵重有效成分含量很低，为微量甚至痕量， 因此，如何快速有效地从中药材中提取分离和纯化低含量成分，并保持较高的活性已成为中药开发中的关键工序。但传统的提取分离方法(如煎煮法、浸渍法、渗滤法、回流法等) 存在有效成分提取率不高、杂质清除率低等问题，这些根本问题制约着中药开发的进程。因此，需要寻找一种具有反应特异性高、快速、高效、反应条件温和且易于控制的提取植物多糖的方法。桑叶异名铁扇子，为桑科桑属Morus alba L.的树叶。桑属植物具有降血糖、降血压、抗菌和抗病毒等多种生物活性。现代药理研究证明桑叶可抑制血糖升高，具有预防和治疗糖尿病的作用。除此之外，桑叶还具有祛风清热、凉血明目的功效，主治风湿发热、头痛、 目赤、口渴、肺热咳嗽、风痹等。具有药性平和无毒副作用等特点，已经被国家卫生部正式归入“既是食品又是药品”之列。桑叶多糖作为桑叶中的有效成分之一，经过现代药理研究表明其具有降血糖作用，对大鼠四氧嘧啶型糖尿病具有治疗作用，因此提取、分离、纯化桑叶多糖成分制成各种中成药的前景十分广阔。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合酶制剂，并将其应用在提取植物多糖，尤其是桑叶多糖中，进一步给出了具体的操作方法，该方法能在温和的条件下对植物有效成分进行高选择性转化，不仅可以克服工业中常用的醇水提取方法中有效成分提取率低、工序复杂等问题，提高提取体系澄清度、改变药材质地，还可以在提取中改变原有天然成分的结构， 增加提取物的生理活性，具有潜在的工业应用价值。为实现该目的，本发明采用以下技术方案—种复合酶制剂，其特征在于包括以下重量份的组分纤维素酶1-5份果胶酶 1-5份蛋白酶 2-12份所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一种。上述复合酶制剂用于提取植物多糖的应用。
上述复合酶制剂用于提取植物多糖的方法，其特征在于包括以下步骤(1)取植物材料，粉碎，加入蒸馏水，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂加入适当蒸馏水，置于水浴锅里40-60°C条件下活化10-30分钟；(3)将步骤(2)与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至4. 0-6. 0，在40_60°C 条件下酶解0. 5-2.0小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到植物多糖浸膏。所述植物为桑叶的条件下，应用上述酶制剂提取桑叶多糖包括以下步骤(1)取桑树经风干的桑叶，粉碎，加入蒸馏水，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂加入适当蒸馏水，置于水浴锅里40-60°C条件下活化10-30分钟；(3)将步骤(2)与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至4.0-5.5，在40_551 条件下酶解0. 5-2.0小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到桑叶多糖浸膏。上面提到的提取植物多糖和进一步的提取桑叶多糖的方法中，所述植物粉碎至 40-100目，植物材料与加入的蒸馏水的质量比为1 10-30。所述的复合酶制剂与蒸馏水的质量比为1 5-15。步骤O)中所述的复合酶制剂添加量为步骤(1)植物材料添加量的1_4%。步骤中所述的浸提时间为1-2小时。本发明选用此种酶制剂的原理是纤维素酶可以分解植物纤维素；果胶酶可以破坏植物细胞壁；蛋白酶可以除去提取物中的蛋白质，提高提取物的纯度。因为植物类细胞结构相同，三种结合，适用于植物的细胞内多糖的提取，具有较广的应用范围。与现有技术相比，本发明具有以下优点(1)本发明采用复合酶法提取植物多糖，反应条件温和，能保持天然产物的构象， 不破坏其立体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效。(2)本发明选用复合酶不仅能够去除体系内杂质，提高提取液的澄清度，同时又提高了中药有效成分的提取率。(3)本发明对复合酶的配比、提取时间、提取温度、加酶量、PH值进行了优化组合， 实现了植物多糖提取得率的最大化。(4)本发明复合酶制剂用于提取植物多糖的方法中，步骤(4)具有灭活酶制剂，同时又进行了水提的功效，在采用酶提和水提结合的条件下，提高了活性成分的得率。(5)采用本发明从药用植物桑叶中提取桑叶多糖，桑叶多糖提取率大于70mg/g， 而一般的水提醇提法，提取率一般仅为20-30mg/g，因此酶提法提取得率高。(6)本发明工艺简单、操作方便、投资少、不会产生噪音和污染，适应工艺生产应用。
具体实施方式
实施例1(1)取桑树经风干的桑叶，粉碎至100目，取该粉末9g，加入蒸馏水180ml，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂纤维素酶0. 02g，果胶酶0. 02g，木瓜蛋白酶0. 05g，加入蒸馏水 0. 9g，40°C水浴30分钟；(3)将步骤(2)与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至5.0，在50°C条件下酶解1小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到桑叶多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，桑叶多糖提取率为71. 63mg/g。实施例2(1)取桑树经风干的桑叶，粉碎至100目，取该粉末10g，加入蒸馏水200ml，煮沸后
冷却备用；(2)取复合酶制剂纤维素酶0. 04g，果胶酶0. 04g，木瓜蛋白酶0. lg，加入蒸馏水 0. 9g，40°C水浴30分钟；(3)将步骤(2)与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至5.0，在50°C条件下酶解30分钟；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到桑叶多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，桑叶多糖提取率为70. 53mg/g。实施例3:(1)取桑树经风干的桑叶，粉碎至100目，取该粉末20g，加入蒸馏水400ml，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂0. 2g，其中纤维素酶果胶酶木瓜蛋白酶=2 2 5，加入蒸馏水2g，40°C水浴30分钟；(3)将步骤⑵与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至5. 0，在45°C条件下酶解1小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到桑叶多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，桑叶多糖提取率为75. 54mg/go实施例4(1)取桑树经风干的桑叶，粉碎至60目，取该粉末10g，加入蒸馏水300ml，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂纤维素酶0. 09g，果胶酶0. 09g,中性蛋白酶0. 18g，加入蒸馏水 1.8g，60°C水浴10分钟;(3)将步骤⑵与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至5. 5，在60°C条件下酶解1小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，1小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到桑叶多糖浸膏。
采用苯酚硫酸法测定多糖含量，桑叶多糖提取率为66. 67mg/g。实施例5 连翘多糖(1)取风干的连翘叶，粉碎至100目，取该粉末10g，加入蒸馏水100ml，煮沸后冷却(2)取复合酶制剂(纤维素酶果胶酶木瓜蛋白酶=1:2: 5)0. 4g，加入蒸馏水4g，40°C水浴20分钟；(3)将步骤⑵与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至4. 0，在40°C条件下酶解1小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到连翘多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，连翘多糖提取率为64. 32mg/g。实施例6 银杏多糖(1)取风干的银杏叶，粉碎至40目，取该粉末10g，加入蒸馏水200ml，煮沸后冷却(2)取复合酶制剂(纤维素酶果胶酶碱性蛋白酶=2:3: 5)0. 4g，加入蒸馏水6g，45°C水浴30分钟；(3)将步骤(2)与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至4. 5，在45°C条件下酶解0.5小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到连翘多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，银杏多糖提取率为65. 01mg/g。实施例7 银耳多糖(1)取干燥的银耳，粉碎至100目，取该粉末10g，加入蒸馏水200ml，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂(纤维素酶果胶酶木瓜蛋白酶=1:5: 2)0. 16g，加入蒸馏水1. 6g，45°C水浴30分钟；(3)将步骤⑵与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至4. 5，在45°C条件下酶解0.5小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到银耳多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，银耳多糖提取率为60. 37mg/g。实施例8 苦瓜多糖(1)取干燥的苦瓜，粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水300ml，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂(纤维素酶0.04g，果胶酶0.04g，中性蛋白酶0.06g，碱性蛋白酶0. 04g,加入蒸馏水1. 8g，50°C水浴30分钟；(3)将步骤(2)与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至6.0，在50°C条件下酶解1. 5小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；
(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到苦瓜多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，苦瓜多糖提取率为63. 33mg/g。实施例9 黄芪多糖(1)取中药材黄芪，粉碎至100目，取该粉末10g，加入蒸馏水150ml，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂(纤维素酶果胶酶碱性蛋白酶=5:5: 12)0.22g，加入蒸馏水3. 3g，60°C水浴30分钟；(3)将步骤⑵与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至5. 0，在60°C条件下酶解1. 5小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到黄芪多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，黄芪多糖提取率为68. 91mg/g。实施例10 香菇多糖(1)取干燥的香菇，粉碎至100目，取该粉末10g，加入蒸馏水250ml，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂(纤维素酶果胶酶木瓜蛋白酶=1:5: ll)0.34g，加入蒸馏水3. 4g，45°C水浴20分钟；(3)将步骤⑵与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至5.0，在45°C条件下酶解2小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态，2小时；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到香菇多糖浸膏。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，香菇多糖提取率为70. 06mg/g。
权利要求
1.一种复合酶制剂，其特征在于包括以下重量份的组分 纤维素酶1-5份果胶酶 1-5份蛋白酶 2-12份
2.权利要求1所述的一种复合酶制剂，其特征在于所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一种。
3.权利要求1所述的复合酶制剂用于提取植物多糖的应用。
4.权利要求1所述的复合酶制剂用于提取植物多糖的方法，其特征在于包括以下步骤(1)取植物材料，粉碎，加入蒸馏水，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂加入适当蒸馏水，置于水浴锅里40-60°C条件下活化10-30分钟；(3)将步骤(2)与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至4.0-6.0，在40-601条件下酶解0. 5-2.0小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到植物多糖浸膏。
5.权利要求1所述的复合酶制剂用于提取植物多糖的方法，其特征在于所述植物为桑叶，包括以下步骤(1)取桑树经风干的桑叶，粉碎，加入蒸馏水，煮沸后冷却备用；(2)取复合酶制剂加入适当蒸馏水，置于水浴锅里40-60°C条件下活化10-30分钟；(3)将步骤⑵与步骤(1)得到的溶液混合均勻，调节pH至4.0-5.5，在40-551条件下酶解0. 5-2.0小时；(4)煎煮酶解液，控制加热温度，保持溶液在微沸的状态；(5)离心，取上清液过滤，将滤液浓缩，得到桑叶多糖浸膏。
6.权利要求4或5所述的复合酶制剂用于提取植物多糖的方法，其特征在于步骤(1) 中所述的植物粉碎至40-100目，植物材料与加入的蒸馏水的质量比为1 10-30。
7.权利要求4或5所述的复合酶制剂用于提取植物多糖的方法，其特征在于步骤(2) 中所述的复合酶制剂与蒸馏水的质量比为1 5-15。
8.权利要求4或5所述的复合酶制剂用于提取植物多糖的方法，其特征在于步骤(2) 中所述的复合酶制剂添加量为步骤(1)植物材料添加量的1_4%。
9.权利要求4或5所述的复合酶制剂用于提取植物多糖的方法，其特征在于步骤(4) 中所述的浸提时间为1-2小时。
全文摘要
本发明提供了一种复合酶制剂及其用于提取植物多糖的应用和方法，属于酶制剂的应用领域。本发明的技术方案是提供一种复合酶制剂，包括以下重量份的组分纤维素酶1-5份，果胶酶1-5份，蛋白酶2-12份，本发明还给出了将此复合酶制剂用于提取植物多糖，尤其是桑叶多糖的应用，并给出了具体的操作步骤，最终实现了植物多糖提取率60mg/g以上。本发明的有益效果是反应条件温和，能保持天然产物的构象，不破坏其立体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效；能够去除体系内杂质，提高提取液的澄清度，提高了中药有效成分的提取率；对反应条件进行了优化组合，实现了提取得率的最大化。
文档编号C12N9/42GK102304501SQ201110255909
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者刘宇, 刘敏尧, 刘晓津, 刘海庆, 刘靓, 董晓芳 申请人:天津滨海诺奥酶工程技术有限公司