专利名称：含有微球面阵列的培养皿的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物纳米领域，特别涉及含有微球面阵列的培养皿。
背景技术：
以细胞为基础的生物检测是近二十年来药物筛选领域发展起来的药用效应或毒理效应的重要功能筛选手段。在这一筛选体系中，细胞作为一种生物传感器被整合到筛选平台中，既可以作为高通量筛选(high throughput screening, HTS)也可以作为高容量筛选(high content screening, HCS)的检测手段。较之于生物化学检测手段，细胞筛选方法具有从功能的角度获取待筛选分子药用效应或毒理效应的优势，然而其筛选成本却显著地低于动物实验。在现有的细胞药物筛选体系中，细胞培养通常采用普通平面培养皿。尽管已有的培养基及化学添加剂已经能够满足人体内绝大多数细胞的培养要求，然而采用平面培养皿的培养技术却很明显地忽略了体内细胞生存的微观环境物理特性。在体情况下，细胞生存于三维的细胞基质中，而且这一支撑基质具有复杂的表面拓扑微结构。体外培养基底与体内生存条件的差异导致了培养细胞功能状态较之于体内不可避免的差异。对于药物筛选而言，这可能是筛选通量低下、筛选结果与后期动物实验结果不符的重要原因。另一方面，通过培养皿基底物理特性，如拓扑结构特征，的设计改变筛选细胞的功能响应性，将为提高细胞药物筛选效能提供新的技术途径。近年来，组织工程与细胞工程的发展为药物筛选技术的革新提供了新的机遇。如， 三维培养技术的建立为在体外模拟体内细胞生存环境提供了有效的工程化手段。这里最成功的例子可能是三维肿瘤微球被用于体外肿瘤细胞的多重抗药性研究。另一方面，培养基底拓扑微结构与培养细胞生长行为的关系已经有三十多年的研究历史。早期的研究大量集中在成纤维细胞与骨细胞的研究，其研究结果已经被用于组织工程植入体的构建。细胞培养基底拓扑结构由于影响细胞的形态及功能行为，因而是模拟体内细胞微环境的重要途径。对于神经细胞、肌细胞及腺体细胞等依赖于离子通道功能活动的可兴奋细胞而言，拓扑结构环境因为影响细胞的粘附、铺展及几何形态将对离子通道的功能响应性可能产生明显的影响，这在离子通道靶向药物的筛选中具有重要的应用前景。电压依从式钙离子通道(voltage dependent calcium channel, VDCC)是细胞重要的离子通道。由于其参与细胞的众多生理过程以及在神经系统和心血管系统疾病中的重要作用，VDCC在制药业已经成为药物筛选的重要靶效应通道。以VDCC为靶效应通道的细胞药物筛选体系首先要求所采用目标细胞具有VDCC的表达及相应的VDCC功能响应性。VDCC 功能响应性的强弱或大小直接影响到药物的筛选效能，如筛选通量以及有关药物效应和毒性的信息内含量。对于以神经细胞为基础的VDCC靶通道药物筛选，细胞的VDCC功能响应性低下是制约筛选效能提高的重要因素。引起神经细胞VDCC功能响应性低下的因素可能包括(1)所使用神经细胞VDCC表达水平低下；(2)所采用分化条件不利于神经细胞VDCC 的充分表达并成熟；(3)细胞的其他离子通道功能或膜电位水平异常。尽管采用基因工程的方法可以达到增强VDCC功能响应性从而构建筛选细胞的目的，但基因操作过程对于筛选结果的影响却值得进一步评价。
发明内容有鉴于此，本实用新型的目的之一在于提供培养皿，该培养皿的基底含球面致密阵列型拓扑结构，该培养基底的拓扑微结构能支持所培养细胞的粘附及铺展，进而增强筛选细胞VDCC的功能响应性。为实现上述目的，本实用新型的技术方案为含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体1和培养皿盖板2，所述培养皿本体1 的基底3设有至少一个微球面阵列4，所述微球面阵列4中微球5的直径为微米或纳米级。进一步，所述微球面阵列4为球面直径0. 51-1. 98微米的微球5紧密排列而成，所述微球面阵列4中的两相邻微球5的间距小于0. 5微米；进一步，所述微球5为微全球5-A和/或微半球5-B ；进一步，所述微球面阵列4的面积至少大于单个靶细胞的面积；进一步，所述微球面阵列4的面积为0. 25cm2 ；进一步，所述培养皿还包括进液管7和出液管8，培养皿盖板2上设有连接孔6，所述进液管7和出液管8从连接孔6伸入培养皿内；进一步，所述出液管8伸入培养皿内的一端与基底3接触；进一步，培养皿盖板2上的连接孔设有密封垫圈9。微球面阵列培养皿中培养的细胞经钙离子荧光染料染色后，以普通荧光显微镜、 激光共聚焦显微镜、孔板读数器或其他钙离子荧光记录装置采集细胞钙离子荧光信号，在信号采集过程中用高钾溶液施以去极化刺激，得增强的电压依从式钙离子通道荧光响应性。本实用新型的有益效果在于本培养皿采用倾斜条件下的分步蚀刻方法制备而成，其微球面直径为微米或纳米级，制备的微球面阵列可以达到0. 10到0. 25 cm2的大面积范围，达到培养皿应用的要求，其生产成本低，操作简单；本培养皿能显著增加神经细胞 VDCCs功能响应性含有微球面阵列的培养皿在神经干细胞分化第0天、7天、14天时，较普通培养皿能显著提高靶细胞的VDCC荧光响应性；运用本培养皿增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的方法为药物筛选提供了新方法和思路。
为了使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本实用新型作进一步的详细描述，其中图1为含有微球面阵列的培养皿本体的示意图；图2为含有微球面阵列的培养皿盖板的示意图；图3为含有微全球球面阵列的培养皿基底示意图；图4为含有微半球球面阵列的培养皿基底示意图；图5为ENStem-A 人神经干细胞在平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿和微全球球面阵列基底培养皿中的扫描电镜照片。图示在细胞接种后第2天(分化第0天)细胞于平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿(a)、1. 98 μ m微全球球面阵列基底培养皿(b)和0. 51 μ m微全球球面阵列基底培养皿(c)的生长状况，标尺示25 μ m。
具体实施方式
为了使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本实用新型的优选实施例进行详细的描述。实施例1含有微球面阵列的培养皿的制备一材料准备1. 35 mm细胞培养皿(Corning，美国);细胞培养六孔板(Nest Biotech Co.，Ltd, 中国)2.直径为25 mm的圆形盖玻片(上海精轮工业上玻璃有限公司，中国。或Fisher Scienti c,美国)3.聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories, Inc.,美国。或 aladdin,中国)，直径分别为0.51微米和1.98士0.20微米。4. 2. 5%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯细胞培养皿一个，剪碎后称取聚苯乙烯 2. 5克，加入IOOmL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存备用。5. 10. 16%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯细胞培养皿一个，剪碎后称取聚苯乙烯10. 16克，加入IOOmL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存备用。6. 1.7%的聚苯乙烯微球工作悬液10%的聚苯乙烯微球悬液(供货浓度)40 μ L蒸馏水200 μ L混勻后得浓度为1. 7%的微球工作悬液。7.倾斜平台，自制。8.聚二甲基硅氧烧 ^x)ly(dimethylsiloxane)，PDMS] (Sylgard 184，Dow Corning,美国)二、含有微球面阵列的培养皿的设计及制备1.含有微球面阵列的培养皿设计本实用新型的含有微球面阵列的培养皿本体1，详见图1 ；培养皿盖板2详见图2。 应当指出，本设计按照普通35mm培养皿进行设计描述。如改变培养皿及孔板尺寸或具有多个重复单元结构的培养皿孔板(如6孔板、12孔板等)而具备本实用新型的权利保护特征的培养皿及孔板设计依然属于本专利的权利保护范围。 1)含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体1和培养皿盖板2，所述培养皿本体 1的基底3设有至少一个微球面阵列4，所述微球面阵列4中微球的直径为微米或纳米级。2)所述微球面阵列4为球面直径0. 51-1. 98微米的微球5紧密排列而成，所述微球面阵列4中的两相邻微球5的间距小于0. 5微米；3)所述的含有微球面阵列的培养皿，所述微球面5为微全球5-A和/或微半球 5-B ；其中，微全球是指微型的球体，微半球是指微型的半球体；4)所述的含有微球面阵列的培养皿，所述微球面阵列4的面积至少大于单个靶细胞的面积；[0045]5)所述的含有微球面阵列的培养皿，所述微球面阵列4的面积为0. 25cm2 ；6)所述的含有微球面阵列的培养皿，所述培养皿还包括进液管7和出液管8，所述进液管7和出液管8从培养皿板盖2上的连接孔6伸入培养皿内。在不开启培养皿盖板的静置的条件下，采用负压作用下可以借助出液管8引流出培养皿本体1的全部液体；在非检测的培养条件下，培养皿也可以不使用进液管和出液管，直接通过揭开培养皿盖板进行换液；7)所述的含有微球面阵列的培养皿，所述出液管8伸入培养皿内的一端与基底3 接触；8)所述的含有微球面阵列的培养皿，培养皿盖板2上的连接孔设有密封垫圈9。 密封垫圈9固定出液管8及进液管7与软质硅胶管的连接。液体引流管及进样管使得在荧光检测过程中可以在静置条件下完成液体更换、清洗及加样，避免了移动培养皿引起被检测视野变化对荧光检测的影响。含有微球面阵列的培养皿本体详见图1 ；含有微球面阵列的培养皿盖板详见图2 ；含有微全球球面阵列的培养皿基底详见图3 ；含有微半球球面阵列的培养皿基底详见图4 ；上述微球面直径可以为微米级或亚微米级。上述培养皿也可直接设计为基底3表面有微球面阵列4的构造。2、含有微球面阵列的培养皿的制备步骤应当指出，作为优先实施示例，这里以35mm培养皿及六孔板为例描述具有微球面阵列基底的培养皿及孔板的制备过程。以其它尺寸或其他途经实现的微全球球面或微半球球面致密阵列基底培养皿或孔板也在本专利权限保护之内。现就本部分实施步骤描述如下。①取35mm培养皿一个，在培养小室底部中央开出一直径IOmm的圆形小孔。除培养皿外，其他六孔板、十二或其他孔板均可以实现。②取25mm圆形盖玻片，以2. 5%的聚苯乙烯溶液在约6000转/分的条件下旋转涂层40秒，对盖玻片进行薄型聚苯乙烯裱衬，涂层厚度约0. 1微米。③取25mm圆形盖玻片，以10. 16%的聚苯乙烯溶液在约2000转/分的条件下旋转涂层30秒，对盖玻片进行厚型聚苯乙烯裱衬，涂层厚度约5微米。④取步骤②所获得的经薄型聚苯乙烯裱衬的盖玻片，以分步等离子蚀刻在倾斜角度的条件下制备微球阵列。具体步骤为(a)薄型聚苯乙烯裱衬的盖玻片以等离子氧蚀刻 60-80秒；(b)将30-50微升浓度为1. 7%的聚苯乙烯微球工作悬液分布于经聚苯乙烯涂层的盖玻片表面；(c)分布有聚苯乙烯微球工作悬液的盖玻片放置于倾斜平台，倾斜约10°， 静置30分钟显微镜下检查微全球球面阵列形成情况；(d)重复步骤(b)和(c)，直至形成大片的微全球球面阵列为止；(e)为稳定聚苯乙烯微球与涂层表面的粘结，将上述微全球球面阵列于104°C烘箱中焙干35分钟。⑤将上述步骤④制备的含微全球球面阵列的盖玻片嵌入并粘结于上述步骤①所制备的开孔培养皿或孔板底部，获得含微全球球面致密阵列基底的培养皿或孔板。[0062]为获得含微全球球面致密阵列基底培养皿或孔板，步骤④和⑤可以先后交换，即可以先粘结薄型聚苯乙烯裱衬的盖玻片于开孔的培养皿或孔板底部，构成平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿，再在底表面进行微全球球面阵列的制备，得含微全球球面致密阵列基底的培养皿。⑥将PDMS预聚体与固化剂按10 1的比例混合均勻浇注于步骤④所制备的含微全球球面致密阵列的盖玻片上，真空抽气30 min,于60°C的加热板条件下固化2小时，将固化的PDMS剥离即得到PDMS球面阵列负模。⑦取步骤③所制备的厚型聚苯乙烯裱衬的盖玻片，置于103°C的加热板上，以步骤⑥所制备的PDMS球面阵列负模在亚玻璃态温度条件下进行进行加压。20分钟后，取出厚型聚苯乙烯裱衬的盖玻片及PDMS球面阵列负模，室温冷却，剥离PDMS球面阵列负模即得含微半球球面阵列的基底。⑩将步骤⑦制备的含微半球球面阵列的基底嵌入并粘结于上述步骤①所制备的开孔培养皿或孔板底部，获得含微半球球面阵列基底的培养皿或孔板。微全球球面阵列基底培养皿和微半球球面阵列基底培养皿均为增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的培养皿。从普通细胞尺寸(10-20微米)及本实用新型的球面直径尺度(0. 51-1. 98微米)看，只要细胞培养过程中细胞不能深入到球面之间间隙的尺寸及球面直径均可，且微全球球面阵列和微半球球面阵列应为相同功能的细胞培养表面。③按图2以及“含有微球面阵列的培养皿设计”部分所描述的结构和尺寸制备培养皿盖板。⑩步骤⑤和步骤⑥所制备的含微球面阵列的培养皿本体经等离子氧蚀刻150秒以增加表面粗糙度后即可用于细胞培养及细胞药物筛选的检测。该等离子蚀刻步骤也可在步骤ill和步骤制备的球面阵列嵌入并粘结于开孔培养皿及孔板之前进行。将制备好的培养皿进行消毒杀菌处理后，可用于细胞培养及检测。实施例2含有微球面阵列的培养皿的增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的方法将以上含有微全球球面阵列的培养皿进行细胞培养及电压依从式钙通道功能响应性的评价，证实本方法的实施效果。应当指出，对于微半球球面阵列的培养皿而言，神经细胞感知的拓扑微环境与微全球球面阵列完全一样，因为细胞的尺度及生长行为决定了细胞不可能贴附于微球与微半球的底部从而感知这一部分几何形态的差异。发明者完全有理由推测半球球面致密阵列与微全球球面致密阵列拓扑结构有相同的细胞生物学效应。一、材料准备1. ENStem-A 人神经干细胞(Millipore公司，美国)2. 多聚鸟氨酸(poly-L-ornithine hydrobromide) (Sigma产品，美国)3.浓度为40 μ g/mL的多聚鸟氨酸裱衬液取多聚鸟氨酸供货安培瓶(含多聚鸟氨酸冻干制剂50mg)，加入5mL灭菌蒸馏水， 涡旋混勻制成浓度为lOmg/mL的储备液。上述储备液分装为16 μ L/印pendorf管。取上述含16 μ L多聚鸟氨酸储备液的印pendorf管，加入4mL的灭菌蒸馏水，涡旋混勻制成浓度为40 μ g/mL的多聚鸟氨酸裱衬液。4.鼠基底膜层粘连蛋白[来自EHS鼠肉瘤(Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma) ] (Sigma 产品，美国)5.浓度为5 μ g/mL的鼠基底膜层粘连蛋白裱衬液将浓度为lmg/mL (供货浓度)的鼠基底膜层粘连蛋白储备液分装为IOyL/ 印pendorf管。取上述含10 μ L鼠基底膜层粘连蛋白储备液的印pendorf管，加入2mL的灭菌蒸馏水，涡旋混勻制成浓度为5 μ g/mL的鼠基底膜层粘连蛋白裱衬液。6.浓度为200mM的L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich产品，美国)7. B27 添加剂(Invitrogen 产品，美国)8.浓度为10 μ g/mL的重组人白血病抑制因子(recombinant human leukemia inhibitory factor, LIF) (Chemicon 产品，美国)9. Neurobasal 基础培养基 anvitrogen 产品，美国)10.碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) (Sigma-Aldrich 产品，美国)11.牛血清白蛋白(bovine serum albumine，BSA)(盐城赛宝生物科技有限公司， 中国)12. bFGF 储备液称取牛血清白蛋白lg，加入IOOmL Neurobasal基础培养基，以0. 2微米孔径滤膜无菌过滤后制得含1%BSA的Neurobasal培养基。取bFGF供货安培瓶(内含25 μ g bFGF冻干制剂)，加入0. 5 mL含1%BSA的 Neurobasal培养基，制得浓度为50 μ g/mL的bFGF储备液。13.神经干细胞扩增培养液浓度为200mM的L-谷氨酰胺0. 5 mLB27 添加剂LOmL浓度为10 μ g/mL 的 LIF50 μ L浓度为50 μ g/mL的bFGF储备液20 μ L以Neurobasal基础培养基定容至50 mL上述扩增培养液含添加剂的终浓度为L-谷氨酰胺2 mM ；bFGF 20 η g/mL ； LIF 10 ng/mL ；B-27 添加剂 2%。14.神经干细胞分化培养液浓度为200mM的L-谷氨酰胺0. 5 mLB27 添加剂1. 0 mL浓度为10 μ g/mL 的 LIF50 μ L以Neurobasal基础培养基定容至50 mL上述扩增培养液含添加剂的终浓度为L-谷氨酰胺2 mM ；LIF 10 ng/mL ；B-27添加剂2%。15. 0. 2M的二甲胂酸盐缓冲液(pH7. 2)甲液二甲胂酸钠4. ^g，加蒸馏水至100ml乙液0·2Ν盐酸[0105]取甲液50mL、乙液4. 2mL,以蒸馏水定容至200mL，即得pH为7. 2的0. 2M 二甲胂酸
盐缓冲液。16. 0. IM的二甲胂酸盐缓冲液(pH7. 2)取上述0. 2M的二甲胂酸盐缓冲液50mL，以蒸馏水定容至IOOmL即可。17. 8% 的戊二酸储备液(Electron Microscopy Sciences 产品，美国)18.含2%戊二醛的0. IM 二甲胂酸钠缓冲液(pH 7. 2)采用如下配方8%的戊二醛储备液5 mL蒸馏水5 mL0. 2M的二甲胂酸盐缓冲液 IOmL19. 4%的四氧化锇储备液取四氧化锇lg，以蒸馏水定容至25mL。20.含1%四氧化锇的0. IM 二甲胂酸钠缓冲液(pH 7. 2)采用如下配方4%的四氧化锇储备液5 mL蒸馏水5 mL0. 2M的二甲胂酸盐缓冲液 IOmL21.梯度脱水用不同浓度的乙醇采用如下配方
权利要求1.含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体(1)和培养皿盖板(2)，其特征在于所述培养皿本体(1)的基底(3 )设有至少一个微球面阵列(4 )，所述微球面阵列(4 )中微球(5 ) 的直径为微米或纳米级。
2.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于所述微球面阵列(4) 为直径为0. 51-1. 98微米的微球(5)紧密排列而成，所述微球面阵列(4)中的两相邻微球 (5)的间距小于0.5微米。
3.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于所述微球(5)为微全球(5-A )和/或微半球(5-B )。
4.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于所述微球面阵列(4) 的面积至少大于单个靶细胞的面积。
5.根据权利要求4所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于所述微球面阵列(4) 的面积为0. 25cm2。
6.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于所述培养皿还包括进液管(7)和出液管(8)，皿盖板(2)上设有连接孔(6)，所述进液管(7)和出液管(8)从连接孔(6)伸入培养皿内。
7.根据权利要求6所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于所述出液管(8)伸入培养皿内的一端与基底C3)接触。
8.根据权利要求6所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于培养皿盖板(2)上的连接孔设有密封垫圈(9)。
专利摘要本实用新型涉及生物纳米领域，特别涉及含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体1和培养皿盖板2，所述培养皿本体1的基底3表面设有至少一个微球面阵列4，所述微球面阵列4的球面直径为微米或纳米级；本培养皿采用倾斜条件下的分步蚀刻方法制备而成，制备的微球面阵列面积达到培养皿应用的要求，其生产成本低，操作简单；运用本培养皿增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的方法为药物筛选提供了新方法和思路。
文档编号C12M1/00GK202030741SQ20112003810
公开日2011年11月9日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者吴泽志, 宋兆全, 廖彦剑, 朱满根, 林雨, 梁福荣, 金良, 黄岂苹 申请人:重庆大学