可再水化的食品的制作方法

专利名称：可再水化的食品的制作方法
可再水化的食品本发明涉及干燥的可再水化的食品，尤其是作为水果、蔬菜或其部分的食品。本发明还涉及所述食品的制备方法和包括上述干燥的可再水化的食品的食品产品，如干燥的汤、干燥饮料、早餐谷物、酸奶(yoghurt)和干燥调味汁。干燥的可再水化的食品例如在干燥的汤、干燥饮料，早餐谷物、酸奶和干燥调味汁中的应用是普遍的。然而，已经观察到，当干燥组分是水果和/或蔬菜时，再水化后的组分不像干燥前的水果和/或蔬菜。也就是说，它们不再有新鲜的外观，而是褪色并且缺乏硬度。这种转化是由于干燥过程中发生的细胞损伤。尤其地，据信，通过细胞两亲物的插入、相变为凝胶相和膜融合，磷脂膜被去稳定。Serrano 等(Food Sci. Tech. Int. , 9(3)，157-161 (2003))讨论了对于食品脱水的潜在应用，公开了已经观察到在种子胚胎发生的成熟过程期间以及在经历水胁迫的所有植物组织中胚胎发生晚期丰富的(LEA)蛋白是高水平丰富的。LEA蛋白包括脱水蛋白等。 作者指出，LEA蛋白在干燥期间可以通过与渗压剂相似的机制使蛋白和膜稳定。这是通过赋予细胞结构的优先水化，然后实际上在干燥期间替换水。渗压剂也有利于渗透调节，并在干燥期间充当有效的羟自由基清除剂。作者还公开，三种生物系统似乎一致作用以达到干燥耐受性参与渗压剂合成的酶；专门用于膜和蛋白的干燥保护的蛋白(LEA蛋白)；以及抗氧化酶和分子。本发明力图通过提供干燥的可再水化的食品等解决上述技术问题，该食品是水果、蔬菜或其部分，其再水化后具有改善的外观、质地和再水化特性。发明概述
在本发明的第一个方面，提供了干燥的可再水化的食品，所述食品包含少于10%w/w水和至少O. 02% w/w的脱水蛋白及其衍生物，所述脱水蛋白及其衍生物包含选自K, I, K, E, K, L, P, G ；K, I, K, E/D, K, L/I, P，G ;和 K, I, K, E/D, K, L/I/T/V, P/H/S, G 的氨基酸序列，并且其中所述干燥的可再水化的食品是蔬菜或其部分和/或水果或其部分的未破损的组织，且不是种子，其中所述未破损的组织具有至少O. 5毫米的最短线性尺寸，优选O. 5-25毫米的最短线性尺寸，更优选为O. 5-10毫米。术语“可再水化的”是指食品可以再水化至完全水化的蔬菜或其部分和/或水果或其部分的水含量的至少50% w/w、优选至少60% w/w、最优选至少70% w/w。优选地,术语“可再水化的”是指食品可以再水化至完全水化的蔬菜或其部分和/或水果或其部分的水含量的不超过99% w/w、优选不超过97% w/w、最优选不超过95% w/w。其衍生物包括糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白，其中截短的脱水蛋白仍然包含关键的K区段(见下文)。通过逗号分隔氨基酸序列中的相邻位置，并且最频繁观察到的氨基酸第一个列出且单个位置处的每个氨基酸用正斜杠分隔。本发明人惊讶地观察到，通过将水果和/或蔬菜组织中脱水蛋白浓度升高至高于天然发现的浓度，获得再水化后具有改善的外观、质地和再水化特性的干燥的可再水化的食品。虽然现有技术的确建议LEA蛋白可以在保护植物免受水胁迫中发挥作用，令人惊讶的是，单独使用脱水蛋白导致了干燥的再水化水果和/或蔬菜的上述性能的这种改善，因为三种生物系统似乎一致作用以达到干燥耐受性。根据Roberts 等(The Plant Cell, 5，769-780 (1993))提供的数据，已经计算出，种子可以包含约O. 5%的干重水平的脱水蛋白。然而，关于该水平为什么这么高在文献中没有一致意见。如此，种子不是本发明的主题，因此将其排除。优选地，干燥的可再水化的食品包含O. 02-20，优选O. 1-5，最优选O. 2-2. 5% w/w的脱水蛋白及其衍生物。脱水蛋白的天然水平低于O. 02% w/w。脱水蛋白及其衍生物优选具有1-150，优选5-100，最优选5-50kD的分子量。优选更低分子量的脱水蛋白及其衍生物，因为它们更容易注入水果或蔬菜组织。脱水蛋白及其衍生物优选源自野茶树(Camellia sinensis)、连翅属(Forsythia)和卷柏属(Selaginella)，更优选源自野茶树，尤其是具有与SEQ. ID NO. I (见图3b)至少80 %相同的，优选与之至少90 %、95 %或99 %相同的氨基酸序列。据观察，当茶树组织枯萎时，SEQ. ID NO. I的脱水蛋白上调47倍，因此假定，这种特定脱水蛋白在干燥过程中保护植·物组织中具有重要作用。根据下文发明详述中所述的结果，随后证明了这一情况。另一种优选的源自野茶树的脱水蛋白(截短的形式)具有与SEQ. ID NO. 2 (见图4b)至少80%相同，优选与之至少90%、95%或99%相同的氨基酸序列。另一种优选的源自野茶树的脱水蛋白(另一种截短的形式)具有与SEQ.IDNO. 3 (见图5b)至少80%相同，优选与之至少90%、95%或99%相同的氨基酸序列。据认为，仍包含关键的K区段(见下文)并被标记为SEQ. ID NO. 2和3的茶脱水蛋白SEQ. ID NO. I的截短形式将更加容易并深入地注入水果和/或蔬菜组织，因此提供了与全长形式(SEQ. ID NO 1)相比增强的保护性活性。截短的形式也可以具有更高的功能活性，因为会去除蛋白的一些调控区。可再水化的食品可以额外包括选自海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、棉子糖、酶抗氧化剂或非酶活性氧种类清除剂的化合物。认为上述种类在水果或蔬菜组织经历脱水时可以通过各种不同的机制保护水果或蔬菜组织的完整性。例如，认为糖在干燥期间首先通过诱导细胞结构的优先水化，然后通过实际替代水以保护细胞结构而保护细胞膜。另外，糖可以作为有效的羟自由基清除剂起作用而控制干燥期间看到的活性氧种类的增加的产生。脱水后，损害了细胞的电子传输链，因此产生渐增量的活性氧中间体。因此，期望酶抗氧化剂或非酶活性氧种类清除剂改善水果或蔬菜组织以减少的细胞损伤抵抗干燥的能力。合适的酶抗氧化剂包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。合适的非酶活性氧种类清除剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素。蔬菜可以选自菠菜、西兰花、洋葱、茄子、小胡瓜、土豆、南瓜、蘑菇、胡萝卜、茶、芦笋、萝卜、韭菜、甜菜、花椰菜、块根芹、朝鲜蓟、薄荷、百里香、牛至、迷迭香、欧芹、鼠尾草、细香葱、马郁兰、罗勒、月桂叶、龙蒿、旱芹和大蒜，水果可以选自柠檬、覆盆子、红醋栗、黑莓、悬钩子、蓝莓、草莓、菠萝、香蕉、桃、杏、荔枝、苹果、梨、番茄、辣椒、黄瓜和芒果。在本发明的第二方面，提供了食品产品，所述食品产品包括根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品。所述食品产品可以选自干燥的汤、干燥的饮料、早餐谷物、酸奶和干燥的调味汁。所有上述食品产品的特征在于包括干燥的水果或蔬菜组分，该组分在使用时再水化。
在本发明的第三方面，是根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品的制备方法，该方法包括以下步骤
(a)用脱水蛋白及其衍生物注入不包括种子的蔬菜或其部分或水果或其部分以产生注入的食品，所述脱水蛋白及其衍生物包括选自K，I, K, E, K, L, P, G ；K, I, K, E/D, K, L/I, P, G ；和 K, I, K, E/D, K, L/I/T/V, P/H/S, G 的氨基酸序列；和
(b)干燥注入的食品从而产生根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品。本发明的第三方面的令人惊讶的观察结果是下列事实，通过将脱水蛋白简单扩散入水果和/或植物组织，获得了脱水后具有改善的外观、质地和再水化特性的干燥的可再水化的食品。优选在真空下进行本发明的第三方面的步骤(a)。可以预期，在真空下，注入更快。可以在3-70，优选10-50，最优选15至30°C的温度进行本发明的第三方面的步骤(a)。在太低的温度，注入过程太慢，而在太高的温度，组织结构被破坏。 在本发明的第四方面，提供了根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品的制备方法，该方法包括以下步骤
(a)将基因克隆进植物表达载体从而产生修饰的植物表达载体，其中所述基因编码脱水蛋白及其衍生物，其中，所述脱水蛋白及其衍生物包括选自K，I, K, E, K, L, P, G ；K, I, K, E/D, K, L/I, P, G ;和 K，I, K, E/D, K, L/I/T/V, P/H/S, G 的氨基酸序列；
(b)通过植物转化将修饰的植物表达载体弓I入目标作物从而产生转基因的目标作物；
(c)生长转基因的目标作物从而表达脱水蛋白及其衍生物；并且然后
(d)干燥转基因的目标作物从而产生根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食
品O在本发明的第五方面，提供了具有与SEQ. ID NO. I相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。在本发明的第六方面，提供了具有与SEQ. ID NO. 2相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。在本发明的第七方面，提供了具有与SEQ. ID NO. 4至少80%相同，优选与之至少90 %、95 %或99 %相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。附图简要说明
现在将参考下列附图示例本发明，其中
图I示出显示保守的序列基序的概括的脱水蛋白分子的特征结构，其中Y区段通常位于朝向氮末端，Φ区段是主要由甘氨酸和极性氨基酸组成的重复区域，S区段包含一片(atrace of)可磷酸化丝氨酸残基，以及K区段富含赖氨酸且构成推定的两亲性α -螺旋形成结构域(字母序列是指相应的氨基酸序列)；
图2显示通过DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱纯化后鳞叶卷柏脱水蛋白级分的十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)板，其中列(I)是分子量标记物(千道尔顿)，列⑵是总鳞叶卷柏提取物，列(3)-(15)是用0.02 M:1 M KCl梯度洗脱的提取物的级分(箭头表明脱水蛋白条带的位置)；
图3在图3a中以示意图形式、在图3b中以核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO
I)的形式显示茶脱水蛋白基因；图4在图4a中以示意图形式、在图4b中以核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO
2)的形式显示截短形式的图3的茶脱水蛋白(SEQ.ID NO. I的截短体122-201)；
图5在图5a中以示意图形式、在图5b中以核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO
3)的形式显示截短形式的图3的茶脱水蛋白(SEQ.ID NO. I的截短体163-201)；
图6显示连翘脱水蛋白基因的核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ. ID NO. 4)；
图7显示重组茶脱水蛋白的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(I)是分子量标记物(千道尔顿)，列(2)是IPTG诱导的具有pDEST 17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3)是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8)是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15)是洗脱缓冲液应用后收集的级分； 图8显示重组茶脱水蛋白(364-606)的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(I)是分子量标记物(千道尔顿)，列(2)是IPTG诱导的具有pDEST17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3)是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8)是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15)是洗脱缓冲液应用后收集的级分；
图9显示重组茶脱水蛋白(487-606)的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(I)是分子量标记物(千道尔顿)，列(2)是IPTG诱导的具有pDEST17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3)是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8)是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15)是洗脱缓冲液应用后收集的级分；


图10显示重组连翘属脱水蛋白的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(I)是分子量标记物(千道尔顿)，列(2)是IPTG诱导的具有pDEST 17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3)是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8)是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15)是洗脱缓冲液应用后收集的级分；
图11显示(A)用水、(B)鳞叶卷柏脱水蛋白和(C)从毕赤酵母表达的茶脱水蛋白注入后完全干燥并再水化的红辣椒；
图12显示用各种脱水蛋白或水和对照注入的再水化的红辣椒组织片的长度对宽度的图，其中“Res Pit”是指实施例I的鳞叶卷柏脱水蛋白，“TD”是指实施例2的完全的茶脱水蛋白，“TD (364-606) ”是指实施例2的截短的茶脱水蛋白，“连翘属”是指实施例2的连翘属脱水蛋白，“生的(raw) ”是指已经根据实施例5干燥并再水化的生的红辣椒组织片，“水-VI”是指已经根据实施例5用水真空注入、干燥并然后再水化的生的红辣椒组织片，“完全生的”是指生的红辣椒组织片；
图13显示没有被注入、干燥并再水化(图13a)，没有被注入、但是根据本实施例6干燥并再水化(图13b)，根据实施例6被注入水、干燥并再水化(图13c);以及根据实施例6用鳞叶卷柏脱水蛋白注入、干燥并再水化(图13d)的青椒(辣椒)片的负荷(N)对距离(mm) 图14显示在干燥(左手图像)和然后再水化(中间图像)之后用毕赤酵母表达的茶脱水蛋白(上面图像)或水(下面图像)注入的菠菜叶子，以及中间图像中显示一片叶子的部分的光学显微镜图像(右手图像)；
图15显示在(a)用台盼蓝染色的活洋葱表皮中、和(b)已经热烫然后用台盼蓝染色的洋葱表皮中的可见光显微镜图像(10倍放大)；和
图16显示在(a)实施例2的全长茶脱水蛋白，(b)去离子水，(c) bis-tris海藻糖缓冲液和(d) BSA的bis-tris海藻糖缓冲液溶液注入后用台盼蓝的摄取染色的干燥并再水化的洋葱表皮的可见光显微镜图像(10倍放大)。发明详述
脱水蛋白基因由植物物种间表现高水平的保守性的独特结构域组成。图I显示脱水蛋白的概括结构的示意图。每种蛋白是由Κ、ΦΑ和Y区段的多个拷贝组成。例如，每个多肽K区段可以出现最高11次，而Y区段通常在N-末端附近的1-3个串联重复中被发现。四个 主要区段被其它保守性更差并且通常重复的区域所间插。在进化过程中K、Φ、S和Y区段的严格保守表明，它们限定了这些蛋白中的功能单元。脱水蛋白的特征可在于在羧基末端附近发现的K，I, K, E, K, L, P, G氨基酸序列，该序列通常在蛋白内是重复的。这种氨基酸序列形成K区段的部分。更常见地，从可得的公开数据的比对显现的脱水蛋白的羧基末端肽为E, K, K, G/S, I/V/M/L/F, M/L/V, D/E, K, I, K, E/D, K, L/I, P, G。实施例I :复苏植物鳞叶卷柏(Selaginella Iepidophylla)脱水蛋白的提取和纯化
用脱水蛋白抗体探测来自鳞叶卷柏的蛋白提取物，以检测鳞叶卷柏((一种复苏植物，这是已知显示显著的耐旱性的植物)组织中的脱水蛋白样蛋白。一旦被鉴定，通过离子交换色谱纯化该蛋白。a)从鳞叶卷柏组织制备全蛋白提取物
在咖啡研磨机中将已经在室温脱水5小时的完全水化的整个鳞叶卷柏植物(所以它是部分脱水的)研磨至面粉样稠度。将该粉末以200 g/L的浓度悬浮在包含25mM 2_(N_吗啉代)乙磺酸(MES)、20 mM NaCl和ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)的预冷(4°C )的pH 6. O的提取缓冲液中。将悬浮液在4°C搅拌3小时，然后在搅拌机中混合I分钟，然后将匀浆在4°C进一步搅拌12小时。通过在4°C在10，000 rpm离心30分钟而沉淀不溶性物质。随后将上清过滤通过两个单独层的粗棉布。在偶尔摇动的情况下在70°C孵育10分钟而变性非热稳定的蛋白。该溶液在冰上迅速冷却，过滤通过Whatman I号纸。通过30，000 rpm离心I小时而沉淀任何剩余的不溶性物质。b)通过蛋白质印迹检测鳞叶卷柏全蛋白提取物中的脱水蛋白
将约20 μ L等份的鳞叶卷柏总蛋白提取物加样至电泳凝胶(12% Novex双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(bis-tris))，在MES和十二烷基硫酸钠(SDS)跑胶缓冲液中在200V跑胶约40分钟。在30 V将凝胶上的蛋白印迹到硝酸纤维素片I小时。通过在含有5%奶粉的三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲盐水(TBS)(封闭缓冲液)中浸没I小时来封闭硝酸纤维素上的未结合位点。然后在于封闭缓冲液中1:1000稀释的兔多克隆脱水蛋白抗血清(Stressgen Bioreagents)中孵育印迹I小时。用包含O. 05%聚山梨醇酯20(吐温20)的TBS四次连续5分钟洗涤之后，将硝基纤维素浸泡在碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔抗体(Invitrogen)中。用包含O. 05%聚山梨醇酯20 (吐温20)的TBS四次连续5分钟洗涤之后，通过加入5 mL 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)溶液(Sigma)检测偶联物结合的脱水蛋白。c)从鳞叶卷柏组织全蛋白提取物纯化脱水蛋白。在IOmM tris. HClUmM 乙二醇四乙酸(EGTA)、lmM 二硫苏糖醇(DTT)，pH 8. O 的缓冲液中在4°C过夜透析20 mL鳞叶卷柏总蛋白提取物。用500mL相同缓冲液平衡20 mL基于二乙氨基乙基交联的琼脂糖的离子交换柱(DEAE-S^harose CL-6B)。透析过的提取液以约每秒I滴的速率通过该柱。添加样品之后，用20ml柱缓冲液洗涤该柱。然后通过应用IOOmLO. 02M: IM KCl梯度以4mL级分洗脱蛋白。通过十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳鉴定包含纯脱水蛋白的级分，如图2中所示，并合并级分9-15 (包含纯的脱水蛋白)。实施例2 分离野茶树脱水蛋白cDNA、克隆全长和截短的脱水蛋白序列以及在大肠杆菌中表达并纯化重组的脱水蛋白该过程涉及以下步骤
(a)从枯萎和未枯萎的茶芽(野茶树)构建互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库；
(b)选择仅仅在枯萎的cDNA文库中存在并且由47个独立的cDNA克隆(多于任何其它被检测的脱水蛋白)所代表的茶脱水蛋白重叠群的cDNA ；
(c)将选择的脱水蛋白cDNA序列克隆进大肠杆菌(E.coli)表达载体pDEST17并转化进大肠杆菌；
Cd)在培养中繁殖转化的大肠杆菌并诱导表达相应的茶脱水蛋白；
(e)裂解大肠杆菌细胞，用镍离子-氮川三乙酸树脂(Ni-NTA)纯化表达的脱水蛋白；
以及
Cf)在使用前用水透析该纯化的脱水蛋白。从枯萎的荼芽分离的总RNA
收获来自野茶树品种assamica的茶芽(两片叶和一个芽)，枯萎19小时(在部分密封的塑料袋中)。按照制造商的说明书使用植物RNA分离试剂盒(Qiagen)分离总核糖核酸(RNA) ο从mRNA合成cDNA以形成cDNA文库
按照制造商的说明书使用多聚腺苷酸分离试剂盒(Qiagen)从500 μ g总RNA纯化mRNA。将5 μ g多聚腺苷酸-mRNA分子以及2. 8 μ g包含Xhol限制位点的多聚腺苷酸接头引物(Stratagene)加热至72°C 5分钟，然后在冰上骤冷2分钟。在室温下初始孵育10分钟之后，用在IXRT缓冲液(Stratagene)中的75单位的逆转录酶(来自Stratagene的Stratascript RT)、2· 5 mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(包括脱氧腺苷三磷酸(dATP)、胸苷三磷酸(dTTP)、5-甲基脱氧胞苷三磷酸和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP))(Amersham-Pharmacia)和 40 单位的核糖核酸酶(RNAse)阻断剂(Stratagene)在 50 μ L 反应中在42°C逆转录mRNA 60分钟。通过添加IlyL DNA聚合酶I (9单位/ μ I) (Stratagene)、20 μ LlOx第二链合成缓冲液(Stratagene)、6 μ L dNTP (40 mM) (Amer sham-Pharmac i a)和 2μ RNAse Η(1·5 单位/ μ L) (Stratagene)在200 μ L反应中在16°C用45 μ L的第一链合成反应合成第二链cDNA150 分钟。通过添加 20. 7 μ L dNTP (IOmM)和 I. 8 μ L 克隆的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)(在超嗜热古细菌激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)中发现的酶)(2. 5单位/ μ L)而在72°C钝化180 μ L的第二链合成反应30分钟。通过用等体积的1:1 ν/ν酹/氯仿提取一次并用等体积的氯仿提取一次，然后用O. I体积的3Μ乙酸钠溶液(pH 5. 2)和2体积的乙醇在_20°C沉淀cDNA过夜而终止反应。将cDNA重悬于9 μ L EcoRl (从大肠杆菌菌株分离的核酸内切酶)连接物(Stratagene)中，并用4单位的Τ4 DNA连接酶(Stratagene) (Τ4是大肠杆菌的噬菌体)在IX连接酶缓冲液(Stratagene)+ I mM核糖核苷酸ATP (rATP)(Stratagene)中在8°C孵育过夜。通过加热至70°C 30分钟，然后在冰上骤冷2分钟而终止连接反应。然后通过添加I μ L T4多核苷酸激酶(10单位/ μ I) (Stratagene)、I μ I连接酶缓冲液(IOx)和I μ I rATP (IOmM)而在22 μ I反应中在37°C使cDNA末端磷酸化30分钟。通过使反应加热至70°C 30分钟而终止磷酸化反应。然后使用标准的分子生物学方法用XhoI限制性酶(Stratagene)消化cDNA。通过使用作为柱缓冲液的I X STE (IOOmM NaCl, 20mM三(羟甲基)氨基甲烷-HCL (pH 7. 5)，IOmM EDTA) (Stratagene)使 cDNA 通过 ImL (平床体积)柱(来自Clontech的Chroma Spin-400)而将cDNA按大小分级分离为12 x 100UL级分。然后，在溴化乙锭-I. 2%琼脂糖三(羟甲基)氨基甲烷-硼酸盐-EDTA(TBE)电泳凝胶(用Sigma试剂在内部制备)上使5 μ L的每个级分可视化。然后合并包含cDNA的前四个级分，乙醇沉淀并重悬于10 μ L IOmM三(羟甲基)氨基甲烷(ΡΗ7.6)中。 用在I X连接缓冲液+1 mM rATP中的2单位T4 DNA连接酶在5 μ L反应中在12°C将10 ng的合并的cDNA连接进20 ng pBluescript SK+ Xhol/EcoRl消化的载体中过夜。然后，根据制造商的说明书将cDNA文库转化进XLlO-Gold超感受态细胞(Stratagene)中。估计初始cDNA文库的大小为250，000个克隆，平均插入物大小为1072bP(碱基对)。手工挑取2592个克隆并制备DNA用于测序。扩增cDNA用于测序
菌落在225 r. p. m.和37°C在包含100 μ g/mL羧苄青霉素(Sigma)的2. 5 mL 2TY肉汤(每升16g胰蛋白胨、IOg NaCl、10g酵母提取物(pH 7.3))(用Sigma试剂在内部制备)中生长过夜。按照制造商的说明书使用montage质粒小规模制备(96)试剂盒(Millipore)分离质粒DNA。然后按照制造商的说明书使用PicoGreen DNA定量试剂盒(Molecular ProbesBV)定量DNA并稀释至50 ng / μ L。表汰序列标签的测序、重叠群的编译和同系物的鉴定
根据标准的荧光双脱氧测序方法用5 μ L 0. I μ g/ μ L的模板DNA和I μ I I pmol/ μ L的引物在Applied Biosystems Genetic Analyser 3100上进行DNA测序。对总共 1971 个表达序列标签(EST)克隆进行测序，这些中的1772个产生了良好质量的序列数据。将这些EST序列编译成重叠群。通过对以下EMBL公共数据库’ plantdna’、’ em_pl’、’ emnew_pl’、’ em_est_pl’、’ em_gss_pl’、’ em_nonpl’、’ emnew_nonpl’、’ em_est_nonpl’ 和 ’ em_gss_nonpl’进行blasting而用这些重叠群的每个的共有序列鉴定基因功能。使用TblastX和blastN搜索程序，将约500，000个结果解析到数据库中。对于每个茶基因鉴定单一的(最好注释的)同源物(对于单一 EST基因是自动的)。由47个独立的cDNA克隆代表的单一重叠群表现出与AF220407(河岸葡萄(Vitisriparia)脱水蛋白样蛋白(Dhn) mRNA)的显著的同源性(期望值3e_ll)。茶脱水蛋白表现出与脱水蛋白家族的成员相关联的所有典型的性状。该序列包含N-末端Y区段、S区段、C-末端附近的Φ区段和两个K区段，分别示意性且事实上地(SEQ. ID. I)如图3a和3b中所示。没有其它单一重叠群代表如此多独立的cDNA克隆。将全长的和截短的茶脱水蛋白克隆进PDEST17表达载体
根据Gateway Expression System (Invitrogen)说明书产生全长野生型茶脱水蛋白和两个截短的茶脱水蛋白。通过使用包含12 attB核苷酸的脱水蛋白模板特异性引物(Invitrogen)(见表I),在两步骤的聚合酶链式反应(PCR)过程中，将attB序列(来自大肠杆菌的工程化的外源区域)(Invitrogen)加入cDNA载体(来自Invitrogen的pBluescript)的脱水蛋白序列的任一端。在全长的和截短的茶脱水蛋白序列周围设计特异性引物以产生全长或截短的DNA中的任一种。第二步将通用attB序列(Invitrogen)加入全长的或截短的茶脱水蛋白序列以允许它被插入PDONR 221载体(Invitrogen)中。然后将pDONR 221载体与pDEST17细菌表达载体(具有T7启动子和核糖体结合位点)(Invitrogen)重组，pDEST17细菌表达载体编码组氨酸残基,组氨酸残基用于加入脱水蛋白以允许蛋白的纯化。设计茶脱水蛋白截短体(脱氧核苷酸编号364-606)以包含蛋白的C-末端的Φ和·两个K区段。高度保守的K区段结构域被认为对于脱水蛋白活性是至关重要的。较小的茶脱水蛋白截短体(脱氧核苷酸编号487-606)仅仅由C-末端的Φ和一个K区段组成。图4a和5a分别显示每种茶叶脱水蛋白截短体的图示的核苷酸序列，图4b和5b显示每种茶叶脱水蛋白截短体的实际的核苷酸和推导的氨基酸序列(分别为SEQ. ID. 2和3)。(Forsythia suspensa)月兑 7尺蛋白 cDNA 并 >1各其克隆进 pDEST 17
除了茶脱水蛋白外，通过对从连翘树皮中分离的多聚腺苷酸RNA的实时聚合酶链式反应(RT-PCR)而分离另一种脱水蛋白基因。N-末端的连翘属序列的缺乏意味着需要另一种策略来克隆连翘属脱水蛋白。从氨基酸序列数据鉴定了与脱水蛋白具有同源性的短肽T，D/E, E, Y, G, N, P, V, Q, H。这种短肽序列的存在连同文献中的数据，例如 Close (Physiologica Plantarum, 100, 291-296 (1997))的表 I 中公开的被子植物脱水蛋白的保守的氨基酸序列，提供了克隆连翘属脱水蛋白的另一种方法。为了实现这一目标，根据 Close (Physiologica Plantarum, 100, 291-296 (1997)),设计针对‘Y-区段’脱水蛋白结构域！7丨03，￥，6，队？(见图1)的两条简并的正向引物(F0R-D4和F0R-D5)。它们会说明苏氨酸和缬氨酸之间的N-末端共有区域的残基的变化。因此，引物F0R-D4 (ACIGAYGARTAYGGIAAYCC) (SEQ. ID. 5)利用苏氨酸作为第一个氨基酸，而 F0R-D5 (GTIGAYGARTAYGGIAAYCC) (SEQ. ID. 6)利用缬氨酸作为第一个氨基酸。根据 Close (Physiologica Plantarum, 100, 291-296 (1997))设计针对‘K-区段’结构域(E，K，K，G，I，M，D，K，I，K，E，K，L，P，G)(见图 I)的反义引物 F0R-R2(ARYTTYTCYTTDATYTTRTCCAT) (SEQ. ID. 7)。在上述的引物序列中，字母“I”代表肌苷(其与任何碱基结合)，在随附的格式化的序列表中已经被“N”替代，这导致和肌苷相同的技术效果。然后，使用从连翘属树皮提取的总的多聚腺苷酸化的RNA作为模板，通过RT-PCR，使用这些引物来合成连翘属脱水蛋白cDNA序列。然后设计引物从而使用GIBCO 5’ RACE(cDNA末端的快速扩增)系统试剂盒2. O版(Life Technologies)来捕获连翘属cDNA的3’和5’末端。将连翅属cDNA插入载体(pGEif-T Easy载体，来自Promega),并用GatewayExpression System (Invitrogen)克隆进如上所述的pDEST17。图6显示连翅属核苷酸和推导的氨基酸序列。表I显示了用于将连翘属脱水蛋白序列克隆进PDEST17的引物。表I :用于产生脱水蛋白序列侧翼的attB(来自大肠杆菌的工程化的外源区域)重组目标位点的聚合酶链式反应(PCR)引物
权利要求
1.干燥的可再水化的食品，所述食品包含少于10%w/w水和至少O. 02% w/w的脱水蛋白及其衍生物，所述脱水蛋白及其衍生物包含选自K，I, K, E, K, L, P，G、K, I, K, E/D, K, L/I,P, G和K，I, K, E/D, K, L/I/T/V, P/H/S, G的氨基酸序列，其中所述干燥的可再水化的食品是蔬菜或其部分和/或水果或其部分的未破损的组织，并且不是种子，其中所述未破损的组织具有至少O. 5毫米的最短线性尺寸，优选O. 5至25毫米、更优选O. 5至10毫米的最短线性尺寸。
2.权利要求I的干燥的可再水化的食品，包含O.02-20、优选O. 1-5、最优选O. 2-2. 5%w/w的脱水蛋白及其衍生物。
3.权利要求I或2的干燥的可再水化的食品，其中所述脱水蛋白及其衍生物具有1-150、优选5-100、最优选5-50kD的分子量。
4.前述权利要求中任一项的干燥的可再水化的食品，其中所述脱水蛋白及其衍生物是源自野茶树(Camellia sinensis)、连翅属(Forsythia)和卷柏属(Selaginella)的脱水蛋白。
5.前述权利要求中任一项的干燥的可再水化的食品，其中所述脱水蛋白及其衍生物具有与SEQ. ID NO. I至少80%相同，优选与之至少90%、95%或99%相同的氨基酸序列。
6.前述权利要求中任一项的干燥的可再水化的食品，其中所述脱水蛋白及其衍生物具有与SEQ. ID NO. 2至少80%相同，优选与之至少90%、95%或99%相同的氨基酸序列。
7.前述权利要求中任一项的干燥的可再水化的食品，其中所述脱水蛋白及其衍生物具有与SEQ. ID NO. 3至少80%相同，优选与之至少90%、95%或99%相同的氨基酸序列。
8.前述权利要求中任一项的干燥的可再水化的食品，其中所述可再水化的食品额外包括选自海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、棉子糖、酶抗氧化剂或非酶活性氧种类清除剂的化合物。
9.权利要求8的干燥的可再水化的食品，其中所述酶抗氧化剂选自过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。
10.权利要求8的干燥的可再水化的食品，其中所述非酶活性氧种类清除剂选自抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素。
11.前述权利要求中任一项的干燥的可再水化的食品，其中所述蔬菜选自菠菜、西兰花、洋葱、茄子、小胡瓜、土豆、南瓜、蘑菇、胡萝卜、茶、芦笋、萝卜、韭菜、甜菜、花椰菜、块根芹、朝鲜蓟、薄荷、百里香、牛至、迷迭香、欧芹、鼠尾草、细香葱、马郁兰、罗勒、月桂叶、龙蒿、旱芹和大蒜，所述水果选自柠檬、覆盆子、红醋栗、黑莓、悬钩子、蓝莓、草莓、菠萝、香蕉、桃、杏、荔枝、苹果、梨、番茄、辣椒、黄瓜和芒果。
12.食品产品，包含前述权利要求中任一项的干燥的可再水化的食品。
13.权利要求12的食品产品，其选自干燥的汤、干燥的饮料、早餐谷物、酸奶和干燥的调味汁。
14.用于制备权利要求1-11中任一项的干燥的可再水化的食品的方法，所述方法包括步骤 (a)用脱水蛋白及其衍生物注入不包括种子的蔬菜或其部分或水果或其部分以产生注入的食品，所述脱水蛋白及其衍生物包括选自K，I, K, E, K, L, P, G ；K, I, K, E/D, K, L/I, P, G ；和 K，I, K, E/D, K, L/I/T/V, P/H/S, G 的氨基酸序列；和(b)干燥注入的食品从而产生权利要求1-11中任一项的干燥的可再水化的食品。
15.权利要求14的用于制备干燥的可再水化的食品的方法，其中权利要求14的步骤(a)在真空下进行。
16.权利要求14或15的用于制备干燥的可再水化的食品的方法，其中权利要求14的步骤(a)在3-70、优选10-50、最优选15_30°C的温度进行。
17.用于制备权利要求1-11中任一项的干燥的可再水化的食品的方法，所述方法包括步骤 (a)将基因克隆进植物表达载体从而产生修饰的植物表达载体，其中所述基因编码脱水蛋白及其衍生物，其中，所述脱水蛋白及其衍生物包括选自K，I, K, E, K, L, P, G ；K, I, K, E/D, K, L/I, P, G ;和 K，I, K, E/D, K, L/I/T/V, P/H/S, G 的氨基酸序列； (b)通过植物转化将修饰的植物表达载体弓I入目标作物从而产生转基因的目标作物； (c)生长所述转基因的目标作物从而表达脱水蛋白及其衍生物；并且然后 (d)干燥所述转基因的目标作物从而产生权利要求1-11中任一项的干燥的可再水化的食品。
18.具有与SEQ.ID NO. I相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。
19.具有与SEQ.ID NO. 2相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。
20.具有与SEQ.ID NO. 4至少80%相同，优选与之至少90%、95%或99%相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。
全文摘要
干燥的可再水化的食品如在干燥的汤、干燥的饮料、早餐谷物、酸奶和干燥的调味汁中的用途是广泛的。然而，已经观察到，当干燥组分是水果和/或蔬菜时，再水化后的组分就不像干燥前的水果和/或蔬菜。也就是说，它们不再有新鲜的外观，而是褪色并缺乏硬度。这种转变是由于干燥过程中发生的细胞损伤。尤其地，据信，细胞的两亲物的插入、相变为凝胶相和膜融合使磷脂膜去稳定。本发明力图通过提供干燥的可再水化的食品等解决上述技术问题，该食品是水果、蔬菜或其部分，其再水化后具有改善的外观、质地和再水化特性。具体而言，提供了干燥的可再水化的食品，所述食品包含少于10％w/w水和至少0.02％w/w的脱水蛋白及其衍生物，所述脱水蛋白及其衍生物包含选自K,I,K,E,K,L,P,G；K,I,K,E/D,K,L/I,P,G；和K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G的氨基酸序列，其中所述干燥的可再水化的食品是蔬菜或其部分和/或水果或其部分的未破损的组织，不是种子，其中所述未破损的组织具有至少0.5毫米的最短线性尺寸，优选0.5至25的最短线性尺寸，更优选为0.5至10毫米。还提供了包含干燥的可再水化的食品的食品产品以及用于制备干燥的可再水化的食品的方法。
文档编号A23L1/212GK102905555SQ201180027569
公开日2013年1月30日 申请日期2011年5月25日 优先权日2010年6月8日
发明者M.J.贝里, J.卡西, R.A.根加比舒恩, A.P.奥尔梅罗德, S.P.雷德弗恩, J.西尔瓦德, J.E.威尔金森 申请人:荷兰联合利华有限公司