专利名称：转基因芸苔属植物事件mon 88302及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和农业领域，尤其涉及转基因作物植物领域。
背景技术：
芸苔属作物在世界上许多地区是非常重要的。可将生物技术的方法用于此类作物以产生具有改良性状例如除草剂耐受性的作物。可通过表达能够提供这样的耐受性的转基因来在转基因植物中获得除草剂耐受性。转基因在植物中的表达可受因素例如转基因盒中使用的调控元件、转基因插入物的染色体定位以及接近整合位置的任何内源调控元件的接近度(proximity)的组合影响。例如，已观察到在类似产生的事件之间在转基因表达的总体水平上或转基因表达的空间或时间模式上存在广泛的变化。为此原因，可能必需产生和测试数百个单个植物转化事件以最终鉴定对于商业农业目的是有用的一个事件。一旦被鉴定为具有期望的转基因表达 和分子特征，随后可使用植物育种方法将这样的事件用于将该性状渐渗入其它遗传背景。所得的后代可包含转基因事件，因此可具有原始转化体的该性状的转基因表达特征。这可用于产生许多不同的包含改良的性状并且经适当地改造适合于特定地方生长条件的作物品种。发明概述本发明提供了包含事件MON 88302的转基因植物和种子，其代表性种子样品已由美国典型培养物保藏中心(ATCC)以登录号PTA-10955保藏。包含事件的植物展示商业上可接受的对草甘膦除草剂的应用的耐受性。本发明提供了包含事件的后代植物、植物部分和细胞；与事件相关的重组DNA分子和使用此类分子的方法；从事件衍生的或包含其的商业产品；以及使用事件的方法。本发明提供了包含事件的植物、种子、细胞、后代植物或植物部分以及从包含事件的植物、细胞、植物部分或种子衍生的商业产品。本发明因此提供了包含具有核苷酸序列的DNA分子的植物、种子、细胞、后代植物、植物部分或商业产品，所述核苷酸序列选自SEQ IDNO:USEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8及其片段。本发明提供了包含重组DNA分子的植物、种子、细胞、后代植物或植物部分，所述重组DNA分子例如在DNA扩增法中产生包含本发明的DNA分子的扩增子。本发明提供了与事件相关的DNA分子。此类DNA分子可包含代表或来源于如下序列的核苷酸序列:事件MON 88302的转基因插入与侧翼基因组DNA的接合处，和/或侧翼连接插入的DNA的基因组DNA的区域，和/或侧翼连接插入位点的整合的转基因DNA的区域，和/或整合的转基因表达盒的区域，和/或此类区域的任何区域的连续序列。本发明还提供了用作诊断事件的引物和探针的DNA分子。提供了包含此类分子的植物、细胞、植物部分、商业产品、后代和种子。本发明提供了用于检测来源于事件的DNA的存在的方法、组合物和试剂盒。本发明提供了通过如下步骤检测事件的方法:将包含DNA的样品与当与来自事件的基因组DNA一起用于核酸扩增反应时产生诊断事件的扩增子的引物组接触，进行核酸扩增反应，从而产生扩增子，和检测扩增子。本发明还提供了通过如下步骤检测事件的方法:将包含DNA的样品与当与来自事件的基因组DNA —起用于杂交反应时与对于事件是特异性的DNA分子杂交的探针接触，进行杂交反应，和检测探针对DNA分子的杂交。还提供了包括用于检测来源于事件的DNA的存在的本发明的方法和组合物的试剂盒。本发明提供了通过如下步骤控制田间杂草的方法:通过种植包含事件的植物(即，种植包含事件的种子)，随后施用有效剂量的能够控制杂草而不损伤包含事件的植物的草甘膦。 本发明提供了通过如下步骤产生耐受草甘膦除草剂的施用的植物和/或种子的方法:将包含事件或包含选自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6, SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列的耐受草甘膦的植物与第二植物接触，从而产生种子，生长所述种子以产生后代植物，用草甘膦处理后代植物，以及选择包含事件并且耐受草甘膦的后代植物。本发明提供了通过如下步骤产生耐受草甘膦除草剂的施用的植物和/或种子的方法:将包含事件或包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4, SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列的耐受草甘膦的植物自交，从而产生种子，生长种子以产生后代植物，利用草甘膦处理后代植物；和选择包含事件并且耐受草甘膦的后代植物。本发明提供了通过如下步骤测定包含事件的植物或种子的接合性的方法:将包含DNA的样品与当与来自事件MON 88302的基因组DNA —起用于核酸扩增反应时产生诊断事件的扩增子的第一引物组接触，进行核酸扩增反应，从而产生扩增子，检测扩增子，将样品与第二引物组(所述第二引物组，当与来自植物的基因组DNA—起用于核酸扩增反应时产生第二扩增子，所述第二扩增子包含与鉴定为事件MON 88302的转基因插入的基因组区域同源的天然基因组DNA)接触，进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子，检测第二扩增子，并且比较样品中的第一与第二扩增子，其中两种扩增子的存在表明样品和从而植物或种子对于转基因插入是杂合的。本发明的上述和其它方面根据下列详述将变得更显而易见的。附图简述
图1:事件MON 88302的图解表示；[A]相应于5’连接区域(junction region)的相对位置；[B]相应3’连接区域的相对位置；[C]相应于插入的转基因DNA的侧翼区域的相对位置和5’末端的部分；[D]相应于插入的转基因DNA的3’侧翼区域的相对位置和3’末端的部分；[E]表示转基因表达盒；和[F]表示欧洲油菜(Brassica napus)基因组侧翼序列和转基因表达盒的连续序列。图2:显示当在4至6叶期施用草甘膦时与MON 88302相比较RT73事件的籽粒产量。RT73命名为RRl。图3:显示当在第一朵花时施用草甘膦时与MON 88302相比较RT73事件的籽粒产量。RT73命名为RRl。序列简述SEQ ID NO:1_代表欧洲油菜基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5’接合序列的60个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQ ID NO:3的位点762至821 ([C]，参见图1)和相应于SEQ ID NO:6的位点762至821。SEQ ID NO:2_代表整合的转基因表达盒与欧洲油菜基因组DNA之间的3’接合处的60个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQ ID NO:4的位点313至372 ([D]，参见图1)和相应于SEQ ID NO:6的位点5189至5248。SEQ ID NO:3_侧翼连接事件MON 88302的插入DNA达到和包括转基因DNA的区域的5’序列。SEQ ID NO:3的核苷酸位点762至821相应于SEQ ID NO:1的核苷酸位点I至60 ；SEQ ID NO:3的核苷酸位点742至841相应于SEQ ID NO:7的核苷酸位点I至100，以及SEQ ID NO:3的核苷酸位点792至956相应于SEQ ID NO:5的核苷酸位点I至165。SEQ ID NO:4_侧翼连接事件MON 88302的插入DNA达到和包括转基因DNA的区域的3’序列。SEQ ID NO:4的核苷酸位点313至372相应于SEQ ID NO:2的核苷酸位点I至60 ；SEQ ID NO:4的核苷酸位点293至392相应于SEQ ID NO:8的核苷酸位点I至100，以及SEQ ID NO:4的核苷酸位点I至342相应于SEQ ID NO:5的核苷酸位点4086至4427。SEQ ID NO:5_赋予草甘膦除草剂耐受性的`整合的转基因表达盒的序列。SEQ IDNO:5相应于SEQ ID NO:6的核苷酸位点792至5218。SEQ ID NO:6_代表侧翼连接事件MON 88302的插入的DNA的5’序列(SEQ ID NO:3)、整合的表达盒的序列(SEQ ID NO:5)和侧翼连接事件MON 88302的插入的DNA的3’序列(SEQ ID NO:4)的重叠群的核苷酸序列。SEQ ID NO -J-代表欧洲油菜基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5’接合序列的100个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQ ID NO:3的位点742至841 ([C]，参见图1)和相应于SEQ ID NO:6的位点742至841。SEQ ID NO:8_代表整合的表达盒与欧洲油菜基因组DNA之间的3’接合处的100个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQ ID NO:4的位点293至392([D]，参见图1)，和相应于SEQ ID NO:6的位点5169至5268。SEQ ID NO:9_用于鉴定事件MON 88302的引物SQ20901。引物SQ20901与插入的表达盒在接近3’转基因插入边界的区域上互补。使用引物SQ20901和SQ23770(SEQ IDNO:10)的组合产生的扩增子为事件MON 88302的存在的阳性结果。SEQ ID NO:10为称为引物SQ23770并且用于鉴定事件MON 88302的引物的序列。引物SQ23770与侧翼连接插入的表达盒并且接近转基因DNA插入边界的3’区域互补。使用引物SQ20901(SEQ ID NO:9)和SQ23770的组合产生的扩增子为事件MON 88302的存在的阳性结果。SEQ ID NO:11为称为探针PB10164和用于鉴定事件MON 88302的探针的序列。其与侧翼连接插入的表达盒并且与转基因DNA插入边界接近的3’区域互补。该探针为6FAM -标记的合成寡核苷酸。在使用与6FAM -标记的探针PB10164组合的引物SQ20901和SQ23770(SEQ ID NO:9-10)的扩增反应中荧光信号的释放在TAQMAN 测定中被诊断为事件 MON 88302。SEQ ID NO:12为称为引物SQ21948并且用于鉴定MON 88302事件的接合性的引物的序列。SEQ ID NO:13为称为引物SQ24635并且用于鉴定欧洲油菜野生型的接合性的引物的序列。SEQ ID NO:14为称为引物SQ22176并且用于鉴定MON 88302事件和欧洲油菜野生型的接合性的引物的序列。SEQ ID N0:15为用于MON 88302事件的接合性的测定的探针(PB4213)的序列。SEQ ID NO:16为用于欧洲油菜野生型的接合性测定的探针(PB10787)的序列。SEQ ID NO:17为称为引物SQ2563并且用作TAQMAN 测定的内部对照的引物的序列。SEQ ID NO:18为称为引物SQ2564并且用作TAQMAN 测定的内部对照的引物的序列。SEQ ID NO:19为用作TAQMAN 测定的内部对照的VIC -标记的合成寡核苷酸探针(PB0751)的序列。详细描述下列定义和方法被提供来更好地定义本发明和在本发明的实施中指导本领域技术人员。除非另外指出，否 则将根据相关领域技术人员常规使用的含义来理解术语。如本文中所用，术语“包含”意指“包括但不限于”。本发明提供了转基因事件MON 88302。如本文中所用，术语“事件”是指作为将转基因DNA在染色体的特定位置上插入植物的基因组的结果产生的DNA分子。事件MON 88302是指作为具有本文中提供为SEQ ID NO:5的序列的转基因DNA至欧洲油菜A基因组的连锁群N4上的特定位置的插入的结果而产生的DNA分子。也在本发明中提供了包含事件MON88302的植物和种子。包含MON 88302的种子样品已由美国典型培养物保藏中心(ATCC)以登录号PTA-10955保藏。包含MON 88302的植物显示商业上可接受的对草甘膦除草剂的施用的耐受性。包含事件的植物可以指包括插入植物的基因组中的特定位置的转基因的原始转化体。包含事件的植物还可指包括插入植物的基因组的特定位置的转基因的原始转化体的后代。这样的后代可通过自交或通过转化体或其后代与另一种植物之间的有性异型杂交(outcross)来产生。这样的其它植物可以为包含相同或不同的转基因的转基因植物和/或非转基因植物例如来自不同品种的非转基因植物。甚至在轮回亲本重复回交后，来自转化的亲本的插入的DNA和侧翼DNA在相同的基因组位置上存在于杂交的后代中。转基因事件MON 88302通过转基因DNA(在本文中提供为SEQ ID NO:5)至欧洲油菜植物的A基因组的连锁群N4的插入来产生。欧洲油菜通常被称为油菜籽，特定品种可称为油菜(canola)。如本文中所用，术语“油菜”或“油菜植物”是指能够被用于产生介花油(canola oil)(即满足包含少于2 %的芥酸的特殊质量指标的油)的芥属植物，包括多种品种:欧洲油菜，芜菁甘蓝(Brassica napobrassica)、芜菁(Brassica rapa)、芥菜型油菜(Brassica juncea)和白菜型油菜(Brassica campestris)。因为欧洲油菜为由完菁(先前称为白菜型油菜)和甘蓝(Brassica oleracea)杂交产生并且保留两者的基因组的异源四倍体，可将包含转基因事件MON 88302的欧洲油菜植物与育种方法一起使用以将MON 88302事件(从而草甘膦耐受性性状)引入芸苔属的其它成员。用于实施本发明的方法的芸苔属的成员的实例包括但不限于芥菜型油菜、芜菁甘蓝(Brassica napobrassica)、甘蓝、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、欧洲油菜、芜菁和白菜型油菜，以及属于芸苔属的允许芸苔属种之间育种的任何其它植物。包含事件MON 88302的DNA分子是指包含插入的转基因DNA的至少一部分(提供为SEQ ID NO:5)和紧邻插入的DNA的侧翼基因组DNA的至少一部分的DNA分子。这样，包含事件MON 88302的DNA分子具有代表转基因DNA插入物的至少一部分和已将转基因DNA插入其中的植物的基因组的特定区域的至少一部分的核苷酸序列。与周围植物基因组相关的事件MON 88302中的插入的DNA的排列对于事件MON 88302是特异性的和独特的，因此,这样的DNA分子的核苷酸序列是描述性的并鉴定事件MON 88302。这样的DNA分子的序列的实例在本文中提供为 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。该DNA分子也是包含事件MON 88302的植物的染色体的整体部分并且可被传递至植物的后代。事件MON 88302赋予对施用至植物的草甘膦除草剂的抗性。“草甘膦”是指N-磷酰甲基-甘氨酸及其盐。草甘膦为对广谱植物种类具有活性的除草剂。当施用于植物表面时，草甘膦全身性地移动遍布植物。草甘膦因其对提供了用于合成芳香族氨基酸的前体的莽草酸途径的抑制而具有光毒性。如本文中所用，术语“重组”是指通常未在自然界中发现的并且因而通过人干预产生的DNA和/或蛋白质和/或生物体形式。这样的人干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。如本文中所用，“重组DNA分子”为包含不能一起天然存在的DNA分子的组合并且为人干预的结果的DNA分子，例如由至少两个彼此异源的DNA分子的组合组成的DNA分子，和/或为人工合成的并且包含从通常存在于自然界中的多核苷酸序列衍生的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工地 整合入宿主细胞的基因组DNA的转基因和相连的宿主细胞的基因组的侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例为本文中描述的因转基因至欧洲油菜基因组内的插入而产生的DNA分子，其可最终导致重组RNA和/或蛋白质分子在该生物体中表达。如本文中所用，“重组植物”为通常非天然地存在的植物，其为人干预的结果，并且包含整合入其基因组的转基因和/或异源DNA分子。作为这样的基因组改变的结果，重组植物与相关的野生型植物截然不同。重组植物的实例为在本文中描述为包含事件MON 88302的植物。如本文中所用，术语“转基因”是指人工地整合入宿主细胞的基因组的多核苷酸分子。这样的转基因对于宿主细胞可以是异源的。术语“转基因植物”是指包含这样的转基因的植物。如本文中所用，术语“异源的”是指通常被发现在自然界中不与第二分子组合的第一分子。例如，分子可来源于第一物种并且被插入第二物种的基因组。分子因此对于宿主是异源的并且被人工地整合入宿主细胞的基因组。如本文中所用，术语“嵌合的”是指通过将第一 DNA分子融合于第二 DNA分子产生的单个DNA分子，其中通常发现第一和第二 DNA分子通常都不以该构型(即彼此融合)存在。嵌合DNA分子因此为另外通常在自然界中不能被发现的新DNA分子。本发明提供了 DNA分子及其相应的核苷酸序列。如本文中所用，术语“DNA序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常从5’(上游)末端至3’(下游)末端显示的DNA分子的核苷酸的序列。本文中使用的命名法为美国联邦法规法典(United States Codeof Federal Regulations) § 1.822 的 Title 37 所要求的和 WIPO Standard ST.25(1998),附录2中的表(表I和3)中所示的命名法。本发明仅公开转基因事件MON 88302中提供的两条单核苷酸序列链的一条链。因此，通过推断和推断，互补序列(在本领域中也称为完全互补序列或逆互补序列)在本发明的范围内，从而也预期在所述主题的范围内。相应于插入的转基因DNA的完全核苷酸序列和侧翼连接插入的转基因DNA的任一末端的欧洲油菜基因组DNA的大部分区段的核苷酸序列在本文中提供为SEQ ID NO:6。该核苷酸序列的小部分为提供为SEQ ID NO:5的插入的转基因DNA。侧翼连接插入的转基因DNA的5’末端和插入的DNA的5’末端的一部分的基因组DNA的核苷酸序列在本文中提供为SEQ ID NO:3。侧翼连接插入的转基因DNA的3’末端和插入的DNA的3’末端的一部分的基因组DNA的核苷酸序列在本文中提供为SEQ ID NO:4。横跨其中转基因DNA连接于和联接于基因组DNA的位置的区域,在本文中称为接合处(junction)。“接合序列(junctionsequence) ”或“接合区域(junction region) ”是指横跨插入的转基因DNA和相邻侧翼基因组DNA的DNA序列和/或相应DNA分子。事件MON 88302的接合序列的实例在本文中提供为SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。来源于芸苔属植物或种子的核苷酸分子中这些接合序列之一的鉴定确定了 DNA获自事件MON 88302并且被诊断为来自事件MON 88302的DNA在样品中的存在。SEQ ID NO:1为横跨基因组DNA与插入的DNA的5’末端之间的接合处的60个核苷酸的序列。SEQ ID NO:7为横跨基因组DNA与插入的DNA的5’末端之间的接合处的100个核苷酸的序列。SEQ ID NO:2为横跨基因组DNA与插入的DNA的3’末端之间的接合处的60个核苷酸的序列。SEQ ID NO:8为横跨基因组DNA与插入的DNA的3’末端之间的接合处的100`个核苷酸的序列。来源于转基因事件MON88302的包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的DNA的任何区段在本发明的范围内。来源于转基因事件MON 88302的包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的DNA的任何区段在本发明的范围内。此外，包含与本段落内描述的任何序列互补的序列的任何多核苷酸在本发明的范围内。图1举例说明了 SEQ ID NO:1-5和SEQ ID NO:7_8相对于从5’至3’排列的SEQID NO:6的物理排列。本发明还提供了包含DNA分子的核酸分子，所述DNA分子具有与SEQID NO:6的全长具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。本发明提供了可用作用于诊断来源于事件MON 88302的DNA在样品中的存在的引物或探针的示例性DNA分子。此类引物或探针对于靶核酸序列是特异性的，因此对于利用本文中描述的本发明的方法鉴定事件MON 88302核酸序列是有用的。“引物”通常是高度纯化的分离的多核苷酸，其被设计来用于包括热扩增的特异性退火或杂交法。可将一对引物与模板DNA例如欧洲油菜基因组DNA的样品一起用于热扩增，例如聚合酶链式反应(PCR)，以产生扩增子，其中从这样的反应产生的扩增子可具有相应于位于其中引物与模板杂交的两个位点之间的模板DNA的序列的DNA序列。如本文中所用，“扩增子”为一条或一段已使用扩增技术合成的DNA，即扩增反应的产物。在本发明的一个实施方案中，诊断事件MON 88302的扩增子包括未在欧洲油菜基因组中天然存在的序列。本发明的扩增子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2及其互补序列的至少约40个连续核苷酸。引物通常被设计来与互补靶DNA链杂交以形成引物与靶DNA链之间的杂种，并且引物的存在是被聚合酶识别以开始使用靶DNA链作为模板延伸引物(S卩，另外的核苷酸至不断延长的多核苷酸分子内的聚合)的点。如本发明中所用，引物对意指为了线性扩增被引物对的单个成员靶向结合的位置之间的多核苷酸区段，通常在热扩增反应或其它常规核酸扩增法中使用两个结合双链核苷酸区段的相反链的引物。用作引物的示例性DNA分子提供为SEQID NO:9-10o提供为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10的引物对可用作第一 DNA分子和与第一 DNA分子不同的第二 DNA分子，并且两个分子各自具有充分长度的SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的连续核苷酸或其互补序列以用作DNA引物，以便当与来源于事件MON 88302的模板DNA—起用于热扩增反应中时，可产生对于转基因事件MON 88302的3’部分是特异性和独特的扩增子。该示例性引物对可用于扩增诊断事件MON 88302的3’接合区域。类似地，本发明提供了可用于扩增诊断事件MON 88302的5’接合区域的引物对。此类引物可包含第一 DNA分子和与第一 DNA分子不同的第二 DNA分子，两者具有充分长度的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的连续核苷酸或其互补序列以用作DNA引物，以便当与来源于事件MON 88302的模板DNA —起用于热扩增反应时，可产生对于转基因事件MON 88302的5’部分是特异性和独特的扩增子。“探针”为与靶核酸的链互补的分离的核酸。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸而且还包括特异性结合靶DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且这样的结合的检测在诊断、鉴别、确定或确认该靶DNA序列在特定样品中的存在中是有用的。可将探针连接于常规可检测标记或报道分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。在本发明的一个实施方案中，诊断事件MON 88302的探针包括未在欧洲油菜基因组中天然存在的序列。用作探针的示例性DNA分子提供为SEQ ID NO =Il0根据本发明的探针和引物可与靶序列具有完全序列同一性，虽然可通过常规方法设计与靶序列不同的保持优先与靶序列杂交的能力的引物和探针。为了核酸分子能够用作引物或探针，其仅需在序列上充分互补以能够在所使用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。任何常规核酸杂交或扩增方法可用于鉴定来自事件MON 88302的转基因DNA在样品中的存在。探针和引物在长度上通常为至少约11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约24个核苷酸或至少约30个核苷酸或更多个核苷酸。此类探针和引物在严格杂交条件下与祀DNA序列特异性杂交。常规严格条件由Sambrook等人，1989和由Haymes等人在:Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington,DC(1985)中描述。如本文中所用，如果两个核酸能够形成反向平行双链核酸结构，则两个核苷酸分子被认为能够彼此特异性杂交。如果核酸分子显示完全互补性，则它们被认为是另一个核酸分子的“互补序列”。如本文中所用，当分子之一的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则分子被认为显示“完全互补性”。如果两个分子以足以允许它们在至少常规“低严格”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被认为是“最低程度互补”。类似地，如果分子可以以足以允许它们在常规“高严格”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被认为是“互补的”。因此偏离完全互补性是可允许的，只要这样的偏离不完全排除分子形成双链结构的能力。 如本文中所用，术语“分离的”是指至少部分地将分子与通常在其自体或天然状态中与其联接的其它分子分离。在一个实施方案中，术语“分离的”是指这样的DNA分子，其至少部分地与在自体或天然状态中通常侧翼连接所述DNA分子的核酸分离。因此，例如作为重组技术的结果融合于它们通常不与其联接的调控或编码序列的DNA分子在本文中被认为是分离的。此类分子即使当整合入宿主细胞的染色体或与其它DNA分子一起存在于核酸溶液中时亦被认为是分离的。本领域技术人员公知的许多方法可用于分离和操作本发明中公开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链式反应)技术可用于扩增特定起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段还可通过其它技术例如通过利用化学方法直接合成片段(这通常通过使用自动寡核苷酸合成仪来实施)来获得。因此本文中提供的DNA分子和相应的核苷酸序列尤其对于鉴定事件MON 88302，选择包含事件MON 88302的植物品种或杂种，检测来源于事件MON 88302的DNA在样品中的存在，和监测样品的事件MON 88302的存在和/或不存在或包含事件MON 88302的植物和植物部分是有用的。本发明提供了植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织、纤维和叶)以及商业产品。此类植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商业产品包含可检测量的本发明的多核苷酸，即例如具有提供为SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列的至少一个的多核苷酸。本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分还可包含一个或多个另外的转基因。这样的转基因可以是编码赋予期望的性状(包括但不限于增强的昆虫抗性、增加的水分利用效率、增加的产量性能、增强的抗旱性、增强的种子质量、疾病抗性、改良的营养质量和/或增强的除草剂耐受性)蛋白质或RNA分子的任何核苷酸序列，其中相对于缺乏这样的另外的转基因的可比较植物测量期望的性状。本发明提供了来源于包含事件MON 88302的转基因植物的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织以及叶。为了使得能够进行本发明，已按照布达佩斯协议保藏了 包含事件MON 88302的种子的代表性样品。经选择用于接收保藏物的贮藏处为美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为10801 University Boulevard,Manassas, Virginia USA, Zip Code 20110。ATCC 忙藏处已给事件 MON 88302 种子分配了登录号 PTA-10955。本发明提供了在其基因组中包含具有SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID N0:7或SEQ ID NO:8的DNA分子的微生物。这样的微生物的实例为转基因植物细胞。微生物例如本发明的植物细胞在许多工业应用中是有用的，所述工业应用包括但不限于:(i)用作用于科学调查或工业研究的研究工具；(ii)用于用于产生可用于随后的科学研究或用作工业产品的内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产物或小分子的培养；和(iii)与现代植物组织培养技术一起使用以产生随后可用于农业研究或生产的转基因植物或植物组织培养物。微生物例如转基因植物细胞的产生和使用利用现代微生物学技术和人干预来产生人造的独特的微生物。在该方法中，将重组DNA插入植物细胞的基因组以产生与天然存在的植物细胞分离且独特的转基因植物细胞。该转基因植物细胞可随后使用现代微生物技术进行培养(与细菌和酵母细胞非常相似)，并且可以以未分化的单细胞状态存在。新型植物细胞的遗传组成和表型为通过将异源DNA整合入细胞的基因组产生的技术作用。本发明的另一个方面为使用本发明的微生物的方法。使用本发明的微生物例如转基因植物细胞的方法包括(i)通过将重组DNA整合入细胞的基因组，随后使用该细胞衍生具有相同异源DNA的另外的细胞来产生转基因细胞的方法；(ii)使用现代微生物技术培养包含重组DNA的细胞的方法；(iii)从培养细胞产生并且纯化内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产物的方法；和(iv)使用现代植组织培养技术利用转基因植物细胞产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。如本文中所用，“后代”包括从具有提供为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列的至少一个的祖先植物和/或多核苷酸衍生的包含事件DNA的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生植物部分。植物、后代和种子对于转基因可以是纯合的或杂合的。后代可从由包含事件MON 88302的植物产生的种子和/或从由利用包含事件MON 88302的植物的花粉授精的植物产生的种子生长而来。可将后代植物自花受粉(也称为“自交”)以产生植物的纯育品系，即对于转基因是纯合的植物。适当的后代的自交可产生对于两个添加的外源基因是纯合的植物。或者，可将后代植物与另一种植物异型杂交例如交配，以产生品种或杂种种子或植物。另一种植物可以为转基因或非转基因的。本发明的品种或杂种种子或植物因此可通过如下步骤来衍生:将不存在事件MON 88302的特异性和独特的DNA的第一亲本与包含事件MON 88302的第二亲本杂交，从而导致包含事件MON 88302的特异性和独特的DNA的杂种。每一个亲本可以为杂种或近交种(inbred)/品种，只要杂交或交配导致本发明的植物或种子，即具有至少一个包含事件MON 88302的特异性和独特的DNA和/或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的等位基因的种子。因此可将两种不同的转基因植物交配以产生包含两个独立地分离的额外的外源基因的杂种后代。例如,可将包含事件MON 88302的耐受草甘膦的植物与另一种转基因植物杂交以产生具有两个转基因亲本的特征的植物。该方法的一个实例为包含事件MON 88302的耐受草甘膦的芸苔属植物与具有一个或多个另外的性状的芸苔属植物例如芥菜或油菜的杂交，从而导致耐受草甘膦并且具有一个或多个另外的性状的后代植物或种子。具 有期望的转基因性状的芸苔属植物在本领域是已知的，包括但不限于具有除草剂耐受性(例如，事件RT200、事件RT73、事件MS1、事件RF1、事件RF2、Topas 19/2、MS8、RF3、T45)的性状的芸苔属植物，杂交育种系统或繁育系统(fertilitysystem)(例如，事件MS1、事件MS8、事件RF1、事件RF2、事件Rf3)、昆虫控制、增加的产量、疾病抗性(例如，核盘菌属(ScleiOtinia)抗性、黑腿病抗性、甘蓝根肿病抗性、镰刀霉枯萎病(Fusarium Wilt)抗性)、改变的或改良的油的组成(例如，事件pCGN3828-212/86_18、事件pCGN3828-212/23)，它们全部描述于例如可公共获得的美国农业部(USDA)动植物卫生检疫处(Animal and Plant Health Inspection Service) (APHIS)非管制状态申请列表。具有期望的非转基因性状的芸苔属植物在本领域是已知的，包括但不限于性状:除草剂耐受性(例如，1471 (对于咪唑啉酮耐受性)、CLB-1 (对于咪唑啉酮耐受性)、TTC(对于三嗪耐受性))、病原体抗性、昆虫控制、增加的产量、疾病抗性(例如，核盘菌属抗生、黑腿病抗性、甘蓝根肿病抗性、镰刀霉枯萎病抗性)、改变的或改良的油的组成(包括低亚麻酸和/或高油酸)、改变的化学和/或营养组成、改变的蛋白质组成、冷耐受性、干旱耐受性、改变的成熟和/或开花以及其它改变的或改良的农艺学性质。还涉及对亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，同样地涉及营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可见于几篇参考文献之一，例如，Fehr，参见Breeding Methods for Cultivar Development,WiIcox J.编辑,American Society ofAgronomy, Madison WI (1987)中。本发明提供了来源于包含事件MON 88302的植物的植物部分。如本文中所用，“植物部分”是指由从包含事件MON 88302的植物衍生的材料组成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织、纤维及叶。植物部分可以是能活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。本发明提供了从包含事件MON 88302的植物衍生的商业产品。如本文中所用商业产品”是指由从包含事件MON 88302的植物、种子、植物细胞或植物部分衍生的材料组成的任何组合物或产品。商业产品可售予消费者并且可以是能活的或不能存活的。不能存活的商业产品包括但不限于不能存活的种子和谷物；经处理的种子、种子部分和植物部分；脱水的植物组织、冷冻的植物组织和经处理的植物组织；经处理用于陆生和/或水生动物消费的动物饲料的植物、油、谷物粗粉(meal)、面粉、薄片、麸、纤维和用于人消费的任何其它食品；和生物质及燃料 产品。能活的商业产品包括但不限于种子和植物细胞。因此包含事件MON 88302的植物可用于制造通常从芸苔属植物获得的任何商业产品。从包含事件MON88302的植物衍生的任何此类商业产品可包含至少可检测量的相应于事件MON 88302的特异性和独特的DNA，并且特别地可包含可检测量的包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少40个连续核苷酸的多核苷酸。可使用检测多核苷酸分子的任何标准方法，包括本文中公开的检测方法。如果在商业产品中存在任何可检测量的SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2，那么商业产品在本发明的范围内。因此本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织及叶)以及商业产品尤其对于生长植物以产生用于农业目的的包含事件MON88302的种子和/或植物部分、产生用于植物育种和研究目的的包含事件MON 88302的后代是有用的，可与用于工业和研究应用的微生物学技术一起使用和售予消费者。本发明提供了用于控制田地中的杂草的方法。提供了用于控制田地中杂草的方法，其由在田地中种植包含事件MON 88302的植物和为了控制田地中的杂草对田地施用至少一个除草上有效的剂量的草甘膦(而不损伤包含MON 88302的植物)组成。还提供了用于控制田地中的杂草的另一种方法，其由如下步骤组成:给田地施用至少一个除草上有效的剂量的草甘膦，随后在田地中种植包含事件MON 88302的作物。可单独地或组合地使用本发明的方法。草甘膦的施用可以在种植前(即，在种植包含事件MON 88302的种子之前的任何时间，包括但不限于约种植前14天至约种植前I天或与播种包含事件MON 88302的种子同时)、出苗前(即，在种植包含事件MON 88302的种之后和在包含事件MON 88302的植物出苗之前的任何时间)和/或出苗后(即，在包含事件MON 88302的植物出苗后的任何时间)进行。在实施本发明的方法中，可在生长季节中使用草甘膦的多次施用，例如两次施用(例如种植前施用和出苗后施用或出苗前施用和出苗后施用)或三次施用(例如，种植前施用、出苗前施用和出苗后施用)。在生长季节中施用的总草甘膦因此可包括一个或多个季节内施用，其中多次季节内施用的总和加起来产生施用的总草甘膦。如本文中所用，有效地控制杂草生长的草甘膦的量，即在田地中用作作物内(in-crop)施用以控制田地中杂草生长的草甘膦的除草上有效的剂量，应当由在整个生长季节中在总共约0.125磅草甘膦每英亩与约6.4磅草甘膦每英亩之间的范围组成。例如，用于在田间用作作物内施用的草甘膦的除草上有效的剂量在整个生长季节可以为总共至少约0.125、约0.5、约1.0、约1.6、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约6.4磅每英亩。提供了用于产生包含转基因事件MON 88302的耐受除草剂植物的方法。此类方法中使用的转基因植物对于转基因可以是纯合的或杂合的。通过此类方法产生的后代植物可以是品种或杂种植物；可从由植物产生的种子和/或从由利用包含事件MON 88302的植物的花粉授精的植物产生的包含事件MON 88302的种子生长而来；以及对于转基因可以是纯合的或杂合的。随后可将后代植物自花受粉以产生植物的纯育品系，即对于转基因是纯合的植物，或可选择地将后代植物异型杂交，例如与另一种无关植物交配以产生品种或杂种种子或植物。
可通过将包含事件MON 88302的含有包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的序列的多核苷酸分子的植物与另一种植物有性杂交并从而产生种子(随后将所述种子生长成后代植物)来产生耐受草甘膦除草剂的施用的植物。随后可利用草甘膦除草剂处理此类后代植物以选择耐受草甘膦除草剂的后代植物。或者，可使用诊断方法分析此类后代植物以选择包含事件MON 88302DNA的后代植物。杂交中使用的其它植物可以耐受或可以不耐受草甘膦除草剂以及可以为或可以不为转基因的。所产生的后代植物和/或种子可以为品种或杂种种子。在实施本方法中，可通过人工干预，例如:通过人手工收集一种植物的花粉和将该花粉与第二种植物的花柱(style)或柱头接触；通过人手工和/或人行动除去、破坏或覆盖植物的雄蕊或花药(例如，通过人工干预或通过施用化学杀配子剂)以便防止天然自花受粉并且使得必将发生异花受粉以使受精发生；通过在进行“定向受粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，通过在果园或田间放置蜂箱或通过用传粉昆虫笼框植物(cagingplants));通过人工打开或除去花的部分以允许外来花粉置于花柱或柱头上或接触花柱或柱头；通过选择性放置植物(例如，有意地在传粉距离之内种植植物)；和/或通过施用化学药品以促成开花或促进感受性(柱头对花粉的)来完成或促成将一种植物与另一种植物的有性杂交即异花受粉的步骤。耐受草甘膦除草剂的施用的植物可通过将包含事件MON 88302 (包含含有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的序列的多核苷酸分子)的植物自交和从而产生种子(随后将所述种子生长成后代植物)来产生。随后可用草甘膦除草剂处理这些后代植物以选择耐受草甘膦除草剂的后代植物。或者，可使用诊断方法分析此类后代植物以选择包含事件MON 88302DNA的后代植物。在实施本方法中,可通过人工干预,例如:通过人手工收集植物的花粉和将该花粉与相同植物的花柱或柱头接触，和随后任选地阻止植物的进一步受粉；通过人手工和/或人行动除去、破坏或覆盖其它附近植物的雄蕊或花药(例如，通过去雄或通过施用化学杀配子剂)以便防止天然异花受粉并且使得必将发生自花受粉以使受精发生；通过在进行“定向受粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，通过用传粉昆虫笼框单独的植物)；通过人工操作花或其部分以允许自花受粉；通过选择性放置植物(例如，有意地在传粉距离之外种植植物)；和/或通过施用化学药品以促成开花或促进感受性(柱头对花粉的)来完成或促成将一种植物与其自身有性杂交即自花受粉或自交的步骤。由此类方法包括的和通过使用此类方法产生的后代植物和种子与其它植物截然不同，例如因为所述后代植物和种子:是重组的并且通过人工干预产生；为耐受草甘膦除草剂的；包含至少一个由本发明的转基因DNA组成的等位基因；和/或包含可检测量的选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的多核苷酸序列。种子可选自单株后代植物，并且只要种子包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，其就可在本发明的范围内。在实施本发明中，可将两种不同的转基因植物杂交以产生包含两个独立地分离的异源基因的杂种后代。适当的后代的自交可产生对于两个基因都是纯合的植物。还涉及对亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，同样地涉及营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其它方法的描述可见于几个参考文献之一例如aFehr，参见Breeding Methodsfor Cultivar Development 中，Wilcox J.编辑,American Society of Agronomy,MadisonWI (1987)中。用于本文中公开的方法的植物和种子还可包含一种或多种另外的转基因。这样的转基因可以是编码赋予期望的性状的蛋白质或RNA分子的任何核苷酸序列，所述期望的性状包括但不限于增强的昆虫抗性、增加的水分利用效率、增加的产量性能、增强的抗旱性、增强的种子质量、改良的营养质量和/或增强的除草剂耐受性)，其中相对于缺乏这样的另外的转基因的植物测量期望的性状。因此本发明的方法尤其对于控制田地中杂草同时生长植物以产生用于农业或研究目的的包含事件MON 88302的种子和/植物部分，选择用于植物育种或研究目的的包含事件MON 88302的后代，和产生包含事件MON 88302的后代植物和种子是有用的。可评估本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织及叶)和商业产品的DNA组成、基因表达和/或蛋白质表达。这样的评估可通过使用标准方法例如PCR、northern印迹、southern分析、western印迹、免疫沉淀和ELISA或通过使用本文中提供的检测法和/或检测试剂盒来进行。提供了检测对于事件MON 88302是特异性的材料在样品中的存在的方法。一种方法由检测对于包含事件MON 88302的细胞、组织或植物是特异性的DNA和来源于所述细胞、组织或植物的DNA的存在组成 。方法提供了待与引物对接触的模板DNA样品，所述引物对能够在经历适合于热扩增的条件时从事件MON 88302DNA产生扩增子，特别地包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2或其互补序列的至少40个连续核苷酸的扩增子。扩增子从来源于事件MON 88302的模板DNA分子产生，只要模板DNA分子结合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的特异性和独特的核苷酸序列。扩增子可以为单链或双链DNA或RNA，这取决于被选择用于产生扩增子的聚合酶。该方法提供了检测在任何这样的热扩增反应中产生的扩增子分子，和确认相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互补序列的核苷酸在扩增子的序列中的存在。扩增子中相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互补序列的核苷酸的检测是事件MON 88302特异性DNA和从而包含事件MON 88302的生物材料在样品中的存在的确定和/或诊断。提供了用于检测相应于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的DNA分子在由来源于植物或植物组织的材料组成的样品中的存在的另一种方法。方法由如下步骤组成:(i)从植物或从一组不同的植物提取DNA样品，(ii)将DNA样品与显示SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的至少40个连续核苷酸的DNA探针分子接触，(iii)允许探针和DNA样品在严格杂交条件下杂交，和随后(iv)检测探针与靶DNA样品之间的杂交事件。杂交组合物的检测被诊断为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4(视具体情况而定)在DNA样品中的存在。杂交的不存在为转基因事件在样品中的不存在的替代性诊断。或者，确定特定植物包含相应于SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的序列或其互补序列之任一或两者为确定植物包含至少一个相应于事件MON 88302的等位基因。因此可能通过任何公知的核酸检测方法例如聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交检测本发明的核酸分子的存在。事件特异性PCR测定例如由Taverniers等人(J.Agric.Food Chem.,53 =3041-3052,2005)进行了论述，其中显示了转基因玉蜀黍品系Btll、Btl76和GA21以及转基因事件RT73的事件特异性跟踪系统。在本研究中，基于每一个事件的基因组/转基因接合处的序列设计事件特异性引物和探针。转基因植物事件特异性 DNA 检测法已在美国专利 N0.6，893，826 ;6，825，400 ;6，740, 488 ;6，733,974 ；6，689，880 ;6，900，014 和 6，818，807 中进行了描述。提供了 DNA检测试剂盒。一种类型的试剂盒包括至少一种具有足够长度的SEQ IDN0:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的连续核苷酸(以用作对于检测来源于转基因事件MON88302的DNA在样品中的存在是特异性的DNA引物或探针)的DNA分子。利用试剂盒检测的DNA分子包含SEQ ID NO:1所示的序列的至少40个连续核苷酸。或者,试剂盒可包括至少一种具有足够长度的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的连续核苷酸(以用作对于检测来源于转基因事件MON 88302的DNA在样品中的存在是特异性的DNA引物或探针)的DNA分子。待利用试剂盒检测的DNA分子包SEQ ID NO:2中所示的至少40个连续核苷酸。备选试剂盒使用其中将靶DNA样品与上述引物对接触，随后进行足以产生包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少40个连续核苷酸的扩增子的核酸扩增反应的方法。扩增子的检测和确定SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的不少于40个连续核苷酸或其互补序列在扩增子的序列中的存在被诊断为事件MON 88302特异性DNA在DNA样品的存在。提供了足以用作DNA探针的DNA分子，其对于确定、检测或对于诊断对于事件MON88302 DNA是特异性和独特的DNA在样品中的存在或甚至不存在是有用的。DNA分子包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少40个连续核苷酸，或SEQ ID NO:2或其互补序列的至少40个连续核苷酸。可利用本领域已知的多种核酸扩增法(包括热扩增法)的任一方法实现核酸扩增。可通过使用来源于本文中提供的序列的引物，然后进行扩增子或克隆的DNA的标准DNA测序来验证(和必要时校正)来自事件MON 88302 (包含事件MON 88302的代表性种子样品以ATCC PTA-10955保藏)的异源DNA插入物、接合序列或侧翼序列。可利用多种技术检测由此类方法产生的扩增子。一种这样的方法为遗传位点分析(Genetic Bit Analysis) (Nikiforov,等人Nucleic Acid Res.22:4167-4175,1994),其中设计了与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在热扩增目标区域(使用插入的序列中的一个引物和相邻侧翼基因组序列中的一个引物)后，可将单链扩增子与固定的寡核苷酸杂交，并将其用作模板、使用DNA聚合酶和对于预期的下一个碱基是特异性的标记的ddNTP进行单碱基延伸反应。读出可以是基于荧光或ELISA的。归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，荧光或其它信号的检测表示插入物/侧翼序列的存在。
另一个方法为由Winge (Innov.Pharma.Tech.00:18-24, 2000)描述的焦憐酸测序技术。在该方法中，设计与相邻基因组DNA和插入DNA接合处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目标区域(一个引物在插入的序列中以及一个引物在侧翼基因组序列中)的单链扩增子杂交，在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和萤光素存在的情况下进行温育。分别单独地添加ddNTP，掺入导致被测量的光信号。归因于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸，光信号表示转基因插入物/侧翼序列的存在。由Chen,等人，(Genome Res.9:492-498,1999)描述的突光偏振为可用于检测扩增子的方法。通过使用该方法，设计与基因侧翼序列和插入的DNA接合处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目标区域(一个引物在插入的DNA中并且一个引物在侧翼基因组DNA序列中)的单链扩增子杂交，并且在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在的情况下进行温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入可使用荧光计测量为偏振的改变。归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，偏振的改变表示转基因插入物/侧翼序列的存在。通过使用由制造商提供的说明书，TAQMAN (PE Applied Biosystems, FosterCity, CA)也可用于检测和/或定量DNA序列的存在。简而言之，设计与基因组侧翼序列和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸探针。在耐热聚合酶和dNTP存在的情况下，循环FRET探针和扩增引物(一个引物在插入物DNA序列中并且一个引物在侧翼基因组序列中)。FRET探针的杂交导致荧光部分的切割和释放，与FRET探针上的猝灭部分分离。归因于成功扩增和杂交，突光信号表不侧翼/转基因插入序列的存在。已描述了分子信标在序列检测中的用途，如Tyangi等人(Nature Biotech.14:303-308,1996)中所描述的。简而言之,设计与侧翼基因组序列和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸。RRET探针的独特结构导致其包含使荧光与猝灭部分保持紧密靠近的二级结构。在耐热聚合酶和dNTP存在的情况下循环FRET探针和扩增引物(一个引物在插入DNA物序列中并且一个引物在侧翼基因组序列中)。在成功的扩增后，FRET探针对靶序列的杂交导致探针二级结构的消除以及荧光部分与猝灭部分的空间分离，从而导致荧光信号的产生。归因于成功的扩增和杂交而，突光信号`表不侧翼/转基因插入物序列的存在。其它描述的方法例如微流体学(microfluidics)(美国专利公布N0.2006068398、美国专利N0.6，544，734)提供了分离和扩增DNA样品的方法和装置。用于检测和测量特异性DNA分子的光学染料(W0/05017181)。包括用于检测结合特异性DNA分子并且随后可被检测的DNA分子或纳米珠粒的电子传感器的纳米管装置(W0/06024023)。可使用本文中公开的组合物和DNA检测领域内公知的方法来开发DNA检测试剂盒。试剂盒用于鉴定样品中的事件MON 88302并且可被用于培养包含适当的事件DNA的植物的方法。试剂盒可包含与SEQ ID NO:1-6或其片段或互补序列相似或互补的DNA引物或探针。本发明的试剂盒和检测方法因而尤其对于鉴定事件MON 88302事件，选择包含事件MON 88302的植物品种或杂种，检测来源于事件MON 88302的DNA在样品中的存在，和监测样品的事件MON 88302的存在或不存在或包含事件MON 88302的植物、植物部分或商业产品是有用的。下列实施例被包括用来举例说明本发明的某些优选实施方案的实例。本领域技术人员应当理解，下列实施例中公开的技术代表本发明人已发现非常适合于本发明的实施，从而被认为构成用于其实施的优选模式的实例的方法。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解可在不背离本发明的精神和范围的情况下在公开的特定实施方案中进行许多改变，并且获得类似或相似的结果。
实施例实施例1:欧洲油菜的转化和MON 88302事件的选择本实施例描述了如何产生转基因事件和如何选择事件MON 88302。通过利用图1中举例说明的转基因DNA进行欧洲油菜细胞的农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化来产生转基因事件MON 88302，所述转基因的DNA序列示于SEQ ID NO:5。提供为SEQ ID NO:5的转基因插入物为包含嵌合启动子的表达盒，其如下部分组成:来源于玄参花叶病毒的35S增强子(E-FMV.35S)的增强子分子，该增强子分子有效地联接于来源于拟南芥Tsfl基因的启动子分子(P-At.Tsfl)，所述启动子分子有效地联接于来源于拟南芥Tsfl基因的前导序列分子(L-At.Tsfl);所述前导序列分子有效地联接于来自拟南芥Tsfl基因(1-At.Tsfl)的内含子序列；所述内含子序列有效地联接于编码叶绿体转运肽的DNA分子(CTP2，拟南芥EPSPS);编码叶绿体转运肽的DNA分子有效地联接于编码抗草甘膦EPSPS的DNA分子(CP4-syn);所述编码抗草甘膦EPSPS的DNA分子有效地联接于来源于豌豆基因的3’UTRDNA 分子(T-RbcS2, E9)。首先使用农杆菌属介导的转化，利用5个表达盒之一各自转化来自欧洲油菜的外植体。随后在含有草甘膦的培养基上选择转化的细胞，将存活的细胞再生成植物。产生超过23，000个外植体，从所述外植体产生224个总的个体RO事件，并将其用于随后的筛选(表I)。表1:欧洲油菜的转化和MON 88302事件的选择
权利要求
1.一种分子，其包含:a.具有选自SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和SEQ ID NO:8的序列的多核苷酸分子； b.具有与SEQID NO:6具有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸分子；或 c.具有与(a)或(b)互补的序列的多核苷酸分子。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子来源于事件MON88302，包含事件MON 88302事件的种子的代表性样品已于ATCC登录号PTA-10955下保藏。
3.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子包含在芸苔属植物、植物细胞、种子、后代植物、植物部分或商业产品中。
4.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子为从来源于事件MON88302的DNA的模板分子产生的扩增子。
5.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子被诊断为事件MON88302的存在。
6.一种诊断事件88302的存在的多核苷酸探针，其中所述多核苷酸探针具有充分长度以结合包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸分子，并且其中所述多核苷酸探针在严格杂交条件下与包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的DNA分子杂交，并且在严格杂交条件下不与不包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA分子杂交。
7.一种用于检测来源于事件MON 88302的DNA分子在DNA样品中的存在的方法，所述方法包括: a.将DNA样品与根据权利要求6所述的多核苷酸探针接触； b.将所述样品和所述多核苷酸探针经历严格杂交条件；和 c.检测所述多核苷酸探针对所述DNA分子的杂交 其中所述杂交的检测诊断所述来源于事件MON 88302的DNA分子在所述DNA样品中的存在。
8.对由第一 DNA分子和与所述第一 DNA分子不同的第二 DNA分子组成的DNA分子，其中所述DNA分子包含具有拥有充分长度的SEQ ID NO:6的连续核苷酸或其互补序列的核苷酸序列的多核苷酸分子，以用作当与来源于事件MON 88302的模板一起用于扩增反应中时产生诊断样品中的事件MON 88302 DNA的扩增子的DNA引物。
9.根据权利要求8所述的DNA分子对，其中所述扩增子包含选自SEQID NO:1和SEQID NO: 2的核苷酸序列。
10.一种检测来源于事件MON 88302的DNA分子在DNA样品中的存在的方法，所述方法包括: a.将DNA样品与根据权利要求8所述的DNA分子对接触； b.进行足以产生包含具有SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的至少40个连续核苷酸的多核苷酸分子的扩增子的扩增反应；和 c.检测所述扩增子， 其中所述扩增子的检测被诊断为所述来源事件MON 88302的DNA分子在所述DNA样品中的存在。
11.一种包括至少一种多核苷酸分子的DNA检测试剂盒，所述多核苷酸分子包含具有充分长度的SEQ ID NO:6的连续核苷酸和其互补序列，以用作对于检测来源于事件MON88302的DNA的存在是特异性的DNA引物或多核苷酸探针，其中所述DNA的检测被诊断为所述事件MON 88302 DNA在样品中的存在。
12.一种包含多核苷酸分子的植物、种子、细胞或其植物部分，所述多核苷酸分子具有选自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的植物、种子、细胞或其植物部分，其中所述植物、种子、细胞或其植物部分耐受草甘膦除草剂处理。
14.根据权利要求12所述的植物、种子、细胞或其植物部分，其基因组，当在DNA扩增法中测试时，产生诊断事件MON 88302的扩增子。
15.根据权利要求12所述的植物部分，其中所述植物部分选自花粉、胚珠、豆荚、花、根组织、茎组织或叶组织。
16.一种包含事件MON 88302的植物、种子、细胞或其植物部分，包含事件MON 88302的种子的代表性样品已于ATCC登录号PTA-10955下被保藏。
17.根据权利要求16所述的植物、种子、细胞或其植物部分，其中所述植物、种子、细胞或其植物部分耐受草甘膦除草剂处理。
18.根据权利要求16所述的植物或种子，其中所述植物或种子为具有至少一个来源于事件MON 88302的亲本的杂种。
19.一种当在DNA扩增法中测试时能够产生诊断事件MON 88302的扩增子的种子、植物或其部分，其中所述扩增 子包含具有选自SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的序列的 DNA 分子。
20.一种来源于事件MON 88302的无生命植物材料，所述事件MON 88302包含选自SEQID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的 DNA分子。
21.一种包含多核苷酸分子的微生物，所述多核苷酸分子具有选自SEQ ID NO:U SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的核苷酸序列。
22.根据权利要求21所述的微生物，其中所述微生物为植物细胞。
23.一种来源于包含事件MON 88302的植物、种子、细胞或其植物部分的商业产品。
24.根据权利要求23所述的商业产品，其中所述商业产品包含具有选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的核苷酸序列的DNA分子。
25.根据权利要求23所述的商业产品，其中所述商业产品选自完整或经加工的种子、动物饲料、油、谷物粗粉、面粉、薄片、麸、生物质和燃料产品。
26.一种用于控制包括包含事件MON 88302的植物的田地中杂草的方法，所述方法包括利用有效地控制所述田地中的杂草生长的量的草甘膦处理田地而不损伤所述包含事件MON 88302的植物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述有效地控制杂草的生长的草甘膦的量为约0.125磅至约6.4磅每英亩。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述有效地控制杂草的生长的草甘膦的量为约.1.6磅每英亩。
29.根据权利要求26所述的方法，其中在所述包含事件MON88302的植物的6叶期后对田地进行所述处理。
30.一种产生耐受草甘膦除草剂的施用的芸苔属植物的方法，包括: a.将耐受草甘膦的包含事件MON88302的芸苔属植物与第二芸苔属植物杂交，从而产生种子； b.生长所述种子以产生多个后代植物； c.选择包含事件MON88302的后代植物。
31.根据权利要求30所述 的方法，其中所述选择后代植物包括用草甘膦处理所述后代植物和选择耐受草甘膦的后代植物。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述选择后代植物包括鉴定包含具有选自SEQID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的核苷酸序列的DNA分子的后代植物。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二芸苔属植物不存在对草甘膦除草剂的耐受性。
34.一种产生耐受草甘膦除草剂的施用的芸苔属植物的方法，包括: a.将耐受草甘膦的包含事件MON88302的事件芸苔属植物自交，从而产生种子； b.生长所述种子以产生多个后代植物； c.选择包含事件MON88302的后代植物。
35.一种测定事件MON 88302植物或种子的接合性的方法，包括: a.将包含DNA的样品与包含SEQID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID N0:14的引物组接触，所述引物组当与来自事件MON 88302的基因组DNA—起用于核酸扩增反应时，产生被诊断为事件MON 88302的第一扩增子； b.进行核酸扩增反应，从而产生所述第一扩增子； c.检测所述第一扩增子； d.将包含DNA的所述样品与所述引物组接触，所述引物组，当与来自植物的基因组DNA一起用于核酸扩增反应时，产生第二扩增子，所述第二扩增子包含与鉴定为事件MON 88302的转基因插入的基因组区域同源的自体基因组DNA ； e.进行核酸扩增反应，从而产生所述第二扩增子； f.检测所述第二扩增子；和 g.比较样品中的所述第一和第二扩增子，其中两个扩增子的存在表示所述样品对于所述转基因插入是杂合的。
全文摘要
本发明提供了包含转基因事件MON 88302的植物，所述植物显示对草甘膦除草剂的耐受性。本发明还提供了与所述事件相关的种子、植物部分、细胞、商业产品和方法。本发明还提供了对于事件是独特的并且通过将转基因DNA插入欧洲油菜植物的基因组产生的DNA分子。
文档编号C12N15/82GK103096712SQ201180027546
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月1日 优先权日2010年6月4日
发明者A·J·布朗, J·F·伯恩, R·H·科尔, J·H·克劳利, J·A·米克洛斯, R·C·里普利, S·赛弗特-希金斯, 谢嘉丽 申请人:孟山都技术公司