专利名称：均匀处理粘壁细胞的方法和装置的制作方法
均匀处理粘壁细胞的方法和装置
背景技术：
本发明涉及一种对粘壁细胞施加至少一个电场的方法。在该方法中，采用至少三个电极时，通过对至少两个有源电极施加电压产生所述的电场。本发明还涉及一种包括至少三个电极的装置，所述电极通过至少一个开关装置与至少有一个电压源相连。本发明也涉及一种与至少两个电极组件接触的装置，所述电极组件各自包括至少两个电极，所述至少两个电极组件具有不同的尺寸，并且所述装置具有可用来与电极组件的电极形成电接触的接触元件。技术现状对活细胞施加电场或电压脉冲的方式称作电穿孔或电转染，多年以来就将其应用于各种不同状态下的细胞。悬浮在缓冲液中的单细胞在培养皿中的粘壁状态下通常粘附在塑料容器的底部上，体内细胞通常在组织复合体中嵌入到细胞外基质之中。进行电穿孔时原则上可通过瞬间电流从与细胞相配的缓冲液或者细胞培养基中将外源分子送入细胞之中，通过电压脉冲或者由此产生的电场和电流的作用使得外源分子可以透过细胞膜。细胞悬液通常位于比色皿之中，这是一种细窄开口的容器，其样品室在侧壁中有两个相对而置、用于施加电压的近似平行的电极。生物活性分子首先通过细胞膜中瞬间出现的“微孔”进入细胞质之中，这些分子有时已经可以在细胞质中发挥其待研究的功能，然后在一定条件下也会进入细胞核之中。除此之外，瞬间施加强电场也就是电流密度很高的短电压脉冲，还可以融合细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或者囊泡。当采用这种电融合方式时，例如首先通过不均匀的交变电场使得细胞膜紧密接触，随后施加电场脉冲使得部分膜相互作用最终融合。可以将与电穿孔装置类似的装置用于电融合。除此之外，通过施加电场也能以改变其特性的方式刺激活细胞。例如WO 2005/056788 Al公开了一种用于电穿孔的方法，按照该方法所述，细胞在位于两个平行电极表面之间的微孔膜上生长。US-A-5134070描述了细胞电穿孔的应用和装置，细胞在作为电极的导电表面上生长。从上方使用一个板状的对应电极遮盖培养皿，同时形成一个可以放电的间隙。WO 2008/104086 Al还公开了一种装置，细胞可在所述装置中共面的电极表面上生长。通过细胞上方的细胞培养基形成电极之间的电接触，两个电极区域被隔离屏障分开，尽管如此该屏障仍然允许在电极之间有一个电解液桥，这些电极例如可以由铟锡氧化物构成，铟锡氧化物是透明半导体，可实现对细胞进行显微分析。WO 2009/131972 Al公开了一种对附着生长在圆形盘状板上的细胞进行分析的装置。该装置具有两个相互平行的电极，其中一个电极位于外侧圆柱体的凹面上，另一个电极位于内侧圆柱体的凸面上。US 2009/0305380 Al还公开了一种对固定在固定面上的细胞进行电穿孔的装置，通过在固定面上方的表面上紧密相邻的电极对阵列产生施加给细胞的电场。通过镀在表面上的迹线 构成电极。电极对的两个电极适当紧密相邻排列，从而在两个电极之间极小的间距之内不可能有一个以上的细胞。
BTX公司销售一种名为PetriPulser 极性交替变化的电极板组件，可以将其垂直放在培养皿中附着生长的细胞上。电极浸没在培养上清液之中，各个电极板之间的间隙均充满培养基。该组件的主要缺点在于，大部分电流会经由细胞上方的无细胞培养基流出。电场仅仅在边缘电场中作用于细胞所在的容器底部上，因此要提供不必要的高电流。PH值变化和高电流必然还会引起很高的细胞死亡率。除此之外，还必须针对持久的电压脉冲将电源设计得非常大，才能提供如此大的电流以及电荷量和功率。此外所涂覆的量还必须适合于电穿孔，并且必须含有充分高浓度的待转染底物，因此底物用量也相当高。这种已知装置的另一个主要缺点在于，自由电极尖端正上方区域中的电场极小。这会导致实际上无法转染或融合位于该区域中的细胞，从而使得利用这种已知装置执行的方法的效率总体上很小。本发明的描述本发明的任务在于，提供能够利用电场有效均匀处理粘壁细胞的一种方法和一种装置。
采用上述类型的一种方法即可解决本发明的任务。按照所述的方法，当施加电压产生第一电场时至少两 个电极是有源电极，并且至少产生一个第二电场，当施加电压时两个之前的有源电极中至少一个是无电位电极。例如当第一电极正在对细胞施加电压脉冲时，要么是正极或者负极，则该电极下方的电场极小，使得位于该电极正下方的细胞无法得到充分电处理。因此按照本发明所述产生第二电场，所述的第一电极现在没有电位(无源)，也就是通过对至少两个其它电极施加电压产生电场。这样即可在第二电压脉冲过程中也对所述第一电极下方的区域施加电场。因此采用本发明所述的方法可保证同样也能对第一电压脉冲过程中处在电场之外的细胞进行充分电处理。利用本发明所述的方法能将电场很小的区域的数量减少到最低程度，从而能够优化相应方法的效率，例如优化电转染或电融合的效率。本发明所述的方法有助于保证利用电场有效均匀处理粘壁细胞。适宜产生适当多的电场，使得产生第一电场时的所有有源电极在产生其它电场的过程中至少有一次为无电位电极。以这种方式可保证电极下方不存在没有对其施加过电场的区域。因此在这种最佳情况下可利用电场均匀处理所有细胞，从而能够保证相应方法的效率，例如电转染或电融合的效率。按照本发明的另一种有益实施方式所述，每个电场通过至少一个电压脉冲、适宜通过至少两个电压脉冲产生。按照本发明所述，可以通过一个单一的电压脉冲或者至少两个或多个顺序或者相互过渡的(部分)电压脉冲产生电场。可以通过一个或多个电荷储存器尤其是一个电容或至少两个电容的放电来产生次脉冲。产生电场的每个电压脉冲适宜是由一个短高压脉冲和一个电压较小的长脉冲组成的双脉冲。例如可通过两个电容依次放电的方式产生这种双脉冲，两个次脉冲可以连续相互过渡。例如第一电荷储存装置可以具有至少IOiI F、适宜至少50 i! F、尤其至少IOOiiF的电容，并且/或者放电起始电压为10 1500V，适宜为20 1200V，尤其为50 1000V，脉冲持续时间为2 y s 40ms，适宜为
5u s 20ms,尤其为IOii s 10ms。在第一电荷储存装置放电结束之前、同时或者之后,可以使得例如电容至少为IOOii F、适宜至少为500 ii F、尤其至少为IOOOii F的第二电荷储存装置放电，放电起始电压例如为10 240V、适宜为20 200V、尤其适宜为50 150V，脉冲持续时间例如为Ims 500ms、适宜为2ms 350ms、尤其为4ms 250ms。
可以同时或者代之以通过至少一个电压脉冲产生至少两个电场，两个电压脉冲之间的时间间隔至少为500ms，适宜至少为ls，尤其为I 10s。令人惊奇的是，本发明所述产生电场的电压脉冲(非次脉冲！)之间的时间间隔必须比较大，才能使得细胞的存活率保持稳定并且/或者能够保证该方法的高效率。每一个电压脉冲也可以如同以上所述由多个、至少两个次脉冲组成。按照本发明的另一种有益实施方式所述，采用多个反应腔，在其中分别对粘壁细胞施加电场，将其中一个反应腔中用于产生两个电场的两个电压脉冲之间的时间间隔用于在至少另一个反应腔中产生至少一个电场。如果必须在极短的时间之内、尤其以高流量方法处理很多试样，则本发明的这种实施方式特别有益。如上所述，用于在相应反应腔中产生电场的各个电压脉冲相互间可以有比较大的时间间隔。当处理很多试样时，这就会导致非常长的处理时间。因此按 照本发明所述，适宜针对待处理的不同反应腔交错产生各个电压脉冲，从而能够将其中一个反应腔中产生两个电场之间的等待时间用于在至少另一个反应腔中产生至少一个电场。例如当处理“24孔”细胞培养板的所有反应腔时，以这种方式就能显著缩短总处理时间。除此之外，采用该方式还可减小由于处理之前和/或者之后的培养时间不同而在不同反应腔内的试样之间产生偏差的危险。如果在较长的时间内对例如“24孔”板的各个反应腔中的细胞依次进行处理，则首批反应腔内的试样将会在处理之后经过较长的培养时间，而最后处理的试样则必须在处理之前经更长的培养时间。这可能会影响各个反应腔内的处理效率，最终可能会导致各个试样的结果不一样。而交错处理不同的反应腔则与此相反，由于将不同的培养时间减小到最低程度，从而使得结果或效率更加均匀，并且因此而能够更好重现。此外按照本发明的特别有益的实施方式所述，电极和粘壁细胞相隔一定距离，并且将细胞和电极之间的距离调整到根据经验确定的值。宜适当调整所述的距离，从而分别优化有源电极之间以及无电位电极下方的电场强度。可以看出，电场线的密度随距离变大而减小，因此容器底面上的有效电场随距离变大而变小。原则上可以通过提高所施加的电压、也就是通过提高电流密度来抵消这一效应。当然这将会增大技术费用和闪电放电的风险。太小的距离同样也不合理，因为已经很小的底面不平度可能会导致电场不均匀，因此会导致结果不可重现。就此而言还应考虑道，有源电极之间的场强随距离变大而减小，而无电位电极下方的场强则在平均距离时达到最大值，也就是从该最大值开始当距离变小或变大时减小。因此必须根据反应条件适当调整电极与细胞的距离，使得无电位电极下方的场强尽可能接近于最大值，同时在有源电极之间达到尽可能高的值。必须针对不同的条件，例如反应腔的几何形状、所用缓冲液的类型、电极的形状和大小以及电参数，凭经验确定最佳距离。还可以采用上述类型的一种装置、尤其是用于执行本发明所述方法的一种装置来解决本发明的任务，所述装置中至少五个电极通过四个开关装置与至少一个电压源相连，至少两个电极通过共同的开关装置与电压源相连。这种配置特别有益，可以将所有电极要么接通或者切断(无电位)。在本发明所述的装置中，将电极编组并且限制开关装置的数量，即可将设备和设计费用减小到最低程度，从而可提供成本低廉而且不易发生故障的装置。本发明所述的装置与上述方法相结合就能利用电场有效均匀处理粘壁细胞，可以用少量开关装置迅速可靠地在有源电极和无电位电极之间切换。
按照本发明所述装置的特别有益的实施方式所述，采用各自通过两个共用开关装置与电压源相连的两组电极。以这种方式可以通过仅仅四个开关装置控制数量比较大的电极，也就是可以将两个电极组分别接通或切断(无电位)。每个组可包括至少两个电极，适宜包括至少三个电极，特别适宜包括至少四个电极。在本发明的有益实施方式中，总共可以采用至少七个、适宜采用9 21个电极。例如可以按照本发明所述，使用第一组包括8个电极、第二组包括9个电极的配置。按照本发明所述装置的有益实施方式所述，采用可插入到至少一个反应腔之中的电极，也就是例如可以适当布置电极并且将其设计成整体，从而可以从上方将其置于细胞培养皿之中，且必要时可以将其浸没到其中的细胞培养基之中。然后比较适宜将电极布置在附着于反应腔底部的细胞的上方。所述反应腔适宜是多孔板的一部分，从而可以在类似条件下使用本发明所述的装置处理很多试样。所述开关装置可以是例如功率半导体，尤其是IGBT或者M0SFET，或者是机电式装置，适宜是继电器。也可以采用一种用来与上述类型的至少两个电极组件接触的装置解决本发明的任务，在所述装置中适当布置至少一个接触元件，从而可以与不同电极组件的电极接触。宜适当布置接触元件，使其占据一定的位置，具有不同尺寸的至少两个电极组件的电极可以在该位置上接触。例如可以将用于不同规格细胞培养板、例如用于“6孔”和“24孔”和/或者“ 12孔”和“48孔”板的电极组件与数量明显较少的接触元件接触，从而减少设备方面的制造花费。在任何情况下采用本发明所述的装置均可节省材料，并且总体上可将制造费用减小到最低程度。按照本发明所述装置的特别有益的实施方式所述，适当布置至少一部分接触元件，从而可以接触不同电极组件的至少50%、适宜至少60%、尤其至少70%电极。在最佳情况下用于不同板规格的接触元件阵列相同。即使因为电极组件的几何形状而无法做到，也可以利用本发明所述的装置，分别利 用共同的接触元件与不同电极组件的至少一半电极接触。因此总体上可以明显减少设备侧所需接触元件的数量。适宜将接触元件和/或者电极布置在一个平面中并且可以围绕轴线旋转，从而只要转动该阵列，例如旋转180°，从而能够使得适合于相应反应腔的接触元件阵列和/或者相应的电极组件进入正确的位置之中。本发明也涉及本发明所述的装置在对粘壁细胞施加至少一个电场方面的应用，尤其可用于对粘壁细胞进行电穿孔和电融合。以下将根据附图所示的实施例对本发明进行详细解释。附图简要说明附
图1为具有三个电极的本发明示例性电极组件的示意侧视图。附图2为具有四个电极的本发明示例性的另一种电极组件的示意侧视图。附图3为本发明示例性电极组件的示例性实施方式的底面透视图。附图4为附图3所示电极组件的另一个透视图，在该图中可以看见电极的内侧部分和接触元件。附图5为附图3所示电极组件的顶面透视图。附图6为附图3 5所示电极组件的纵剖面。
附图7以柱状图表现出在三种不同强度的电压脉冲条件下转染效率随本发明所述电极组件与附着在培养面上的细胞之间距离变化的关系(X轴:距离[mm]，y轴:转染效率[% ]，A-5 =弱电压脉冲，K-19 =中等强度电压脉冲，AX-19 =强电压脉冲)。附图8为相对电场强度随电极与容器底部之间距离变化的关系图，以500 y m距离的场强为参考(X轴:距离[um]，y轴:相对转染效率[% ])。图中所示为有源电极之间的相对场强(灰色菱形)和无电位(无源)电极下方的相对场强(黑色菱形)。附图9为只有有源电极(A)以及有源电极和无电位电极⑶都有时的细胞培养皿中的电场模拟。附图10为使用对荧光蛋白MAXGFP (Lonza)编码的质粒进行转染(使用Nudeofector 进行电穿孔,Lonza)的细胞的突光显微图像。上图:A)所有电极均在电转染过程中激活。中图:B)条件同上，但是只有一半电极在转染过程中激活，另一半无电位。下图:C)再次对相同的细胞施加第二电场(电压脉冲)，但是在第二次脉冲时交换了有源电极和无源电极，也就是第一次脉冲下的所有有源电极均在第二次脉冲时无电位，而之前的无源电极则在第二次脉冲时激活。附图11为按照本发明所述的方法使用对荧光蛋白MAXGFP (Lonza)编码的质粒进行转染的细胞(使用Nudeofector 进行电穿孔，Lonza)的突光显微图像。上图:A)两个电压脉冲之间的间隔< 0.5s。下图:B)两个电压脉冲之间的间隔为2.0s。附图12为具有17个电极的电极组件的电气连接示意图，左侧示意图(A)中的有源电极在右侧示意图⑶中没有电位(无源)。无色电极:无电位(无源)。虚线电极:激活(高电压)。黑色电极:激活(接地)。附图13为具有四个开关柜装置的本发明所述装置的电极的电气连接示意图。无色电极:无电位(无源)。虚线电极:激活(高电压)。黑色电极:激活(接地)。
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附图14为具有·接触点的电极组件的示意俯视图。这些电极组件具有不同的尺寸，可用于具有3个较大反应腔(“6孔”规格)和12个较小反应腔(“24孔”规格)的细胞
培养板。附图15为具有接触点的电极组件的示意俯视图。电极组件下方的数字I 17各自表示相应电极所在的电极栅线。A)具有不同尺寸的电极组件的接触点的首选布置示例，可用于具有至少一个较大反应腔和至少四个较小反应腔的细胞培养板。B)具有不同尺寸的电极组件的接触点的另一个首选布置示例，可用于具有至少一个较大反应腔和至少四个较小反应腔的细胞培养板，已按照生产工艺优化了接触点或接触元件的布置。附图16为具有不同尺寸的电极组件的接触点的另一种首选布置示例的示意俯视图，可用于具有3个较大反应腔(“6孔”规格)和12个较小反应腔(“24孔”规格)的细胞培养板，其中的接触元件可以围绕轴线旋转。示例和优选实施方式的说明附图1表示本发明所述的一种电极组件1，包括单个共面的电极2、3、4，这些电极伸入到容器7的内腔6之中。容器7包括细胞可以在上面附着生长的底面8 (粘壁细胞)。内腔6通常充满了一种液体，例如细胞培养基或者适合于细胞的另一种溶液。使用电绝缘材料5完全填充电极2、3、4之间的空间，从而当对电极2、3、4施加电压时没有电流会流经电极2、3、4之间的空间。在本发明所述的电极组件I中，全部电流均流过电极2、3、4和底面8之间的空间，因此当使用非持续性电压源时(例如电容)电压以比较缓慢的速度下降，用于处理细胞的随时间变化的电场强度比较高。这样一方面可以将脉冲产生装置的尺寸设计得十分紧凑，另一方面可以避免电解引起的很大的电荷量而在液体中出现较强烈的PH
值变化。在这里所示的实施例中，通过绝缘材料5将共面电极2、3、4分隔开，使得电极2、3、4的导电表面仅仅向下(朝向底面8或者附着在底面上的细胞)暴露并且与周围环境形成电接触。在共面电极2、3、4的相对而置的表面9之间的区域中，或者至少在平行电极之间可供液体通过的区域中，可以通过绝缘材料5的全部延伸范围将电场或电流集中限制到所需的作用区域。此外还特别有利于将电场集中在靶细胞区域或者将电流限制到作用区域，即使现在使用共面电极2、3、4，从而可在电极2、3、4与底面8之间的靶向区域中实现随时间不变并且更加稳定的场强和电流密度。适用的绝缘材料例如是常见的热塑性塑料构成的板材或者注塑体，例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯或者聚碳酸酯。采用本发明所述的结构，可以防止电流漏过电极2、3、4的共面部分的各个相对表面9，从而可产生电流水平下降较少的电压脉冲。视含有待处理细胞的培养皿底部的面积而定，例如每次反应可以给本发明所述的组件提供能量/电流较小的一次脉冲放电或者多次顺序脉冲放电，以便限制每次放电所需的功率。例如可以使用一种电极/绝缘体三明治结构，其中的电极极性交替变化。这种组件中的电场实际上不在活性电极正下方的区域中，因此不会作用于活性电极下方的细胞。这些区域均处在(电极的)电导体附近，因此在有效电场之外。作用区域也就是具有充分电场的区域仅仅是极性相反的电极之间的区域。为了将没有对其施加电场的电极下方区域减小到最低程度，例如可以将电极设计得尽可能薄(例如50 μ m)，使得电极/绝缘体组合而成的电极组件的作用区域覆盖生长了细胞的底面的较大区域。但是减小电极厚度在许多情况下既不合理也没有技术可行性，使得这种措施的效果有限。因此按照本发明所述，可在第一电压脉冲之后利用至少另一个电压脉冲在电极2、
3、4和底面8之间的空间中产生至少另一个电 场。按照本发明所述，之前的有源电极中至少一个没有电位，从而使得另一个或第二个电场也可在现在的无源电极下方区域中作用于细胞。在附图1所示的实施例中，如果中间的电极3在第一个电压脉冲时就已激活，即要么与电压(+)或者与地线(_)相连，那么该电极3就会在第二个电压脉冲时保持无电位(无源)，从而也可以对电极3下方的区域施加充分的电场，该区域同时位于第二电压脉冲期间的有源电极2和4之间。以这种方式可以比较均匀地覆盖底面8，从而可以对较大数量的细胞进行有效电处理。附图2表示具有四个电极11、12、13、14的本发明示例性装置的另一种电极组件
10。电极组件10基本上相当于附图1所示的电极组件1，区别在于该电极组件包括四个共面的电极11、12、13、14，这些电极伸入到容器17的内腔16之中。容器17同样包括细胞可以在上面附着生长的底面18(粘壁细胞)。也使用电绝缘材料15完全填充电极11、12、13、14之间的空间，从而当对电极11、12、13、14施加电压时没有电流会流经电极11、12、13、14之间的空间。按照本发明所述，例如可以适当控制电极11、12、13、14，使得电极11和13在第一个电压脉冲时激活，而电极12和14则没有电位。当随后出现第二个电压脉冲时，之前的有源电极11和13没有电位，而电极12和14则激活。这种方式有利于对外侧电极11和14之间的整个区域、尤其也可对内侧电极12和13下方的区域施加充分的电场。这样即可对整个底面18或者附着在底面上的细胞进行均匀电处理(参见附图10和11)。附图3为本发明电极组件20的示例性实施方式的底面透视图。电极组件20包括七个电极21，以下还将参考附图5和7对其进行详细描述。将电极21布置在基本上呈圆柱形的支架22之中。支架22包括一个主体23和一个布置在主体23上端的边缘区域24，所述边缘区域34的外径大于主体23的外径，使得边缘区域24越过主体23向外伸出。电极21大部分布置在主体23之内，并且其下端面33在支架22的底面25上裸露，使其与周围环境接触。各个电极21各自通过绝缘材料26相互分开，所述绝缘材料26在本实施方式中完全填充各个电极21之间的空间。当电极21浸没在导电液体之中后，电极21的相对而置的表面之间的绝缘材料26可保证在对电极施加电压时没有电流会漏经电极21之间的空间。绝缘材料26可在对电极21施加电压时使得电流经由电极21的端面33流过并且在支架22的底面下方形成电场。由于没有值得一提的电流流经电极21之间的空间，因此当电容或者另一种非持续性电压源放电时，电压仅仅缓慢下降，从而使得随时间更加稳定的电流流过，可在放电时间范围内产生对于大多数生物方法(例如电转染)而言充分强的电场。电极组件20尤其可用于至少部分填充了液体的容器之中，例如反应容器、细胞培养皿或者多孔板中的“孔”，所述容器具有活细胞可以在上面生长的底面。通常使用一种合适的溶液(例如细胞培养基)或者使用一种适合于进行所需电处理的溶液覆盖容器底面上的粘壁细胞，电极组件20可在插入到容器之中时至少排挤一部分液体。为了使得电极21的端面33不直接放在容器底面和细胞上，支架22的底面25具有四个间隔物27，这些间隔物可保证电极21与容器底面之间有充分的距离。将距离调整到凭经验确定的值，即可优化本发明所述方法的效率(参见附图7和8)。附图4为附图3所示电极组件20的透视图，在该图中可以看见电极21的内侧部分。在该图中可明显看出，电极21基本上呈板状，电极板的厚度朝向支架22的底面25逐渐减小，因此与容器中的液体接触的电极21的裸露端面33大大窄于布置在主体23之内的电极21部分。这种方式的好处在于，可将相应电极21下方由于电场太弱而无法在其中对细胞进行有效电处理的区域减小。电极21在对面一端则具有较大的厚度，因为必须在这里有效接触这些电极来形成充分的电接触。在本实施方式中，通过插入在电极21的加厚区域29之中的针状接触元件28形成与所用电压源的电接触。利用适当的接触装置使得接触元件28在其位于区域29对面的一端与电压源相连。所述电压源可以是例如能够可控输出电压脉冲的一个或多个电容。通过接触元件28将所产生的电压脉冲传输给电极21，从而在电极21的底面也就是在支架22的底面25下方产生电场，由于电极21之间有绝缘材料26，因此该电场被限制或者集中到细胞与电极21朝向细胞的一侧之间的空间。适宜以注塑方法制作本发明所述的电极组件20，首先将接触元件28置于一个适当的注射成型模具之中，然后用一种热塑性聚合物进行嵌件注塑。在第二个步骤中注入一种导电聚合物形成电极21。电极也可以由一种金属、适宜由铝构成。按照该实施方式所述，首先将金属电极置于注塑成型模具之中，然后用电绝缘聚合物进行嵌件注塑。按照该实施方式所述，金属电极适宜具有向上伸出的突出部分，可以通过这些突出部分与电极形成电接触。 附图5为附图3所示本发明所述电极组件20的顶面30的透视图，这里可明显看出接触元件28向上从主体23向外伸出。接触元件28除了裸露的末端31和对面浸没到导电聚合物之中的末端之外完全被主体23的电绝缘材料包围。可以利用适当的装置通过裸露的末端31将接触元件28与电压源相连。附图6为附图3 5所示电极组件20的纵剖面，在该图中可明显看出，电极21的直径朝向主体23的底面25逐渐变细，从而将电极21下方仅仅形成不充分电场的面积33减小。在电极21的另一端是厚度加大的区域29，将接触元件28放入或者注入该区域之中。这种特别有益的实施方式可保证接触元件28与电极21之间形成充分的电接触，从而保证从电压源将电压脉冲有效传输至电极21。当电极组件20被插入到充满了液体且活细胞附着在其表面上的容器之中时，间隔物27可保证在电极21的底面与待处理的细胞之间形成最佳距离。由于电极21的相对而置的表面32之间的空间完全填充了绝缘材料26，因此没有液体进入电极21的表面32之间，从而使得电流不会经由电极21的表面32之间的区域流出。以这种方式可在对电极21施加电压时将电场集中在电极21朝向细胞的一侧，并且将其限制或集中到细胞与电极21之间的空间。这样就能非常有效地处理细胞，而且能量消耗比较少。本发明的另一个优点在于，电极组件20可在插入到容器之中时排挤一部分液体，因为电极21之间没有间隙。正因为如此，仅需少量液体即可充满容器，因此可以节省用于处理的溶液和物质，从而能够降低费用。附图7为不同强度电压脉冲下转染效率与电极与待处理细胞之间的关系。这里所述的转染表示利用电压脉冲使得核酸分子(这里是DNA)进入到(这里是动物)活细胞之中。当电压较高时(AX-19)，转染效率与电极和细胞之间的距离的关系很小；当电压脉冲较弱时(A-5)，电极与细胞之间的距离越大，则转染效率变得越大。中等强度的电压脉冲(K-19)则在中等大小的距离表现出最佳值。因此明显可见，电极与细胞之间的距离随电压脉冲强度对转染效率有着或多或少的影响。因此为了优化转染效率，可按照本发明所述将距离调整到凭经验确定的值，例如适当确定附图3 6所示电极组件20的间隔物27的尺寸。
附图8所示为电极和容器底部之间的区域中相对电场强度随电极与容器底部距离变化的关系。所述场强涉及距离为500 μ m时的场强，也就是针对该距离将两条曲线的场强设为等于100%。有源电极之间和无源电极下方的场强特性相反，也就是有源电极之间的场强随距离变小而变大，而无源电极下方的场强则趋向于零。有源电极之间的场强随距离变大而减小，而无源电极下方的场强则继续增大。绝对来看，有源电极之间的场强随距离变大而减小，而无电位电极下方的场强则在平均距离时达到最大值，也就是从该最大值开始当距离变小或变大时减小。因此按照本发明所述，根据反应条件适当调整电极与细胞的距离，使得无电位电极下方的场强尽可能接近于最大值，同时在有源电极之间达到尽可能高的值。附图9为只有有源电极(上图)以及有源电极和无电位电极都有时(下图)的细胞培养皿中的电场模拟。已知用于产生电场的方法和装置均有缺点:有源电极正下方的电场极小，不足以对该区域中的细胞进行电处理，这里很明显，将无电位(无源)电极纳入到本发明所述的方法之中就能以比较均匀而且更有效的方式处理细胞。这里所示的电极组件40包括四个电极41、42、43、44，这些电极可在施加电压时在电极41、42、43、44与细胞培养皿的底面46之间的空间45中产生电场。在本图中通过电场线的密度模拟该电场的强度。较暗的区域表示较高的场强，较亮的区域表示较小的场强。在图A)中所有电极41、42、43、44均激活。这种情况下只有电极41、42、43、44之间及其自由端上的场强很高(暗区)。而电极41、42、43、44下方区域中的空间45中的场强则很小(亮区)，从而只能以不均匀的方式对底面46上的待处理细胞施加充分的电场。因此按照本发明所述，如图B)中所示，在本实施例中首先仅仅对两个电极41和43施加电压,而另外两个电极42和44则没有电位(无源)。这样就会在无源电极42和44下方的区域中使得较强的、仅仅被无源电极42和44略微削弱的电场作用于附着在底面46上的细胞。现在如果将电压施加给之前的无源电极42和44产生另一个电压脉冲并且之前的有源电极41和43没有电位，也会有较强的电场作用于电极41和43下方的区域中。因此可以利用本发明所述的方法，使用充分的电场均匀处理附着在底面46上的细胞。附图10为按照现有技术(A)和利用本发明所述方法(B和C)转染后的荧光标记细胞的显微图像。对图A)中所示的细胞进行电转染时，所有电极均激活，也就是所有电极要么与高压或者与地线相连。已利用质粒成功转染的细胞发出荧光，因此可以明显辨认出来。但是在图A)中表现出转染细胞的菌苔中的空位(“阴影”)，这些空位相当于有源电极下方的区域。在这些区域中，电场强度不足以成功转染细胞。对图B)中所示的细胞进行电转染时，只有一半电极激活，另一半没有电位。与图A)所示的转染相比，这里成功转染的细胞总体上较少 ，但是也存在较少的空位，或者具有很小转染效率的区域之间的距离比较大。转染效率在这里首先比较小，因为有源电极之间的距离比较大，整个培养面积范围内的电场总体上比较弱。按照本发明的方法所述，随后再次对相同的细胞施加第二电场(电压脉冲)，在第二次脉冲时交换有源电极和无源电极，也就是第一次脉冲下的所有有源电极均在第二次脉冲时无电位，而之前的无源电极则在第二次脉冲时激活。现在不再看见空位，也就是包括电极下方区域在内的所有区域均表现出很高的转染率(图C)。本发明所述的方法可实现在整个培养面积范围内非常均匀地处理细胞。与图A)(现有技术)和C)(本发明所述的方法)的对比尤其说明了本发明所述方法明显由于已知的方法。附图11为按照本发明所述方法进行转染后的荧光细胞的显微图像，改变了两个电压脉冲之间的间隔。如果间隔非常小(A:< 0.5秒)，就会使得转染效率意外减小。该效应随着电压脉冲之间的间隔变大而消失(B:2.0秒)。为了避免拖长总处理时间，应当优化这些间隔，也就是对其进行调整使之适合于例如电气参数、试样体积、缓冲液或培养基、温度和/或者细胞类型之类的处理条件。适宜将两个电压脉冲之间的时间间隔用来首先依次对多个试样施加第一电压脉冲，然后依次对这些试样施加第二电压脉冲。以这种特别有利的方式交错施加电压脉冲，就能在处理多个试样时将总处理时间减小到最低程度。执行本发明所述方法时要么必须如附图12所示对电极进行逐个寻址，或者如附图13所示进行分组寻址。适宜通过例如IGBT、MOSFET之类的开关装置或者通过能够进入开路或闭路状态的继电器来执行该操作。开关装置在开路状态下不传导电流，从而使得所连接的电极被隔离并且没有电位(无源)。开关装置在闭路状态下传导电流，使得电流可以流过所连接的电极，这些电极均具有电位(正或负)并且起到阳极或阴极作用，可将其称作有源电极。附图12表示用于执行本发明所述方法的电路装置47，具有十七个电极48、49、56、
57。共面排列的电极48、49、56、57各自通过开关装置50、51、54、55要么与电压源52相连或者与地线53相连。图A)所示为电路装置47在产生第一电场时的状态。与开路的开关装置50相连的部分电极48、49在这里首先是无电位的电极49。与闭路的开关装置51相连的部分电极48、49是有源电极48，这些电极最终产生用于处理细胞的第一电场。有源电极48正上方电场极小，从而无法充分处理这些区域中的细胞。图B)所示为电路装置47在产生第二电场时的状态。在产生第一电场时开路的开关装置54在这里闭路，而在产生第一电场时闭路的开关装置55则在这里开路。这就会使得在产生第一电场时没有电位的电极56在产生第二电场时是产生第二电场的有源电极。在产生第一电场时激活的电极57在产生第二电场时没有电位。由于产生第一电场时的有源电极56均布置在两个无电位的电极57之间，因此有源电极56产生的第二电场作用于有源电极56下方的区域。因此也可通过第二电场对第一电场持续过程中没有得到充分处理的细胞进行电处理，从而总体上均匀处理所有细胞。附图13表示用四个开关装置59、60、61、62执行本发明所述方法的本发明示例性装置58。开关装置59和60均连接在电压源上，开关装置61和62则与地线相连。装置58的电极(有源电极63:虚线或黑色，无电位的电极64:无色)被分为两组，其中一组与开关装置59和61相连，另一组与开关装置60和62相连。按照这里所示的实施方式，十七个电极63、64通过仅仅四个开关装置59、60、61、62与电压源相连。在这里所示的状态下，有源电极63 (第一组)通过闭路的开关装置59和61与电压源或地线相连，从而当对有源电极63时间电压时在有源电极63之间产生第一电场。由于开关装置60和62开路，因此与其连接的电极64(第二组)在该状态下保持无电位或者无源。为了使得在这里所示的状态下仅仅受到极小电场作用的有源电极63下方区域中的细胞也能得到充分处理，按照本发明所述将开关装置59和61打开并且闭合开关装置60和62，以产生第二电场。通过这种简单的操作使得在这里所示状态下是有源电极63的第一组电极变成无电位的电极，而在这里所示状态下是无电位电极64的第二组电极则变为有源并且产生第二电场。该第二电场可保证第一组电极63下方的区域也能得到充分的电处理，从而总体上保证均匀有效地处理细胞。本发明所述装置58的优点在于使用四个开关装置即可，可以控制这些开关在两组电极之间迅速切换。可以将每一组电极切换到有源或者无源，可在同一时间始终同时切换某一组的所有电极(有源或者无电位)。采用将电极63、64编组的方式，本发明所述的装置58与例如附图12所示的电 路装置47相比明显减少了开关装置的数量，从而显著降低了设备费用和装置58的故障倾向。附图14为具有不同尺寸的电极组件56、66的不意图,可用于具有3个较大培养腔(“6孔”规格，电极组件65)和12个较小培养腔(“24孔”规格，电极组件66)的细胞培养板。为了节省材料并且减小制造成本，按照本发明所述选择将共同的接触点用于具有不同尺寸的电极组件。这样就能以有益的方式显著减少设备方面用来与电极接触的接触元件的数量。这里所示用于细胞培养板的容纳区67具有一个可容纳三个较大培养腔的区段和一个可容纳十二个较小培养腔的区段。较大的培养腔配有相应尺寸的电极组件65，例如包括十七个电极68的浸没式电极形式的电极组件，可用于对其中的细胞进行电处理。较小的培养腔配有相应尺寸的电极组件66,例如同样也包括七个电极69的浸没式电极形式的电极组件，可用于对其中的细胞进行电处理。例如可以将电极组件整合在细胞配有板的盖子之中，或者将其置于相应接触装置的支承单元上。这种接触装置也包括布置在容纳区67相应区段中的接触元件，以下将根据电极的接触点对其进行详细解释。每个电极68、69各自对应于一个接触点70，在该接触点上可以利用接触元件与相应的电极68、69接触，从而能够形成与电压源(例如电容)的电接触。用来与这种“混合式”细胞培养板67接触的装置需要3x17+12x7 = 135个接触元件。用来与两种不同规格例如“6孔”规格(6个培养腔，可用于具有17个电极的对电极组件)和“24孔”规格(24个培养腔，各有7个电极)的细胞培养板接触的装置甚至需要6x17+24x7 = 270个接触元件。由于为了通过例如用弹簧压紧的接触元件来形成充分的电接触而需要一些补偿制造误差的压紧力，因此接触点或相应接触元件的数量应当尽可能少。一根标准弹簧的压紧力约为0.4N,若有270个接触元件，总体上将会产生大约108N(约IOKg)的机械力。因此要尽量减少接触元件的数量，从而减小技术和设备费用。附图15表示具有不同尺寸的电极组件74、75的接触点71、72、73的示例性优选布置结构，所述电极组件可用于具有至少一个较大反应腔(电极组件74)和至少四个较小反应腔(电极组件75)的细胞培养板。按照本发明所述，可以适当布置大多数接触点71、72、73，使其同样适用于不同的规格，也就是这些接触点不仅可用于较大电极组件74的电极，而且也可用于较小电极组件75的电极。按照这里所示的规格，较大电极组件74中仅仅中间的电极(栅线编号8 10)和最外侧电极(栅线编号I和17)占据着无法使其与较小电极组件75的电极的相应位置一致的位置。可以使用其余的接触点(栅线编号2 7和11 16)作为两种规格电极组件的相应电极的接触点(图A)。然后必须将较小电极组件75中尚未列入的电极对应于各自的接触点。图B)中所示为本发明所述的接触点72、73的布置结构，已按照生产工艺优化了这些接触点。十七个黑色的接触点72代表可以与较大电极组件74(例如“6孔规格”)的所有电极和较小电极组件75(例如“24孔规格”)的一些电极接触的部位。十六个以阴影线表示的接触点73代表只能与较小电极组件75的剩余电极接触的部位。如果在细胞培养板的容纳区之内适当布置6x(17+16) =198个接触元件，总体上用一个装置就能与这两种规格接触。这与附图14所示的示例(270个接触元件)相比明显减少了接触元件的数量，从而可大大减少设备费用。附图16表示具有不同尺寸的电极组件的接触点的另一种优选布置示例，可用于具有3个较大反应腔(“6孔”规格)和12个较小反应腔(“24孔”规格)的细胞培养板。在这种特别有益的实施方式中，电极和/或者用来与接触点接触的相应接触元件可以围绕轴线旋转，所述轴线适宜是垂直 于细胞培养板平面的轴线。这样就能以更加有益的方式将设备方面所需的接触元件进一步减少到3x (17+16) =99个接触元件。除此之外,该实施方式还可以处理其它规格的细胞培养板，例如“12和48孔”规格。在这里所示的实施例中，细胞培养板的容纳区76可以是例如用来与电极组件77、78接触的装置的一部分。该装置具有这里没有绘出的接触元件，这些接触元件可以与电极组件77、78的电极形成电接触。容纳区76包括两个区段79、80，在其范围之内分别在相当于电极组件77、78的接触点81、82的装置中提供接触元件。黑色的接触点81代表可以与较大电极组件77( “6孔规格”)的所有电极和较小电极组件78( “24孔规格”)的一些电极接触的部位。以阴影线表示的接触点82代表只能与较小电极组件78的剩余电极接触的部位。将容纳区76的第一区段79用于电极组件77、78或者相应尺寸的细胞培养腔(“孔”)，在该实施方式中，可以使得较大的电极组件77( “6孔”规格)和较小的电极组件78( “24孔”规格)形成电接触。如果将具有6或24个培养腔的细胞培养板或者具有3个较大培养腔和12个较小培养腔的混合板放入容纳区76之中，就可以在第一区段79中首先与一半相应的电极组件形成电接触。在培养腔中成功处理细胞之后，将板水平旋转180°，使得培养腔的另一半处在第一区段79之中并且可以形成电接触。当然也可以转动具有接触元件的装置而不是板，以便处理板的另一半。容纳区76的第二区段80要么空闲并且保持不使用，或者用于具有其它尺寸的电极组件或相应尺寸的细胞培养腔(“孔”)，例如“12孔”规格较大的电极组件和“48孔”规格较小的电极组件。利用本发明所述用来与至少两个电极组件接触的装置，能够以有益的方式与至少两个、适宜四个不同的板规格形成电接触。附图标记清单I电极组件2 电极3 电极4 电极5绝缘材料6 内腔7 容器8 底面9 表面 10电极组件11 电极12 电极13 电极14 电极15绝缘材料16 内腔17 容器18 底面20电极组件21 电极22 支架23 主体24边缘区25 底面26绝缘材料27间隔物28接触元件29 区域30 顶面31 末端
32 表面33 端面34电极组件35 电极36 电极37 电极38 电极39 室40电极组件41 电极42 电极43 电极44 电极45 室
46 底面47电极组件48有源电极49无电位电极50开路的开关装置51闭路的开关装置52高电压53 地线54闭路的开关装置55开路的开关装置56有源电极57无电位电极58 装置59开关装置60开关装置61开关装置62开关装置63有源电极64无电位电极65电极组件66电极组件67容纳区68 电极69 电极70接触点
71接触点72接触点73接触点74电极组件75电极组件76容纳区 77电极组件 78电极组件 79区段
80区 段 81接触点 82接触点
权利要求
1.对粘壁细胞施加至少一个电场的方法，其中，采用至少三个电极(48，49，56，57，63，64)时，通过对至少两个有源电极(48，56，63)施加电压产生所述的电场，其特征在于，当施加电压产生第一电场时至少两个电极是有源电极(48，63)，并且产生至少一个第二电场，在施加电压时两个之前的有源电极(48，63)中至少一个是无电位电极(57，64)。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，产生适当多的电场使得产生第一电场时的所有有源电极(48，63)在产生其它电场的过程中至少有一次为无电位电极(57，64)。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，每个电场分别通过至少一个电压脉冲产生、适宜通过至少两个电压脉冲产生，并且/或者至少两个电场分别通过至少一个电压脉冲产生，其中电压脉冲之间的时间间隔至少为500ms，适宜至少为ls，尤其为I 10s。
4.根据权利要求I 3中任一项所述的方法，采用多个反应腔，在其中分别对粘壁细胞施加电场，将其中一个反应腔中用于产生两个电场的两个电压脉冲之间的时间间隔用于在至少另一个反应腔中产生至少一个电场。
5.根据权利要求I 4中任一项所述的方法，其特征在于，电极(48,49,56,57,63,64)和粘壁细胞相隔一定距离，并且将细胞与电极(48，49，56，57，63，64)之间的距离调整到凭经验确定的值。
6.尤其用于执行权利要求I 5中任一项所述方法的装置(58)，包括至少三个电极(63，64)，所述电极通过至少一个开关装置(59，60，61，62)与至少一个电压源相连，其特征在于，至少五个电极(63,64)通过四个开关装置(59,60,61,62)与至少一个电压源相连，至少两个电极(63，64)通过共同的开关装置(59，60，61，62)与电压源相连。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，采用各自通过两个共同的开关装置(59，60,61,62)与电压相连的两组电极(63,64) o
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，每组包括至少两个电极(63，64)。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的装置，其特征在于，总计采用至少七个、适宜9 21个电极(63，64)。
10.根据权利要求6 9中任一项所述的装置，其特征在于，电极(63，64)用于插入到至少一个反应腔之中。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，反应腔是多孔板的一部分。
12.用来与至少两个电极组件(65，66，74，75，77，78)接触的装置，所述电极组件各自包括至少两个电极出8，69)，所述至少两个电极组件(65，66，74，75，77，78)具有不同的尺寸，并且所述装置具有可用来与电极组件(65，66，74，75，77，78)的电极(68，69)形成电接触的接触元件，其特征在于，布置至少一个接触元件，使不同电极组件(65，66，74，75，77，78)的电极(68，69)能够分别接触。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，布置至少一部分接触元件，使得不同电极组件(65，66，74，75，77，78)的至少50%、适宜至少60%、尤其至少70%电极(68，69)能够分别接触。
14.根据权利要求12或13所述的装置，其特征在于，接触元件和/或者电极￠8,69)布置在一个平面之中并且可以围绕轴线旋转。
15.权利要求6 11或者12 14中任一项所述的装置在对粘壁细胞施加至少一个电场方面的应用，尤其对粘壁细胞进行电穿孔或者电融合。
全文摘要
本发明涉及一种对粘壁细胞施加至少一个电场的方法。在所述的方法中，采用至少三个电极63、64时，通过对至少两个有源电极63施加电压产生所述的电场，当施加电压产生第一电场时至少两个电极63、64是有源电极63，并且产生至少一个第二电场，在施加电压时两个之前的有源电极63中至少一个是无电位电极64。本发明还涉及一种包括至少三个电极63、64的装置58，所述电极通过至少一个开关装置59、60、61、62与至少一个电压源相连，至少五个电极63、64通过四个开关装置59、60、61、62与至少一个电压源相连，至少两个电极63、64通过共同的开关装置59、60、61、62与电压源相连。本发明所述的装置与上述方法相结合就能利用电场有效均匀处理粘壁细胞，可以用少量开关装置迅速可靠地在有源电极和无电位电极之间切换。
文档编号C12M3/00GK103237882SQ201180030236
公开日2013年8月7日 申请日期2011年6月21日 优先权日2010年6月22日
发明者T·科布利泽克, A·海因策, T·格莱斯纳, H·穆勒-哈特曼, A·维尔特 申请人:隆萨科隆有限公司