专利名称：结肠直肠癌的微rna标志物的制作方法
技术领域：
所公开的主题通常涉及结肠直肠癌的标志物和检测结肠直肠癌的方法。
背景技术：
已知在一些肿瘤中某些微RNA具有改变的表达。以下现有技术出版物是著名的Ahmed, et al. “Diagnostic MicroRNA Markers for Screening SporadicHumanColon Cancer and Active Ulcerative Colitis in Stool and Tissue (幾便和组织中用于筛查偶发性人结肠癌和活动性溃瘍性结肠炎的诊断用微RNA标志物)”Cancer Genomicsand Proteomics 6:281-296(2009)； 2007 年 I 月 3 日提交的 WO 2007/081470MICR0-RNA BASEDMETH0DS ANDCOMPOSITIONS FOR THE DIAGNOSIS ANDTREATMENT OF SOLID CANCERS (用于诊断和治疗实体癌的基于微RNA的方法和组合物)，Croce, et al.。发明概述在一个实施方案中，公开了对生物样品中的结肠直肠癌细胞进行诊断或提供预后的方法，所述方法包括检测所述生物样品中RNA序列存在的步骤，所述RNA序列在全序列长度上与选自由SEQ. ID. N0S: 1-7构成的组的序列至少有约98%相似性，其中所述RNA序列的存在指示所述样品中结肠直肠癌细胞的存在。在可选实施方案中，所述方法还可以包括将样品中所述序列的水平与对照中所述序列的水平进行比较。在可选实施方案中，所述在全序列长度上的相似性可以为至少约99%。在可选实施方案中，所述在全序列长度上的相似性可以为约100%。在可选实施方案中，所述方法还可以包括检测至少2个所述序列。在可选实施方案中，所述方法还可以包括检测至少4个所述序列。在可选实施方案中，所述生物样品可以是粪便样品。在可选实施方案中，所述组可以由SEQ. ID. NOS :4-7构成。在可选实施方案中，所述检测可以包括扩增所述序列。在可选实施方案中，公开了对生物样品中的结肠直肠癌进行诊断或提供预后的方法，所述方法包括检测所述样品中在高严紧性条件下与选自由SEQ. ID. N0S: 1-7构成的组的序列杂交的RNA序列，其中所述RNA序列的存在指示所述样品中结肠直肠癌细胞的存在。在可选实施方案中，所述方法可以包括将所述样品中所述序列的水平与对照中所述序列的水平进行比较。在可选实施方案中，所述方法还可以包括检测至少2个序列或可以包括检测至少4个所述序列。在可选实施方案中，所述样品可以是粪便样品。在可选实施方案中，所述组可以由SEQ. ID. NOS :4-7构成。在可选实施方案中，公开了用于对生物样品中的结肠直肠癌细胞进行诊断或提供预后的试剂盒，所述试剂盒包含
适于逆转录与SEQ. ID. NOS: 1_7中的任一项在至少15个连续碱基对上具有至少约98%相似性的RNA的引物。在试剂盒的可选实施方案中，在序列全长度上的序列相似性可以为约100%。在试剂盒的可选实施方案中，所述生物样品可以为粪便样品。在试剂盒的可选实施方案中，所述逆转录产生DNA序列，并且所述试剂盒还包含适于扩增所述逆转录的DNA序列的引物对。在可选实施方案中，公开了用于对生物样品中的结肠直肠癌进行诊断或提供预后的探针，所述探针包括选自SEQ. ID. N0S: 1-7的序列，其中所述序列在高严紧性条件下与所述样品中存在的RNA序列杂交，并且其中所述RNA序列的存在指示所述样品中结肠直肠癌 细胞的存在。附图简要描述图IA是来自对照和CRC受累个体的粪便中miR-221 (SEQ. ID. NO:2)丰度的图示。图IB是来自CRC患者和对照的粪便样品中miR-221 (SEQ. ID. NO:2)的ROC分析。图2A是来自对照和CRC受累个体的粪便中miR-135b(SEQ. ID. NO:2)丰度的图示。图2B是来自CRC患者和对照的粪便样品中miR-135b (SEQ. ID. NO: I)的ROC分析。图3A是来自对照和CRC受累个体的粪便中miR_18a(SEQ. ID. NO:3)丰度的图示。图3B是来自CRC患者和对照的粪便样品中miR_18a(SEQ. ID. NO:3)的ROC分析。图4A是来自对照和CRC受累个体的粪便中miR_19a(SEQ. ID. NO:4)丰度的图示。图4B是来自CRC患者和对照的粪便样品中miR_19a(SEQ. ID. NO:4)的ROC分析。图5A是来自对照和CRC受累个体的粪便中miR_223(SEQ. ID. NO:5)丰度的图示。图5B是来自CRC患者和对照的粪便样品中miR-223 (SEQ. ID. NO:5)的ROC分析。图6A是来自对照和CRC受累个体的粪便中miR_301a(SEQ. ID. NO:6)丰度的图示。图6B是来自CRC患者和对照的粪便样品中miR_301a(SEQ. ID. NO:6)的ROC分析。图7A是来自对照和CRC受累个体的粪便中miR-592(SEQ. ID. NO:7)丰度的图示。图7B是来自CRC患者和对照的粪便样品中miR-592 (SEQ. ID. NO:7)的ROC分析。图8显示了实施方案的一系列人miRNA序列。图9是实施方案中ROC分析和诊断分析的参数表。实施方案的详细描述术语在本公开中，以下术语具有如下所示的含义在本公开中，术语“或”通常的含义包括“和/或”，除非文中内容指明并非如此。在本公开中，术语“生物标志物”或“标志物”表示与疾病相关的诸如基因的物质或变量测量，所述物质或变量测量可以作为该疾病的指示物或预测物。生物标志物或标志物是参数，从中可以推知疾病的存在或风险，并且在实施方案中可以用于确定疾病的预后或提供疾病的检测。在本公开中，术语“核酸”、“核酸序列”等表示多核苷酸，其可以是gDNA、cDNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。该术语还包括肽核酸(PNA)，或任何化学上的DNA样或RNA样物质。“cDNA”是指由细胞中天然存在的mRNA制备而来的拷贝DNA。“gDNA”是指基因组DNA。以上的组合也是可能的(即，部分是gDNA且部分是cDNA的重组核酸)。
在本公开中，术语“微RNA”或“miRNA”或等同术语表示短的RNA序列，其长度可以是约15-30个核苷酸(或更长或更短)，并且可以是非编码的。在本公开中，术语“R0C”表示“受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic) ”,并且是指核酸分析的方法。ROC分析可以用于评估测试的诊断性能。ROC图是测试在不同截止值的灵敏性％和特异性％的图。ROC曲线可以用于区分2个样品组，例如具有特定特性的对照或正常样品和测试或实验样品。通常，2个样品中所见的分布会重叠，这使其成为确定它们之间是否存在真实差异的很好的工具。如果将ROC分析的区别阈值或特异性设高，则该测试不太可能产生假阳性，即不太可能错误地鉴定2个样品间的差异。然而，在这些情况下，该测试更可能遗漏样品间存在真实差异的情况，并因此更可能会鉴定不出某些病例。如果测试的灵敏性增加，则特异性会相应地下降。因此，如果使测试更敏感，则该测试更可能鉴定出患病人群中的大部分或全部，但是也会在更多未患病人群中鉴定出疾病。ROC曲线上的每个点代表灵敏性及其各自的特异性。可以基于ROC曲线选择截止值，从而鉴定出灵敏性和特异性均具有可接受的值的点，并且该点可以用于进行用于诊断 目的的测试。当使用者能够以本领域技术人员能容易理解的方式修改参数时，对于在本公开中所述的实例，选择每个阈值来获取均合理的灵敏性和特异性。但具体情况下，灵敏性和特异性都保持在约60%-90%，但是更低的和更高的值也是可能的。ROC的另一有用的特征是曲线下面积(AUC)值，其可以定量该测试区分不同的样品性质的总能力，在本情况下，可以定量该测试区分患有结肠直肠癌的个体和未患结肠直肠癌的个体的总能力。鉴定出真阳性几乎等于随机可能性的测试会产生面积为O. 5的ROC曲线。具有完美特异性和灵敏性的不产生假阳性和假阴性的测试的面积为I. 00。现实情况下，任何测试的面积都会在这两个值之间。在本文所用的一个应用中，可以基于CRC患者和对照个体的粪便样品中特定微RNA的检测结果来绘制ROC图，从而产生相应粪便miRNA测试在不同截止值下的灵敏性％和特异性％的图。本领域技术人员能够容易地理解和应用进行ROC分析的应用。使用统计学软件(Prism)基于癌症组和非癌症组的miRNA水平的输入数据生成ROC曲线。在本公开中，术语“严紧的杂交条件”和“高严紧性”是指探针与其靶标子序列杂交而不与其它序列杂交时所处于的条件，所述靶标子序列通常处于核酸的复合混合物中。严紧的条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会不同。较长的序列在较高的温度时特异性地杂交。核酸杂交的广泛指导见于Ti jssen, Techniques in Biochemistry andMolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes (生物化学和分子生物学技术-核酸探针的杂交)，"Overview of principles of hybridization and the strategyofnucleic acid assays (杂交原理和核酸测定策略的概述)〃(1993),并且会被本领域技术人员容易理解。通常，将严紧的条件选择为低于在限定的离子强度、pH下特定序列的热熔点(Tm)约5-10° C。Tm是平衡时与靶标互补的探针中的50%与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶序列是过量存在的，所以在Tni下，在平衡时，50%的探针被占据)。添加诸如甲酰胺的去稳定剂也可以实现严紧的条件。对于选择型杂交或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选为10倍于背景的杂交。示例性的严紧杂交条件可以如下50%甲酰胺，5父35(和1%505，42° C下孵育，或5XSSC，1%SDS，65° C下孵育，在65。(下0.2父55(和0.1%505中洗涤。对于在严紧的条件下不彼此杂交的核酸，如果它们编码的多肽是基本上相同的，则所述核酸仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码简并性产生核酸拷贝时，会发生这种情况。在这些情况下，所述核酸通常在中等严紧的杂交条件下杂交。示例性的“中等严紧的杂交条件”包括在37° C下40%甲酰胺、IM NaCl、1%SDS的缓冲液下杂交，和在37° C下IXSSC中洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域技术人员会容易地认识到，可选的杂交和洗涤条件可以用于提供相似的严紧性条件。用于确定杂交参数的其它指导可见于很多参考文献中，例如，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方法)，ed. Ausubel, et al。对于PCRJ^ 36° C的温度通常用于低严紧性扩增，但是根据引物长度，退火温度可以在约32° C和48° C之间变化。对于高严紧性PCR扩增，通常是约62° C的温度，但是根据引物长度和特异性，高严紧性退火温度可以为约50° C-约65° C。高和低严紧性扩增的通常的循环条件包括持续30秒-2分钟的90 ° C-95 ° C的变性期，持续30秒-2分钟的退火期，和持续1-2分钟的约72° C的延伸期。低和高严紧性扩增反应的方法和指导 是本领域公知的，并且见于，例如 Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide toMethodsand Applications (PCR 手册-方法和应用指南)，Academic Press, Inc. N. Y.。在本公开中，术语“基因表达”和“蛋白表达”表示并包括涉及样品中存在的基因转录本或蛋白的量的任何信息，以及关于基因、RNA或蛋白表达或积累或降解的速率的信息(例如，报告基因数据、核失控实验的数据、脉冲追踪数据等)。某些种类的数据可以视为与基因和蛋白表达都有关。例如，细胞中的蛋白水平反映蛋白水平以及转录水平，并且意图将这样的数据包括在短语“基因或蛋白表达信息”中。可以以每个细胞的量，相对于对照基因或蛋白的量，无单位测量等形式给出这样的信息；术语“信息”不应限制为任何特定表示手段，并且意图表示提供相关信息的任何表示。术语“表达水平”是指基因或蛋白表达数据中反映出的或从基因或蛋白表达数据中可推断出的量，无论该数据是关于基因转录本积累或蛋白积累或蛋白合成速率等在本公开中，术语“寡核苷酸”表示由2个或更多个核苷酸，优选多于3个核苷酸组成的分子。寡核苷酸的精确大小取决于很多因素，反过来，这些因素取决于寡核苷酸的最终功能和用途。在具体实施方案中，寡核苷酸的长度可以为约10个核苷酸-100个核苷酸或10和100之间的任何整数。在实施方案中，寡核苷酸的长度可以为约10-30个核苷酸，或长度可以为约20-25个核苷酸。在实施方案中，为了特异性，寡核苷酸的长度可以大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 个核苷酸。在某些实施方案中，短于这些长度的寡核苷酸可以是合适的。在本公开中，术语“引物”表示当置于能诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在核苷酸和诸如DNA或RNA聚合酶的诱发剂的存在下并且在合适的温度和pH下，能够作为合成起始点的寡核苷酸，无论它是纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长而在诱发剂的存在下能引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，为了诊断和预后应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少或多于约10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。确定引物合适长度中涉及的因素是本领域技术人员容易理解的。在本公开中，术语“引物对”表示与靶DNA分子相反链杂交至位于待扩增的核苷酸序列的侧翼的靶DNA的区的引物对。在本公开中，术语“引物位点”表示引物杂交的靶DNA的区域。在本公开中，所描述的和要求保护的核酸是指所有形式的核酸序列，包括但不限于如下所述的基因组核酸、前mRNA、mRNA、miRNA、cDNA、cRNA、多态性变体、等位基因、突变体和种间同系物
(I)在严紧的杂交条件下与公开的核酸序列或编码公开的氨基酸序列及其保守型修饰的变体的核酸序列特异性地杂交，(2)具有优选在至少约15、25、30、35、40、50、100或更多核苷酸的区上与参考核酸序列的核苷酸序列同一性大于约95%,优选大于约96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列。在本公开中，术语“生物样品”或“样品”包括诸如活检和尸检样品的组织的切片或样品，和为了组织学目的而获得的冷冻切片和样品，或任何这些样品的处理后形式。生物样品包括血液和血液组分或产物(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)，痰液或唾液，淋巴和舌组织，诸如原代培养物、外植体和转化的细胞的培养的细胞，粪便，尿液，胃活检组织等。生物样品通常获自真核生物，可以是哺乳动物，可以是灵长类并且可以是人类个体。为了使用可以通过任何常规步骤对生物样品进行处理和加工，所有的这些常规步骤是本领域技术人员能容易理解和进行的。在具体的可选实施方案中，可以使用多种方法、合适的试剂从粪便提取微RNA。在具体实施方案中，所述试剂可以包括以下任何试剂(均根据生产商或其他人描述或建议的方法使用)=TRIzol试剂(Invirogen，Carlsbad, CA，UCA)，TRIzol LS试剂(Invirogen, Carlsbad, CA, UCA)，miRNeasy 小型试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)，mirVana miRNA 分离试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, US), miRCURY RNA 分离试剂盒(Exiqon,Vedbaek,Denmark)。在具体实施方案中，可以使用适于从生物样品分离微RNA的任何可商购的试剂盒或试剂。在本公开中，术语“活检”是指为了诊断或预后评估而移除组织样品的过程，并且也指组织样本自身。本领域已知的的任何合适的活检技术可以用于本发明的诊断和预后方法。所用的活检技术取决于待评估的组织类型(例如，舌、结肠、前列腺、肾、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、血细胞、胃组织等)等因素。代表性的活检技术包括但不限于，切除活检、切口活检、针吸活检、手术活检和骨髓活检，并且可以包括结肠镜检查。多种活检技术是本领域技术人员公知的，他们需要进行很少的实验便可以从这些技术中选择并使用。在本公开中，术语“分尚的”核酸分子表不从通常与该分尚的核酸分子相关联的其它核酸分子中分尚出的核酸分子。因此，“分尚的”核酸分子包括但不限于这样的核酸分子其不具有在分离的核酸来源于的生物体的基因组中天然地位于该核酸的一个或两个末端侧翼的序列(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化而产生的cDNA或基因组DNA片段)。通常将这样的分离的核酸分子引入载体(例如，克隆载体或表达载体)，以便于操控或产生融合核酸分子。此外，分离的核酸分子可以包括基因工程的核酸分子，例如重组的或合成的核酸分子。存在于诸如核酸文库(例如cDNA或基因组文库)或含有限制性消化的基因组DNA的凝胶(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺)的一部分中的数百至数百万其它核酸分子中的核酸分子不被认为是分离的核酸。
在本公开中，“细胞”可以是分离的，可以被包含在细胞群体中，可以在培养物中，或可以被包含在活的个体中，并且可以是哺乳动物细胞，可以是人的细胞。同样，“组织”可以包括任何数目的细胞，并且可以被包含在活的个体中或可以从其中被分离出。在本公开中，“癌症”表示并包括任何恶性肿瘤(malignancy)、或恶性细胞分裂或恶性肿瘤(malignant tumour),或具有不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病状态，并且包括但不限于特征为不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病。在本公开中，术语“结肠癌”、“结肠直肠癌”和“CRC”具有相同的含义，并且表示结肠或直肠的癌症，并且包括具有结肠直肠癌特征的细胞。结肠直肠癌可以是，但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤和神经内分泌肿瘤，并且包括癌症前期细胞和细胞群体。
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在本公开中，术语“结肠癌细胞”或“结肠直肠癌细胞”或“CRC细胞”表示具有结肠癌或结肠直肠癌特征的细胞，并且包括癌症前期细胞。在本公开中，术语“癌症前期”表示处于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的细胞。这样的细胞可以表现出一种或多种具有癌细胞特征的表型性状。在本公开中，术语“纯化的”或“基本纯化的”或“提取的”，当用来指核酸或多肽时，表示从它们的天然环境中分离出的核酸或多肽，使得它们占给定样品中全部核酸或多肽或有机化学物的至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80、85、90或95%。本文中，可以通过SDS-PAGE和银染评估蛋白纯度。可以通过琼脂糖凝胶和EtBr染色评估核酸纯度。在本公开中，术语“检测”表示观察生物样品中的标志物或标志物改变(例如标志物甲基化状态的改变或核酸或蛋白序列的表达水平)的任何过程，无论实际上是否检测到标志物或标志物改变。换言之，探测样品的标志物或标志物改变的行为是“检测”，即使标志物被测定为不存在或低于灵敏度水平。检测可以是定量、半定量或非定量观察，并且可以基于与一个或多个对照样品的比较。应当理解，检测本文公开的结肠癌包括检测癌症前期细胞，所述癌症前期细胞开始发展为结肠癌细胞或将要发展为结肠癌细胞，或具有增加的发展为结肠癌细胞的倾向。检测结肠癌还可以包括检测可能的死亡概率或疾病条件的可能的预后。在本公开中，术语“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个肽或2个核酸分子之间的序列相似性。可以比较每个序列中的位置来测定“同源性”、“同一性”或“相似性”，为了比较的目的可以将所述序列进行比对。当比较的序列中的等同位置被相同碱基占据时，所述分子在该位置是相同的。同源性/相似性或同一性的百分比表达是指比较的序列所共享的位置上相同碱基数的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列共享小于40%同一'丨生,优选小于25%同一'丨生。在比较2个核酸序列时,残基的缺失或多余残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具体实施方案中，对于2个或更多序列或子序列，如果按照使用具有下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2. O序列比较算法进行测定或通过例如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))在线提供的手动比对和肉眼检查进行测定，当在比较窗或指定区上为最大对应性进行比较和比对时，如果它们的序列在规定的区上是约60%，或约65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的，可以认为是基本或显著同源的、相似的或同一的。该定义也涉及或可以用于测试序列的互补物。因此，在本文背景允许的程度下，例如，如果核苷酸序列可以预测为天然存在于DNA双链体中，或可以以互补链中的一条或两条的形式天然存在，则与特定靶序列或其变体互补的核苷酸序列自身被视为与靶序列“相似”，并且当涉及“相似的”核酸序列时，包括单链序列、其互补序列、双链的链复合物、能够编码相同或相似多肽产物的序列、以及上述任意一项的任何容许的变体。如果相似性必须限制为单一核酸链序列的分析，情况可以包括例如细胞中特定RNA序列或编码序列的表达的检测和定量。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在实施方案中，同一性或相似性可以是在长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、
21、22、23、24、25或更多氨基酸或核苷酸的区上，或在长度为多于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或多于约100个氨基酸或核苷酸的区上。在本公开中，术语“扩增”表示由核酸的一个特定基因座得到多个拷贝的过程，所述核酸例如基因组DNA或cDNA。可以使用多种已知手段中的任何一种实现扩增，所述手段包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、基于转录的扩增和链置换扩增(SDA)，并且可以包括从RNA模板产生cDNA链，然后扩增由此产生的DNA链。
在本公开中，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”表示这样的技术变性、与引物的退火和与DNA聚合酶的延伸的循环被用于将靶DNA序列的拷贝数扩增至约106倍或更多。用于扩增核酸的聚合酶链式反应过程可参见美国专利第4，683，195号和第4，683，202号。本领域技术人员可容易地选择和采用合适的弓I物和弓I物对，从而当需要时产生cDNA链，和视情况扩增所需的DNA和RNA序列。在本公开中，“标记”或“可检测的部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试齐U、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被制备为可检测的蛋白。在本公开中，术语“重组”，当涉及例如细胞、或核酸、蛋白、或载体时，表示已经通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白对所述细胞、核酸、蛋白或载体进行了修饰，或表示所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不见于天然(非重组)形式的细胞中的基因或表达异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。某些序列的排除:应当理解，在具体实施方案中，序列、探针、引物、多肽等的个体实例可以除外。核酸的检测多种检测具体核酸序列的方法及其应用对于本领域技术人员是显而易见的。使用多种不同方法可以检测核酸分子。核酸检测方法包括，例如，PCR和核酸杂交(例如，Southern印迹、Northern印迹或原位杂交)。具体而言，能够扩增祀核酸的寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物)可以用于PCR反应。PCR方法通常包括以下步骤获得样品、从所述样品分离核酸(例如，DNA、RNA或二者)和使所述核酸与一种或多种寡核苷酸引物接触，所述引物能在模板核酸发生扩增的条件下特异性地与模板核酸杂交。在模板核酸的存在下，产生扩增产物。核酸扩增和扩增产物检测的条件是本领域技术人员已知的。已开发出多种对于基础PCR技术的改进，包括但不限于，锚定PCR、RACE PCR、RT-PCR和连接酶链反应(LCR)。扩增反应中的引物对必须与模板核酸的相反链退火，并且应该彼此保持合适的距离，使得聚合酶能有效地跨过区域进行聚合并使得可以使用例如电泳容易地检测扩增产物。例如，可以使用诸如 OLIGO (MolecularBiology Insights Inc. ,Cascade,Colo.)的计算机程序设计寡核苷酸引物，以助于设计具有相似熔解温度的引物。通常，寡核苷酸引物长度为 10-30 或 40 或 50 个核苷酸(例如，长度为 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)，但是可以更长或更短，只要使用合适的扩增条件。应当理解，可以通过以下检测RNA序列通过逆转录产生合适的cDNA链，并随后使用合适的方法扩增或检测得到的DNA序列。在本公开中，术语“标准扩增条件”是指扩增反应混合物的基本组分和循环条件，所述循环条件包括模板核酸变性、寡核苷酸引物与模板核酸退火和通过聚合酶的引物延伸以产生扩增产物的多个循环。通常使用可检测的标记实现扩增产物或杂交复合物的检测。术语“标记”，当涉及核酸时，意图包括通过将可检测的物质偶联(即，物理连接)至核酸的核酸直接标记，以及通过与直接标记了可检测的物质的另一试剂进行反应的核酸间接标记。可检测的物质包括 各种酶、辅基、荧光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；冷光材料的实例包括鲁米诺；生物冷光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母蛋白；合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3h。间接标记的实例包括用生物素将核酸末端标记，使得可以用荧光标记的抗生物素蛋白链菌素检测该核酸。术语“探针”，当涉及核酸序列时，以其通常含义使用，表示在规定条件下会与靶序列杂交并且可以用于检测该靶序列的存在的选择的核酸序列。本领域技术人员应当理解，在某些情况下，探针也可以用作引物，并且引物可以用作探针。产品本公开包括含有一种或多种核酸分子或编码核酸分子的一种或多种载体的产品(例如，试剂盒)。所述核酸分子是制备用于本文所述的用途，并且可以按照计划的使用模式适当地单独包装或共同包装。例如，核酸分子或编码核酸分子的载体可以包含在合适的缓冲液或合适的标记试剂或检测系统中或伴随有合适的缓冲液或合适的标记试剂或检测系统。实施方案的试剂盒可以包含其它试剂(例如，缓冲液、协同因子、酶检测系统)。试剂盒还可以包含可以测定并与生物样品进行比较的一个对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器中，并且所有不同的容器可以位于单一的包装中。实施方案全面参考
图1-9描述要求保护的主题的实施方案。在第一实施方案中，公开了对生物样品中的结肠直肠癌进行诊断或提供预后的方法。在实施方案中，所述方法包括检测所述生物样品中RNA序列的存在，所述RNA序列在全序列长度上与选自由SEQ. ID. N0S: 1-7构成的组的序列至少约98%相似，图8中列出了序列及其标识符以及用于检测所述序列的TaqMan微RNA测定。在该方法的实施方案中，所述序列的升高的水平指示结肠直肠癌的存在。序列的所述升高的水平的检测可以包括将测试样品中所述序列的水平与参考水平进行比较。可以通过与对照进行比较来确定所述参考水平，所述对照可以是或可以包括非癌的对照样品、或癌的对照样品、或人工产生或提取的样品、或参考标准品或可以包括将所述受试样品的序列水平与预定的参考水平进行比较。在可选实施方案中，序列相似性可以为至少约99%或至少约100%，并且可以表现在全序列长度上。在可选实施方案中，所述方法可以包括检测至少I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个选自SEQ. ID. NO: 1-7的序列。在可选实施方案中，SEQ. ID. NO: 1-7中的任意一个或多个的检测可以与检测其它序列或进行其它诊断或预后测试相联合。在可选实施方案中，可以将一个或多个选择的序列的水平进行定量，或独立地或共同地与合适的对照进行比较。在具体实施方案中，测试序列可以选自SEQ. ID. NO: 1-7。在具体实施方案中，生物样品可以取自个体，所述个体可以是人类个体。在实施方案中，所述生物样品可以是粪便样品。在实施方案中，所述检测可以包括扩增相关的一个序列或多个序列，或可以包括任何其它形式的检测方法，本领域技术人员能够容易地理解和使用所有合适的方法。在具体实施方案中，特定微RNA的扩增使用TaqMan微RNA测定(型号442797， Applied Biosystems, Foster City, CA, US)进行。每个微RNA测定的测定号在图8中不出。每个试剂盒包含用于特定微RNA的逆转录的引物和用于该微RNA的qPCR的引物/探针混合物。公司未公开引物和探针序列，但是这些序列已知是高严紧性和高特异性的。关于该测定系统的其它资料可以访问https: //products, appliedbiosystems. com/ab/en/US/adirect/ab cmd=catNaviRate2&catID=601803&tab=DetailInfOo 在具体实施方案中，备选的测定系统可以用于进行测定，例如Qiagen提供的试剂盒。在一个实施方案中，合适的测定系统和试剂盒可以提供2个分析步骤。一个步骤可以是逆转录(RT)，从而通过连接具体的RT引物将短的miRNA序列转录为加长的cDNA序列。分析的第二个步骤是定量PCR，所述定量PCR使用添加的序列的正向和反向引物对和用于检测扩增产物的探针来扩增所述加长的序列。本领域技术人员应当理解，许多其它方法可以用于检测和定量miRNA序列，并且应当理解，可以按照需要或视情况对这些方法中的任意一种进行常规调整后使用。本文公开的并要求保护的主题不受使用的获取、检测、分析、扩增、修饰或定量miRNA的任何特定技术方法的限制，并且同样不受引物或引物序列的任何特定选择的限制。在可选实施方案中，可以使用用户限定的引物，并且本领域技术人员利用常规技术能够容易地设计和使用所述引物。在可选实施方案中，公开了对生物样品中的结肠直肠癌进行诊断或提供预后的方法，所述方法包括检测所述样品中在高严紧性条件下与选自SEQ. ID. NO: 1-7的序列杂交的序列。应当理解，在实施方案的变形中，可以按照对本领域技术人员显而易见的方式来调整所用的具体的严紧性。应当理解，在实施方案中，样品中的序列相对于对照的升高的水平可以认为指示结肠直肠癌的存在。在实施方案中，所述方法可以包括检测至少约I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个选自SEQ. ID. NO: 1-7的序列。在具体实施方案中，所述序列可以选自SEQ. ID. NO: 1-3。在具体实施方案中，所述序列可以选自 SEQ. ID. NO: 1-3，或 SEQ. ID. NO:2_7、3-7、4-7、5_7、6 和 7，或 SEQ. ID. NO: I 和 2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-5、1-4、1-3或I和2。在其它实施方案中，相关的序列可以包括SEQ.ID. N0:l、2、3、4、5、6和7中的任意选择的一个或多个，并且可以包括这些序列的任意组合，并且可以包括或去除这些序列中的任意一个或多个。在可选实施方案中，可以使用试剂盒进行所述方法，并因此在一个实施方案中，公开了用于对生物样品中的结肠直肠癌进行诊断或提供预后的试剂盒，所述试剂盒包含至少2个引物，所述引物适于扩增与SEQ. ID. NO: 1-7中的任一项在至少15个连续碱基对上具有至少约98%相似性的DNA区。在实施方案中，所述方法可以包括检测至少约I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个选自SEQ. ID. NO: 1-7的序列。在具体实施方案中，所述序列可以选自 SEQ. ID. NO: 1-3，或 SEQ. ID. NO: 2_7、3-7、4-7、5_7、6 和 7，或 SEQ. ID. NO: I 和 2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-5、1-4、1-3或I和2。在其它实施方案中，相关的序列可以包括SEQ. ID. NO: 1、2、3、4、5、6和7中的任意选择的一个或多个，并且可以包括这些序列的任意组合，并且可以包括或去除这些序列中的任意一个或多个。在其它实施方案中，在全长度序列上的序列相似性可以为约100%。在实施方案中，所述生物样品可以是粪便样品。在本文公开的方法和序列的具体实施方案中，结肠直肠癌测试的灵敏性为至少约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%和100%。在本文公开的方法和序列的具体实施方案中，结肠直肠癌测试的特异性 为至少约 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100%。在本文公开的方法和序列的具体实施方案中，结肠直肠癌测试的灵敏性可以为约60%-约 90%、约 60%-约 70%、约 70%-约 80%、约 80%-约 90%、约 90%-约 100%、约 65%-约 75%、约75%-约85%、约85%-约95%或约95%-约100%。在本文公开的方法和序列的具体实施方案中，结肠直肠癌测试的特异性可以为约60%-约90%、约60%-约70%、约70%-约80%、约80%-约 90%、约 90%-约 100%、约 65%-约 75%、约 75%-约 85%、约 85%-约 95% 或约 95%-约
100% ο在本文公开的方法和序列的具体实施方案中，按照每纳克粪便RNA中miRNA的拷贝数测定的、为确定结肠直肠癌测试结果而选择的截止值可以为至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000 或可以大于约 60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000。在本文公开的方法和序列的具体实施方案中，按照每纳克粪便RNA中miRNA的拷贝数测定的、为确定结肠直肠癌测试结果而选择的截止值可以小于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、I1000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000 或可以小于约 60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000。使用SEQ. ID. NO: 1-7 的 ROC 分析提供在图 1B、2B、3B、4B、5B、6B 和 7B 中，％ 特异性显示在X轴，%灵敏性显示在I轴。同一微RNA的丰度数据提供在图1A、2A、3A、4A、5A、6A和7A，这些图显示了每纳克总RNA中相关miRNA的拷贝数。应当注意到，在这些图中，术语“CRC”用于指代包含结肠直肠癌细胞的癌症，术语“正常”用于指代对照或非癌的样品。在实施方案中，结肠直肠癌中SEQ.ID.N0:1、2、3、4、5、6和7(单独地或共同地)的表达水平可以高于其相邻正常组织或其它对照组织。在具体实施方案中，在合适的截止水平下，SEQ. ID. N0:l(hsa-miR-135b)对结肠直肠癌的灵敏性和特异性可以分别高达约74. 1%和70.8%，SEQ. ID. N0:2(hsa-miR-221)对结肠直肠癌的灵敏性和特异性可以分别为至少约81. 5%和68. 8%，SEQ. ID. NO: 3 (hsa-miR-18a)对结肠直肠癌的灵敏性和特异性可以分别为至少约70. 4%和77. 1%。当用于结肠直肠癌的检测、诊断或预后时，在合适的截止值下，SEQ. ID. N0:4(has-miR-19a)对结肠直肠癌的灵敏性可以高达约90%并且特异性可以高达约100% ;在合适的截止值下，SEQ. ID. N0:5(has-miR-223)的灵敏性可以高达约80%并且特异性可以高达约100% ;在合适的截止值下，SEQ. ID. N0:6(has-miR-301a)的灵敏性可以高达约70%并且特异性可以高达约100%并且SEQ. ID. NO: 7 (has-miR-592)的灵敏性可以高达约70%并且特异性可以高达约100%。图9显示了对照样品和包含结肠直肠癌细胞的样品的Mann-Whitney比较的P值。同一张图还给出了 SEQ. ID. NO: 1-7中每一个的AUC(曲线下面积)、截止值、灵敏性和特异性数据。本领域技术人员应当容易理解到，可以调整截止值，分析的特异性和灵敏性也会随之改变。本领域技术人员能容易地调整这些参数以适合具体应用和要求。在实施方案中，公开的材料和方法可以用于评价癌症或与癌症相关的其他因素的存在或预后。所有这些都是本领域技术人员能容易理解的。
实施例以下实施例举例说明用于实践公开的实施方案的主题的材料、方法和操作。应当 理解，本文所述的实施例和实施方案仅是举例说明的目的，并且根据它们进行的各种改动或变化对于本领域技术人员是显而易见的，并且将包括在本申请的实质和范围内。方法和材料样品类别和处理用50ml样本杯收集新鲜的人粪便样品，在RNA提取之前贮存在4° C。在排便后3小时内提取总RNA。定义了粪便粘稠度的4个类别“坚实的”(粪便具有轮廓清晰的边缘，在处理时保持其自体的形状但是受压时变形)，“柔软的”(粪便具有均匀的粘稠度，但是自然边缘较少或较不明显，保持其自体的形状但是轻度处理时变形)，“松散的”(粪便具有半固体粘稠度并且能够接受容器的形状)，“水样的”(没有固体碎块，完全液态)。仅有“坚实的”、“柔软的”和“松散的”粪便用于提取总RNA并进一步分析。
微RNA提取将O. 2-0. 3g(湿重)的幾便添加至 2ml 管(Invitrogen , Carlsbad, CA, USA)中的 Iml TriZol LS 试剂。利用无 RNA 酶的杵(USA Scientific , Woodland, CA, USA)将坚实粘稠度的样品捣匀，以允许其完全变形。将2ml管涡旋30秒以允许粪便样品在TriZol LS试剂中变得均匀。将300 μ I氯仿添加至2ml管中。将2ml管再涡旋15秒，然后在4° C下12，OOOg离心15分钟。将上层水相转移至新的2ml管，添加I. 5倍体积的100%乙醇并使用移液管充分混合。将2ml管的全部内容物转移至miRNeasy 小型试剂盒(Qiagen ，Valencia, CA，USA)的RNeasy 小型离心柱。按照生产商的说明书进行后续的总RNA提取。将总 RNA 洗脱在 50 μ I 无核酸酶的水中。利用 Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific,Wilmington, DE, USA)测量 RNA 浓度。逆转录 使用TaqMan 微 RNA 逆转录试剂盒(Applied Biosystems , FosterCity, CA, US)和修改的流程进行逆转录(RT)。简言之，在一个RT反应中使用6nmole的dNTP (使用dTTP)、2单位逆转录酶、I. 2单位RNA酶抑制剂、0. 6 μ I RT缓冲液、0. 6 μ I TaqMan 微RNA RT弓丨物和3ng-6ng总RNA，总体积为6 μ I。热循环条件如下16° C持续30分钟，42° C持续30分钟，85° C持续5分钟和保持在4° C。将RT产物添加18 μ I无核酸酶的水，以补足24 μ I 的总体积。使用 TaqMan 微 RNA 测定(型号:442797, Applied Biosystems, FosterCity, CA，US)进行特定微RNA的扩增，用于特定miRNA序列(即SEQ. ID. NO: 1-7)的微RNA测定的测定号在图8中给出。每个试剂盒包含用于特定微RNA的逆转录的引物和用于该微RNA的qPCR的引物/探针混合物。实时定量PCR使用TaqMan 微 RNA 测定(Applied Biosystems , Foster City, CA, US)和修改的流程进行特定微RNA的实时定量PCR(qPCR)。简言之，反应混合物含有6 μ I TaqMan Universal PCR Master Mix (无 AmpErase UNG) (Applied Biosystems , Foster City, CA,US)，0. 3 μ I微RNATaqManTM测定和2. 4 μ I稀释的RT产物和3. 3 μ I无核酸酶的水。使用Applied Biosystems 7500 实时 PCR 系统(Applied Biosystems, FosterCity, CA, US)进行实时qPCR。通过使用从已知加入量的合成DNA寡核苷酸(Invitrogen , Carlsbad, CA,USA)的稀释系列获得的标准曲线，将Ct值转化为拷贝数/ng RNA的绝对值。结果将微RNA用于筛杳结肠盲肠癌(“CRC”)筛查结果显示在图9中，其中可见，SEQ. ID. NO: 1-7对结肠直肠癌具有高特异性和敏感性。不同miRNA的ROC曲线的截止值和AUC值以及Man-Whitney U检验的P值也在图9中示出，这指示癌样品和正常对照之间的差异的显著性水平。本文提供的实施方案和实施例举例说明所公开的主题的一般性质，而并非限制。本领域技术人员应当理解，可以以不脱离公开的主题的实质和范围的各种方式容易地修改和/或调整这些实施方案以用于不同的应用。本文的主题应理解为包括但不限于所有备选实施方案和等同物。本文所用的短语、词语和术语是说明性质的，而并非限制。在法律允许的情况下，通过引用将本文引用的所有参考文献整体并入本文。应当理解，在多种可能的备选实施方案和特征的备选组合中可以将本文公开的不同实施方案的任何方面进行组合，特征的所有不同组合应理解为构成要求保护的主题的一部分。具体实施方案可以任选地包括公开的任意一种或多种元件，或由公开的任意一种或多种元件组成，或不包括公开的任意 一种或多种兀件。
权利要求
1.对生物样品中的结肠直肠癌细胞进行诊断或提供预后的方法，所述方法包括检测所述生物样品中RNA序列存在的步骤，所述RNA序列在全序列长度上与选自由SEQ.ID. NOS: 1-7构成的组的序列至少有约98%相似性，其中所述RNA序列的存在指示所述样品中结肠直肠癌细胞的存在。
2.如权利要求I所述的方法，还包括将所述样品中所述序列的水平与对照中所述序列的水平进行比较。
3.如权利要求I所述的方法，其中所述在全序列长度上的相似性为至少约99%。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述在全序列长度上的相似性为约100%。
5.如权利要求I所述的方法，还包括检测至少2个所述序列。
6.如权利要求I所述的方法，还包括检测至少4个所述序列。
7.如权利要求I所述的方法，其中所述生物样品是粪便样品。
8.如权利要求I所述的方法，其中所述组由SEQ.ID. N0S:4-7构成。
9.如权利要求I所述的方法，其中所述检测包括扩增所述序列。
10.对生物样品中的结肠直肠癌进行诊断或提供预后的方法，所述方法包括检测所述样品中在高严紧性条件下与选自由SEQ. ID. N0S: 1-7构成的组的序列杂交的RNA序列，其中所述RNA序列的存在指示所述样品中结肠直肠癌细胞的存在。
11.如权利要求10所述的方法，还包括将所述样品中所述序列的水平与对照中所述序列的水平进行比较。
12.如权利要求10所述的方法，还包括检测至少2个所述序列。
13.如权利要求12所述的方法，还包括检测至少4个所述序列。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述样品是粪便样品。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述组由SEQ.ID. N0S:4-7构成。
16.用于对生物样品中的结肠直肠癌细胞进行诊断或提供预后的试剂盒，所述试剂盒包含 适于逆转录与SEQ. ID. N0S: 1-7中的任一项在至少15个连续碱基对上具有至少约98%相似性的RNA的引物。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述在序列全长度上的序列相似性为约100%。
18.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述生物样品是粪便样品。
19.如权利要求16所述的试剂盒，其中 所述逆转录产生DNA序列，并且 所述试剂盒还包含适于扩增所述逆转录的DNA序列的引物对。
20.用于对生物样品中的结肠直肠癌进行诊断或提供预后的探针，所述探针包括选自SEQ. ID. N0S: 1-7的序列，其中所述序列在高严紧性条件下与所述样品中存在的RNA序列杂交，并且其中所述RNA序列的存在指示所述样品中结肠直肠癌细胞的存在。
全文摘要
公开了对生物样品中的结肠直肠癌细胞进行诊断或提供预后的方法，所述方法包括检测所述生物样品中RNA序列存在的步骤，所述RNA序列在全序列长度上与选自由SEQ.ID.NOS:1-7构成的组的序列至少有约98%相似性，其中所述RNA序列的存在指示所述样品中结肠直肠癌细胞的存在。还公开了用于对结肠直肠癌进行检测和提供预后的探针。
文档编号C12Q1/68GK102985563SQ201180030109
公开日2013年3月20日 申请日期2011年6月22日 优先权日2010年6月23日
发明者沈祖尧, 于君, 吴宗华 申请人:香港中文大学