专利名称：用于结肠给药的硫唑嘌呤组合物的制作方法
炎性的肠道紊乱疾病(inflammatory bowel disorders ordiseases，IBD)包含一系列相互交错似缺少共同病因的临床病症。但是炎性的肠道疾病是以胃肠道不同部位慢性炎症为特征的。炎性肠道疾病的例子有节段性回肠炎(Crohn氏病)、自发的溃疡性结肠炎、自发的结肠直肠炎以及感染性结肠炎。有关炎性肠道疾病发病机理的多数假说都涉及免疫学、传染和膳食因素。
6-巯基嘌呤及其药物前体用来治疗炎性肠道疾病已经25年以上。多次对照实验和最近的转变分析支持6-巯基嘌呤和硫唑嘌呤在治疗节段性回肠炎(Crohn氏病)的效力。请参阅J.M.T.Willoughby et al.，Lancet，ii，944(1971)；J.L.Rosenberg etal.，Dig Dis.，20，721(1975)。几个对照实验支持用硫唑嘌呤治疗溃疡性结肠炎，最近郝苏隆(Hawthorne)和他的同事们在英国医学期刊(Brit.Med.J.)1992年305卷20页上作了报道。然而，巯基嘌呤和硫唑嘌呤的使用因担心其毒性而受到局限。有2-5％患炎性肠道疾病的病人长期服用6-巯基嘌呤和硫唑嘌呤被检查出与剂量相关的白细胞减少，例如请参阅D.H.Present et al.，Am.lnt.Med.，111，641(1989)；W.R.Connell et al.，Gut，34，1081(1993)。
因此，需要有对炎性肠道疾病有效而无毒的治疗方法。
本发明提供了一种治疗炎性肠道疾病的疗法，包括给需要这样治疗的病人在结肠局部施用对减轻所说IBD症状有效量的硫唑嘌呤。硫唑嘌呤优选为口服药，通过单位剂量肠溶衣形式在病人回肠远端和/或结肠有选择地释出硫唑嘌呤。硫唑嘌呤也可以有效地给药到结肠，把含有硫唑嘌呤的灌肠配剂通过直肠给药。由于硫唑嘌呤在结肠吸收进血液的效果不佳，可以对受损害组织，即节段性回肠炎(Crohn氏病)或溃疡性结肠炎，给以硫唑嘌呤相对高的剂量，而不会引起诸如白细胞减少等全身性毒性。因此可以约150-1000毫克有效剂量的硫唑嘌呤对成年病人每日给药1-4次(150毫克每日1次至1000毫克每日4次)而不会有过量的毒性(硫唑嘌呤给药剂量为大约按体重2-20毫克/公斤)。
此说明书所用的术语“硫唑嘌呤”包括其药理上可接受的其盐类，以及功能等效的类似物、衍生物和诸如6-巯基嘌呤等的代谢物。请参阅例如美国专利NO.3,056,785及W.P.Wilson etal.，Anal.Profiles of Drug Substances，10，29-53(1981)。
对病人已经使用结肠给药的方法以降低与口服或静脉内注射肾上腺皮质类固醇和与口服5-氨基水杨酸盐相关的毒性。这一毒性的降低被认为是由于降低了全身性生物吸收率，有几种类型的结肠药物给药系统目前正在使用，包括灌肠法(参阅L.R.Sutherland et al.，Med.Clin.North Amer.，74，119(1990))，直肠泡沫法(Drug.Ther.Bull.，29，66(1991))，和在回肠远端pH7环境下溶解的丙烯酸乳状剂包衣胶囊的口服延迟释出配方，(参阅K.W.Schroederet al.，New Engl，J.Med.，317，1625(1987))。有硫唑嘌呤的有效剂量可以以单位剂量的形式经口摄入局部给药到病人结肠，此单位剂量形式包括肠溶衣包覆的硫唑嘌呤有效剂量，以便其在下消化道中从单位剂量释出，例如在回肠远端部分和在病人的结肠中。硫唑嘌呤的微粒可以被逐个单独包覆并以存在于液态载体中的悬浮液形式施用，可以作为粉末用胶囊包起来，或者可以压成丸剂或片剂以便吞服。用另一种方法，硫唑嘌呤可以结合用于固态单位剂量形式中的佐剂，例如填充剂和粘合剂把它压制成型，固态剂量形式例如丸剂或片剂，并这些丸剂或片剂加以处理，以便在上面加上适当厚度的肠溶衣。
肠溶衣是那些在胃中可保持完整无损而一旦到达小肠就溶解并释出剂型的内容物。肠溶衣的目的就是要延迟硫唑嘌呤的释出，直至它到达结肠内起作用的靶部位。由于硫唑嘌呤以这样方式向结肠组织局部给药，只有大约10％被血液吸收进去，硫唑嘌呤的全身性副作用就得以避免或降低到最低限度。
因此，有效的肠溶衣是一种在胃的低pH环境中仍处于不游离状态的肠溶衣，只是在pH上升到约4或5时才容易离子化，最有效肠溶衣聚合物是具有pHa 3至5的多元酸。
最广泛使用的聚合物是乙酸邻苯二甲酸酯纤维素(CAP)，它用作为肠溶衣能发挥有效作用。然而，通常要求pH大于6才能溶解，于是可使药物延迟释放。另一种有用的聚合物是聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯(PVAP)，它对于潮湿和胃液较少渗透，水解作用稳定，并能在较低pH下离子化，其结果是活性物质在十二指肠内较早释出。
最近可以得到的聚合物是邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素酯，它具有与聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯相似的稳定性并能在相同的pH范围内分解。现在使用的聚合物进一步的例子是那些以甲基丙烯酸为基础的聚合物，例如甲基丙烯酸共聚物，它带有酸离子基团，如Eudragit S-100(甲基丙烯酸共聚物)。现有的各种体系使这些肠衣聚合物能适合含水扩散，从而方便了应用含水膜包覆技术对药物剂型的肠衣包覆。
另一种给结肠局部施用硫唑嘌呤的优选药剂形式是一种灌肠剂酸方，它是从直肠给药到降结肠。所用的配方包括有效量的硫唑嘌呤，它溶解或扩散在适当的可流动载体如水、乙醇或水-乙醇的流质中，该载体优先选用天然的或合成的增稠剂如树胶、丙烯酸盐或变性纤维素加以增稠。配方也可包括一有效量的润滑剂，如天然或合成的油脂，即三脂肪甘油酯或卵磷脂。无毒的非离子表面活性剂也可以作为湿润剂和扩散剂包括其中。灌肠配方的单位剂量可以在预先灌满的小袋或灌注器内给药。该载体也可以包含一有效量的泡沫剂，如正丁烷，丙烷或异烷。这样的药剂配方可以从一加压容器输送出去，使得此载体以泡沫状被输到结肠，从而防止了它从靶部位脱逸。
本发明引证下列实施例作进一步说明。
实施例1 制备亲水性直肠硫唑嘌呤泡沫剂。
把2.0克KELTROL TF(黄原胶悬浮剂)加进948.4克纯蒸馏水中，其中分别含有作为防腐剂的1.4克和0.14克的对羟基苯甲酸甲基酯和对羟基苯甲酸丙基酯中并将其扩散开来。然后把2.0克黄豆卵磷脂乳化剂(原色的)以及5.0克水溶乙烯基聚合物(carbomer，CARBOPOL974PNF)也加以扩散。此后将水溶乙烯基聚合物以2克溶于20毫升纯水(pH 7.1)中的氢氧化钠予以中和。接着把10.0克POLYSORBATE80(表面活性剂)连同0.25克CITRAL(香料)加到这一混合液中并把这两种组分搅匀。最后，硫唑嘌呤2.366克也加进去并搅匀。在这种配方中硫唑嘌呤的理论含量为50mg/21克混合液。在Broodfield粘度计DV-II型在20℃、12rpm(用64测量轴)条件下测量的该浓缩液的粘稠度为29,700CPS。
此后应用标准的制备气溶胶的设备将该浓缩液与泡沫剂正丁烷混合。在该气溶胶混合液中正丁烷的含量为2.5％。然后将这种混合液灌入Sepro型金属外壳的套筒(bag-in-can)内，套筒(bag-in-can)是指安装有一个气门的可伸缩组合套筒并装进一整体的铝制罐内，推进剂氮就在此整体罐装配有一喷嘴和一套管，在温度37℃情况下，每金属罐浓缩液的排出量为21±1克，产生200-220毫升的泡沫。
实施例2 疏水性直肠硫唑嘌呤泡沫剂把2.0克KELTROL TF(黄原胶悬浮剂)，2.0克原色的黄豆卵磷酯(乳化剂)和5.0克水溶乙烯基聚合物(carbomer，CARBOPOL 974NF)加进948.45克的纯蒸馏水中，其中分别含有1.43克和0.14克的对羟基苯甲酸甲基酯和对羟基苯甲酸丙基酯，并用SILVERSON均化器将其搅匀。水溶乙烯基聚合物(carbomer)以2.0克溶于20毫升纯水(pH7.05)的氢氧化钠予以中和。
然后把疏水剂WITEPSOL H 15(Hard fat NF)47.40克加进去并用一SILVERSON均化器在混合液中进行高效率地搅匀。获得具有疏水感觉的奶油状的浓缩液。
把10.50克表面活性剂POLYSORBATE 80(多乙氧基醚)和0.25克CITRAL(香料)加进去，也用均化器搅匀。为稳定这种乳化作用尤其相应的泡沫，要把POLAWAX NF(作为非离子乳化腊)20.80克也加入混合液并加以搅匀。最后把1.93克硫唑嘌呤加进去并搅匀。配方中硫唑嘌呤的理论含量为27.5克混合液中占50毫克。测量出的关于硫唑嘌呤(AZA)浓缩液粘度AZA-141.000CPS。此后对于AZA-1样品的浓缩液与发泡剂正丁烷混合，正丁烷含量为2.5％。然后把这种混合液灌进Sepro型金属外壳筒的金属罐，每罐浓缩液排出量为27.5克±1克，在温度37℃情况下，产生200-220毫升的泡沫。疏水性泡沫比亲水性泡沫扩散率要低些。
实施例3 硫唑嘌呤肠衣胶囊的制备一片硫唑嘌呤(CIMURAN)片剂(含有50毫克硫唑嘌呤的50毫克硫唑嘌呤药片，Burroughs Wellcone公司出品)在研钵中研碎，把粉末装入2个大小一样的胶囊内，胶囊用手工封好，每个胶囊都单独称重。
这些胶囊在实验室型包箍机上与50％重量的明胶水溶液(1％多乙氧基醚)进行包箍。胶囊在实验室涂敷机中通过喷涂Eudragit S-100(甲基丙烯酸共聚物1N NH4OH)最终涂上涂层。制成的胶囊(12％重量的甲基丙烯酸共聚物(12wt-％ Eudragit))能够抵抗得住模拟胃液(pH 1.2)2个小时，但在模拟的肠道液(pH7.2)中不及60分钟就被分解。
实施例4 硫唑嘌呤在结肠局部给药A.受试者招募24名健康人志愿者，进行体检甄别和实验室检查(全血计数、化学检查、尿分析)。在进入研究之前，对所有病人和受试者进行红血球硫代嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性的测定，以便把TPMT低活性的纯合子或杂合子排除在研究之外，因为先前有报道说在这一人群中发生与使用硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤相联系的严重中性白细胞减少症。对受试者可能影响硫唑嘌呤吸收或代谢的内科状况和外科病史进行筛选辨别。受试者群组的人口统计简示于表1，表示出的参数在群组之间没有统计学上显著差别。
表1组别 数目年 龄体重TPMT水平*(岁)(公斤) (单位/毫升，RBC)口服627.7±7.580.3±20.021.9±2.3DRO 636.7±18.5 87.9±44.021.2±2.6HBF 629.2±5.883.7±11.623.5±4.0HPF 633.2±8.271.7±10.019.5±1.8*平均±标准差B.研究设计将24名健康人受试者随机接受4组中的一组50毫克硫唑嘌呤剂量处方(每组n＝6)口服；延迟释放口服剂(DRO)；疏水性直肠泡沫剂(HBF)；和亲水性直肠泡沫剂(HPF)。所有的受试者也接受静脉内(IV)硫唑嘌呤50毫克剂量。这两种硫唑嘌呤剂量分隔开至少3个星期，施药的顺序(IV与非IV)随机安排。受试者在调查研究前午夜以后就禁食。如果要做结肠泡沫给药，受试者在研究当日早晨如肠子不蠕动，就要给他们一快速灌肠剂。
静脉内一次剂量(见下述)以稀释在20毫升生理盐水内的注射液给药，注入输送5分钟以上。口服制剂与水吞服，直肠处方由护士给药，施药后受试者要禁食3小时。研究之前抽取零时间血样。在一次剂量给药后或在IV注入开始后，按以下时间间隔5，10，15，30分钟和1，1.5，2，3，4，5，6及8小时，将血样抽入7毫升含有EDTA(K3)的真空试管内(Sherwood Medical，St.Louis，Mo.)。
硫唑嘌呤的药物动力学研究是通过测定6-巯基嘌呤的生物吸收率而不是硫唑嘌呤的生物吸收率进行的，因为有现成的测定血浆6-巯基嘌呤水平的可靠技术。此外，6-巯基嘌呤是更为生物相关的分子，因硫唑嘌呤是作为巯基嘌呤的前体而起作用的。硫唑嘌呤在吸收后迅速转变为6-巯基嘌呤，这是通过由含有巯基的化合物如谷胱甘肽对咪唑环与6-巯基嘌呤分子之间连键的非酶化学作用而完成的。然后6-巯基嘌呤代谢为具有免疫调节活性的化合物，6-巯基鸟嘌呤核苷酸(6TGN)。
C.测定血浆中6-巯基嘌呤浓度血样采集后立即放入水中，在30分钟以内把血样在1000克、4℃下离心10分钟。然后把血浆转入塑胶低温试管中(Nunc Inc.，Naperbille，IL)并在-70℃下储藏直至进行分析为止。通过采用Zimm(20)改进型技术的高压液相色谱法测定6-巯基嘌呤浓度。固相萃取柱(C18 Sep-Paks，Waters，Inc.，Nillford，MA)以2.5毫升甲醇和5毫升0.2％乙酸连续预先漂洗。把1毫升血浆放在Sep-Pak上随后在血浆中加进0.04毫升饱和EDTA·2Na(Aldrich，Milwaukee，Wisconsin)溶液。二硫苏糖醇(DTT)不包括在内，因为硫唑嘌呤在有DTT参与的情况下立刻转化成巯基嘌呤。萃取柱以2毫升0.2％醋酸漂洗，然后在3200rpm下离心5分钟以去除多余的水。样品用2毫升甲醇从萃取柱中洗脱并在37℃氮气气流条件下蒸发至干燥。然后将样品在200μL内重新形成游离相，旋涡30分钟，转移到1.5毫升微型圆锥管中并在一微型离心机中离心5分钟。将一部分上层清液(0.175毫升)转移到高压液相色谱的小瓶中。
此时6-巯基嘌呤用高压液相色谱测定，分析柱是Hewlett-Packard(Rockville，Maryland)十八硅烷(ODS)Hypersil，200×4.6mm，5μm微粒尺寸。它受-Zorbax(Mac-mod Analytical，ChaddsFord，Pennsylvania)ODS 4×12.5mm防护柱保护。流动相是在1mM(C2H5)3N(三乙胺)中0.8％乙腈，以磷酸调节pH至3.2。吸光度是在340nm监测的。注射量为80μL。未知物是通过其与同日以6-巯基嘌呤已知量加进空白血浆所建立的标准曲线相比较来进行测定的。6-巯基嘌呤定量的低限为2ng/ml。平均计算浓度±2ng/ml偏差系数和50ng/ml标准分别为2.0ng/ml±18％和50.2ng/ml±3.4％。
D.药剂研究(1)硫唑嘌呤静脉内给药，钠盐冻干剂(Burroughs Wellcome，Research Triangle Park，North Carolina)。
(2)标准的50毫克口服片(Burroughs Wellcome.，ResearchTriangle Park，North Carolina)。
(3)50mg延迟释出口服片(DRO)。
(4)疏水性直肠泡沫剂(HBF)，通过一加压泡沫筒向直肠给药50毫克硫唑嘌呤(Fernion/Orion公司出品，Espoo，Finland)，它溶解于含有一种含油基剂(Witepsol H 15)的泡沫剂中使其具有疏水性。
(5)亲水性直肠泡沫剂(HPF)，通过一加压泡沫筒向直肠给药50毫克硫唑嘌呤(Fernion/Orion公司出品，Espoo，Finland)它溶解于一泡沫剂中。硫唑嘌呤延迟释出口服剂和直肠泡沫剂都是瑞士一公司(Tillotts Pharma.A.G.，Ziefen，Switzerland)制品。
E.结果1.对静脉内(IV)硫唑嘌呤药剂的药物动力学参数全部24名受试者静脉给药50毫克硫唑嘌呤后其AUC、CL、Vds、T1/2(平均值±标准差)的指标列于表2。表2为对24名健康志愿者静脉给药50毫克硫唑嘌呤后其6-巯基嘌呤药物动力学参数*。表2AUCCL VdsT1/2(ng·h/ml) (L/kg·h)(L/kg)(h)100.7±30.53.8±1.26.7±3.11.2±0.37*平均值±标准差2.结肠释出的药物动力学参数对于每一非静脉内施药途径的AUC、F、Tmax和Cmax(平均值±标准误)列于表3。口服制剂的平均生物吸收率显著大于其他制剂，而延迟释出口服制剂配方的平均Tmax显著大于其他配方。其他差异都没有统计学上意义。表3示出50毫克硫唑嘌呤通过口服、DRO、HBF、HPF给药后的6-巯基嘌呤药物动力学参数*。表3组别 AUCF Tmax Cmax(n＝6) (ng·h/ml) (％) (h)(ng/ml)口服 55±27 52±26 1.8±0.8 21±13DRO 11±9 13±15 5.4±0.2C5±5CHBF 5±4 5±42.1±0.3d2±1dHPF 3±4 2±32.0±0.0e1±1eP值 0.01a0.01a0.01b0.01aaP值是由协方差分析推导出的。在后检验结果(Duncan′s)a)口服＞DRO＝HRF＝HPF；b)DRO＞口服＝HBF＝HPF；C)平均值±标准误差(5名受试者6-巯基嘌呤浓度)；d)平均值±标准误差(4名受试者检出6-巯基嘌呤浓度)；e)平均值±标准误差(3名受试者检出6-巯基嘌呤浓度)。
3.直肠给药直肠泡沫制剂具有很好的保持性。22名受试者能保持泡沫6小时以上，只有一名受试者说只1小时后就排出疏水性泡沫，另一名说2小时后排出疏水性泡沫。自称1小时后就排出泡沫的那位受试者没有检出(药物)吸收。那位称2小时后排出泡沫的受试者在3小时有检出Cmax 2.35ng/ml。对于该泡沫制品没有不良反应的报告。
F.讨论此实施例表明，将硫唑嘌呤以延迟释出口服配方和直肠输送配方施用后6-巯基嘌呤的全身性生物吸收率明显低于一般口服硫唑嘌呤6-疏基噤呤生物吸收率。对于这一观察结果有几个产生影响的潜在因素。最可能的因素是穿过结肠粘液比起穿过胃和小肠粘液的硫唑嘌呤的吸收要少，因为没有特别的输送机制或存在被动吸收的不同比率。比起空肠的吸收作用，结肠吸收的减少已被5-氨基水杨酸盐(5-ASA)所证明(参见S.Bondesen et al.，Br.J.Clin.Pharm.，25，269(1988))。硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤在更接近胃小肠消化道的结肠粘液中可能更能完全代谢。此外，一些硫唑嘌呤可能在粪便中流失。在丙烯酸乳状剂包层的片剂给药后，5-ASA在粪便排泄出去约有25％(参见B.Norlander et al.，Aliment.Pharmacol.Therap.，4，497(1990))。
硫唑嘌呤被吸收后在血浆中迅速转化为6-巯基嘌呤。这种转化是含巯基化合物如谷胱甘肽对6-巯基嘌呤分子与硫唑嘌呤咪唑环之间的连键发生非酶化学作用的结果(参见L.Lennard et al.，Clin.Pharmacol.Therap.，46，149(1989))。谷胱甘肽存在于每一个哺乳动物细胞中，包括结肠上皮细胞和淋巴细胞，前人的研究表明淋巴细胞含有把6-巯基嘌呤转化为有活性的代谢产物所需要的酶6TGNs(参见B.Bostrom et al.，Am.J.Ped.Hem./Onc.，15，80(1993))。因此，有理由期望硫唑嘌呤的局部释放将导致结肠淋巴细胞局部免疫抑制的效应。
这一实施例表明硫唑嘌呤的结肠释放导致6-巯基嘌呤的生物吸收率明显低于一般口服硫唑嘌呤。硫唑嘌呤的结肠释放被认为可通过减少6-巯基嘌呤的全身性接触而减轻药物的毒性。此外，硫唑嘌呤这种局部给药的方式可使得对上皮内的粘膜固有层结肠淋巴细胞释放更高的局部浓缩的剂量。
参照各种具体的和优选的实施方案和技术已对本发明作为说明。然而人们应当理解，可能做出的多种变化和更动都仍在本发明的精神和范围之内。
权利要求
1.一种制备用于治疗肠道炎症疾病药剂的方法，包括一定量的适于对需要如此治疗的病人结肠局部给药的硫唑嘌呤，其中所述的剂量对于减轻所述肠道炎症疾病的症状是有效的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于是该肠道炎症疾病是溃疡性结肠炎。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于该肠道炎症疾病是节段性回肠炎。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该药剂适合于通过直肠灌肠法施用到所述病人的下节段结肠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该药剂是适合于口服的一单位剂量型式，它包含一有效剂量的肠溶衣包覆的硫唑嘌呤，其在于病人回肠末段和结肠从药剂型式中释出。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于此单位剂量型式包含有一在约pH 7下分解的肠溶衣。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于此药剂量型式释出的硫唑嘌呤每日给药总量约3-75毫克/公斤。
全文摘要
一种用于处理炎性肠道疾病的方法,是通过向结肠局部施用一有效量的硫唑嘌呤或其药物学上可接受的盐类,最好经由适于口服延迟释出的或结肠给药的多种药剂配方。
文档编号A61K31/519GK1179719SQ96192873
公开日1998年4月22日 申请日期1996年3月12日 优先权日1996年3月12日
发明者威廉·J·桑德波恩 申请人:马约医学教育与研究基金会