用于检测肠癌的标记物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测肠癌的标记物，还涉及所述标记物在检测肠癌中的应用以及相关的试剂盒和检测方法。
【专利说明】用于检测肠癌的标记物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学和医学检验领域，涉及用于检测肠癌的标记物，还涉及所述标 记物在检测肠癌中的应用以及相关的试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及直肠 与乙状结肠交界处，占60%。随着人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死 亡率呈逐年上升的趋势，发病多在40岁以后，男女之比为2:1。目前.结直肠癌早期诊断的 方法包括大便隐血检测（Fecal occult blood test, F0BT)、结肠镜检测（Colonoscopy)、 粪便DNA突变检测和粪便RNA特异性基因检测等，钡灌肠（Double-contrast barium enema，DCBE)等。结肠镜检测被认为是诊断结直肠癌的金标准，但是它为侵入性检查，需要 肠道准备，检查过程中有发生并发症如出血及穿孔危险，患者接受性不高，且花费较大。大 便隐血检测虽然为非侵入性检测，但是检查结果容易受饮食等因素的影响，并且对于筛查 结直肠癌而言.粪便隐血检测的灵敏度和特异性不够理想。
[0003] 成熟的microRNA (miRNA)是一类不编码蛋白质的单链的RNA，由18 - 24个碱基 组成，与相应的mRNA结合导致mRNA分解或沉默，从而起到对基因的调节作。近年来的研究 显示，miRNA的特异性表达与肿瘤的发生和发展有关，某些miRNA甚至可以起到抑癌基因或 癌基因的作用。环氧化酶（C0X)是前列腺素合成过程中的重要限速酶，C0X2在正常组织 中不表达，但可在各种刺激因素的作用下诱导表达，故又被称为诱导型早期反应基因，与肿 瘤的发生、发展密切相关，近年来的研究发现，C0X2在大部分头颈肿瘤中过表达，Cox2也 是肠癌的生物标志之一。因此，如果能够研发出的相应的肠癌试剂盒使之能够应用于科研 领域，将极大地促进肠癌筛查研究及科研成果的转化，对于肠癌的诊疗必将起到巨大的推 动作用。
【发明内容】
[0004] 本发明人研究发现，miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、 miRNA-223、miRNA-301a的上调表达与人类多种肿瘤（如肠癌）的发生、发展相关，提示对 检测粪便和血清 miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a的表达检测可以成为肿瘤如肠癌检测的指标之一。
[0005] 本发明提供用于检测肠癌的引物、探针和试剂盒（尤其是用于检测粪便和血清 miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2)的核酸及检测方法。
[0006] 本发明包括以下技术方案： 1.肠癌检测试剂盒，其包含选自SEQ ID N0: 9-27所示的引物和/或探针。
[0007] 2.上述1所述的试剂盒，其包含选自SEQ ID N0: 9-15所示的一种或多种引物。
[0008] 3.上述1或2所述的试剂盒，其包含SEQ ID N0: 23所示的引物。
[0009] 4.上述1 - 3中任一项所述的试剂盒，其包含SEQ ID NO: 24和/或27所示的 探针。
[0010] 5.上述1 - 4中任一项所述的试剂盒，其包含选自SEQ ID N0: 16 - 22和25 - 26所示的一种或多种引物。
[0011] 6.上述1 一 5中任一项所述的试剂盒，其包含选自以下的一组或多组引物和探 针： SEQ ID N0: 9、16、23 和 24 ; SEQ ID N0: 10、17、23 和 24 ; SEQ ID N0: 11、18、23 和 24 ; SEQ ID N0: 12、19、23 和 24 ; SEQ ID N0: 13、20、23 和 24 ; SEQ ID N0: 14、21、23 和 24 ; SEQ ID N0: 15、22、23 和 24 ;和 SEQ ID NO: 25-27〇
[0012] 7.上述1 一 6中任一项所述的试剂盒，其中所述探针带有荧光标记。
[0013] 8.上述7所述的试剂盒，其中所述探针的5'用FAM标记，而所述探针的3'用 TAMRM标记。
[0014] 9.试剂在制备肠癌检测试剂盒中的用途，其中所述试剂用于测定选自以下的一 种或多种标记物：miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a和C0X2,所述试剂优选选自SEQ ID NO: 9-27所示的一种或多种引物和/或探 针。
[0015] 10.肠癌检测方法，包括检测样品中选自以下的一种或多种标记物的水平： miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2,所述样品优选为粪便和/或血清样品，优选使用选自SEQ ID NO: 9-27所示的一种或 多种引物和/或探针检测所述标记。
[0016] 本发明的试剂盒和方法采用水解探针法TaqMan技术的设计方法（图1)，除了一对 特异性引物，用TaqMan探针法增加一条与模版互补的基因特异性探针(通常20- 30bp)，特 异性高。此外，探针上5'端和3'端还可以分别标记一个荧光报告基团，增强灵敏度。本发 明的引物、探针、试剂盒和方法适用肠癌患者的检测和诊断。
[0017] 用于肠癌检测的引物和探针优选为： (1)用于检测miR-92a的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-92a-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC CAGGCC-3' ； miRNA-92a_F : 5'-CTGCTGCTATTGCACTTGTCC-3' ； 通用下游引物（miRNA-92a-R ): 5， 一 GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miRNA-92a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (2) 用于检测miRNA-135b的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-135b-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TCACAT-3' ； miRNA-135b-F ： 5'-TGCTGCTATGGCTTTTCATTCCT-3' ； 通用下游引物（miRNA-135b-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miRNA-135b-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (3) 用于检测miRNA-18a的逆转录引物、探针及检测引物逆转录引物如下所示； miRNA-18a-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC CTATCT-3' ； miRNA-18a-F (检测用上游引物）： 5'-CTGCTGTAAGGTGCATCTAGTGC-3' ； 通用下游引物（miRNA-18a-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miRNA-18a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (4) 用于检测miR-221的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miR-221-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC GAAACC-3' ； miR-221-F(上游引物）： 5'-GCTGCAGCTACATTGTCTGCTG-3' ； 通用下游引物（miR-221-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miR-221-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (5) 用于检测miRNA-19的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-19-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TCAGTT-3' ； miRNA-l9_F(上游引物）：5'-TGCTGCTGTGCAAATCTATGCAA_3' ； 通用下游引物（miRNA-19-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探针（miRNA-19-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (6) 用于检测miRNA-223的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-223-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TGGGGT-3' ； miRNA-223-F(上游引物）：5'-CTGCTGCTGTCAGTTTGTCAAAT-3' ； 通用下游引物（miRNA-223-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探针（miRNA-223-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (7) 用于检测miRNA-301a的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-301a-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC GCTTTG-3' ； miRNA_3〇la-F(上游引物）：5'-CTGCTGCCAGTGCAATAGTATTGT_ 3' ； 通用下游引物（miRNA-301a-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探针（miRNA-301a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' T ; (8) 用于检测C0X2的引物和探针如下所示： C0X2-B (探针）： 5'-TCCTCAAAAGATTCATAGGGCTTCAGC-3' ； C0X2-F(上游引物）：5'-CACTTGACCAGAGCAGAGAGATGA-3' ； C0X2-R(下游引物）：5' -TAGAGCGCTTCTAACTCTGCAGC-3'。
[0018] microRNA 所述引物的序列是根据 microRNA 数据库（http://www. mirbase. org/)中报道的核苷酸序列 miRNA-92a (MIMAT0000092)、miRNA-135b (MIMAT0000758)、 miRNA-18a (MIMAT0000072), miRNA-221 (MIMAT0000278), miRNA-19 (MIMAT0000073), miRNA-223 (MIMAT0000280)、miRNA-301a (MIMAT0000688)以及 GeneBank 数据库中的 C0X2 序列（JN793538 )为模板设计的。表1列出了所述miRNA的核苷酸序列。
[0019] 表 1
【权利要求】
1. 肠癌检测试剂盒，其包含选自SEQ ID NO: 9-27所示的引物和/或探针。
2. 权利要求1所述的试剂盒，其包含一种或多种选自SEQ ID NO: 9-15所示的引物。
3. 权利要求1或2所述的试剂盒，其包含SEQ ID NO: 23所示的引物。
4. 权利要求1 - 3中任一项所述的试剂盒，其包含SEQ ID NO: 24和/或27所示的探 针。
5. 权利要求1 一 4中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种选自SEQ ID NO: 16 - 22和25 - 26所示的引物。
6. 权利要求1 一 5中任一项所述的试剂盒，其包含选自以下的一组或多组引物和探 针： SEQ ID NO: 9、16、23 和 24 ; SEQ ID NO: 10、17、23 和 24 ; SEQ ID NO: 11、18、23 和 24 ; SEQ ID NO: 12、19、23 和 24 ; SEQ ID NO: 13、20、23 和 24 ; SEQ ID NO: 14、21、23 和 24 ; SEQ ID NO: 15、22、23 和 24 ;和 SEQ ID NO: 25-27〇
7. 权利要求1 一 6中任一项所述的试剂盒，其中所述探针带有荧光标记。
8. 权利要求7所述的试剂盒，其中所述探针的5'用FAM标记，而所述探针的3'用 TAMRM标记。
9. 试剂在制备肠癌检测试剂盒中的用途，其中所述试剂用于测定选自以下的一种 或多种标记物：miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a和C0X2,所述试剂优选为一种或多种选自SEQ ID NO: 9-27所示的引物和/或 探针。
10. 肠癌检测方法，包括检测样品中选自以下的一种或多种标记物的水平： miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2,所述样品优选为粪便和/或血清样品，优选使用一种或多种选自SEQ ID NO: 9-27所 示的引物和/或探针来检测所述标记。
【文档编号】C12Q1/68GK104195238SQ201410403598
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】于浩洋, 苏静, 陈勉乔 申请人:深圳市晋百慧生物有限公司