Thbs2作为直肠癌血清标记物的应用及诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及THBS2作为直肠癌血清标记物的应用及诊断 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，结直肠癌的死亡率高居前 三，在中国结直肠癌的发生率呈不断上升之势，死亡率居第五。经过积极外科手术治疗和放 化疗，结直肠癌患者5年总体生存率在66%左右。有数据表明，结直肠患者在I期甚至更早 得到有效的诊断和治疗的话，生存率能够提高到90%以上。然而目前结直肠癌的早期诊断 率只有37%左右，一旦到III期或者IV期才发现治疗，生存率则降低为10%-30%。可见提高 结直肠癌的早期诊断率至关重要。目前结肠镜对结直肠癌检查的灵敏度和特异性最高，但 由于费用较高、患者痛苦较大和操作要求高等原因降低了患者愿意做该项检查的程度，致 使很多患者拖到晚期，一般的影像学检查确诊时患者常常已经处于癌症晚期，对提高患者 生存率作用有限。因此，找到特异性和敏感性均佳的肿瘤标记物成了可行的方法。然而结 直肠癌的发生发展是多种基因损伤的结果，目前还没找到理想的肿瘤标志物。
[0003] 理想的肿瘤标志物应符合以下条件：（1)敏感性高；（2)特异性好；（3)肿瘤标志 物浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关，能监测肿瘤治疗效果和肿瘤的复发并预测预后；
[4] 半衰期短，有效治疗后浓度很快下降，能较快反映体内肿瘤的实际情况；（5)存在于体 液，特别是血液中，易于检测。
[0004] 现在应用于临床的肿瘤标记物大约有如下几种：CA-153, CA19-9, CA-125, AFP， CEA，PAS，Ferritin，CA724，CA242等。通过对临床600多例样本的统计分析，发现只有CEA 在诊断结直肠癌时的敏感性在临床应用中能达到50%以上，其余都低于20%。
[0005] Thrombospondin-2 (THBS2)属于人血小板反应蛋白家族成员之一。近年来研究 表明THBS2可在多种组织中表达，并与肿瘤的发生发展密切相关。Naumnik W等研究表明 THBS2表达水平与晚期非小细胞肺癌病人的生存时间相关，THBS2水平越高，生存时间越 短，大于24. 15ng/ml的病人平均生存时间不足9个月。Matos AR等发现THBS2的转录水平 可用于区分前列腺癌和良性的前列腺增生。而Koch M等的研究则表明⑶36可通过THBS2 抑制乳腺癌的发展和转移，另外，在卵巢癌和急性淋巴白血病中THBS2发现因甲基化而沉 默。然而目前为止尚无明确的大样本数据验证其血清表达水平与肿瘤发生发展之间的相关 性，本发明通过检测表明血清THBS2水平诊断结直肠癌的特异性达87. 2%，敏感度达65. 0%。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种THBS2作为结直肠癌 血清标记物的应用及诊断试剂盒的技术方案，来定性或定量检测人血清中的THBS2抗原水 平，作为辅助结直肠癌早期诊断的一种手段，大大提高结直肠癌早期诊断的敏感性和特异 性。
[0007] 所述的人血小板反应蛋白THBS2作为检测直肠癌的血清标记物的应用。
[0008] 所述的人血小板反应蛋白THBS2在制备直肠癌诊断试剂盒中的应用。
[0009] 所述的人血小板反应蛋白THBS2在制备直肠癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于 以常规方法制备抗人血小板反应蛋白THBS2的抗体，建立检测人血小板反应蛋白THBS2的 定性或定量方法及配套的试剂盒。
[0010] 所述的人血小板反应蛋白THBS2在制备直肠癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于 抗人血小板反应蛋白THBS2的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0011] 所述的一种直肠癌诊断试剂盒，包括固相、位于固相中的抗体、酶标记抗体，其特 征在于所述的抗体为抗人血小板反应蛋白THBS2的抗体。
[0012] 所述的一种直肠癌诊断试剂盒，其特征在于抗人血小板反应蛋白THBS2的抗体是 单克隆抗体或多克隆抗体。
[0013] 本发明为直肠癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
[0014] 本发明的有益效果在于：1.提供的血清生物标志物的特异性为87. 2%，敏感性为 65.0%，具有较高特异性和敏感性。2.提供一种灵敏、可靠、可操作的方法，定量测定人血清 中THBS2抗原水平，有助于辅助早期诊断结直肠癌。
【附图说明】
[0015] 图1为实施例中的标准曲线图； 图2为实施例中ROC曲线图； 图3为实施例中THBS2点分布图。
【具体实施方式】
[0016] 为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实 验方法，通常按常规实验方法进行。 实施例
[0017] 1、血清样本的采集与制备： 采集结直肠癌患者和正常对照的全血标本，室温放置2小时内3000g离心5分钟，取上 清即得到血清。得到的血清可立即用于检测，或者分装后于-80°C保存。
[0018] 2、Elisa各种缓冲液及试剂的配置方法 (1) 包被缓冲液：PH9. 6、0. 05M的碳酸盐缓冲液
(2) 样品稀释液：ΡΗ7· 4、0· Olmol/L的PBS缓冲液 CN 105092846 A I兄明 3/5 页
(3) 洗涤缓冲液：ΡΗ7· 4、0· OlM 的 PBST 缓冲液(含 0· 05% Tween-20)
(4) 封闭液：含0· 5% BSA的pH 7. 4 PBS溶液。
[0019] (5)底物显色液： 显色液A
显色液B :(现配现用）
(6) 终止缓冲液：2M H2SO4
(7) 抗体（Anti-THBS2)由R&D公司提供，货号MAB16351，浓度为20mg/mL。
[0020] (8)标准品由R&D公司提供，浓度为200ng/mL。
[0021] (9 ) HRP 酶标抗体浓度为 0· 1-1 μ g/mL。
[0022] 3、双抗体夹心法Elisa测定血清中THBS2浓度，以辅助诊断肠癌： 具体操作步骤如下： (1) 包被：用PH9. 6、0. 05M碳酸盐缓冲液将抗体（Anti-THBS2)稀释至浓度为1~ IOyg / ml。96孔酶标板每孔加100 μ L上述抗体稀释液，4°C过夜或37°C包被2h。弃去包 被液，每孔加350 μ L洗涤缓冲液洗板3次，每次3分钟，拍干，得到捕捉抗体。 (2) 封闭：加0. 3ml封闭液于上述已包被的微孔中，置37°C封闭2小时。然后洗涤。
[0023] (3)样品稀释：每个血清样品按体积1:4稀释。建议取50 μ L血清样品加入到 150 μ L样品稀释液。
[0024] (4)标准品稀释：用样品稀释液将标准品稀释为20ng/ml，10 ng/ml, 5 ng/ml, 2. 5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.3125 ng/ml，0 ng/ml 8 个浓度梯度。
[0025] (5)加样：每孔加入50 μ L稀释后的血清样品和标准品，37°C孵育2小时；然后洗 涤。
[0026] (6)酶标二抗：每孔加入200 μ L HRP酶标抗体，置于微型振荡器37°C孵育2小时； 然后洗涤。
[0027] (7)显色：将显色液A和显色液B以1:1混合。每孔加入200 μ L，避光反应30min。
[0028] (8)终止：每孔加入50 μ L终止液，终止反应。5min钟内测量450nm处各孔吸光度 值。
[0029] (9)标准曲线(如图1所示）：以标准品浓度为横坐标，相应吸光度值为纵坐标作标 准曲线。根据标准曲线计算每个样品的浓度。
[0030] (10)结果判定：小于3. 71为高风险，大于3. 71为正常。
[0031] 对400例结直肠癌病人血清，200例正常对照血清的ROC分析确立了以上参考值， 其中ROC曲线如图2所示，THBS2点分布图如图3所示。
[0032] 对部分测定数据如下表：（深色标记为肿瘤患者，浅色标记为正常对照）：
本发明所提供的诊断结直肠癌的特异性为87. 2%，敏感度为65. 0%。
[0033] 以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域 的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。
【主权项】
1. 人血小板反应蛋白THBS2作为检测结直肠癌的血清标记物的应用。2. 人血小板反应蛋白THBS2在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。3. 如权利要求2所述的人血小板反应蛋白THBS2在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应 用，其特征在于以常规方法制备抗人血小板反应蛋白THBS2的抗体，建立检测人血小板反 应蛋白THBS2的定性或定量方法及配套的试剂盒。4. 如权利要求2所述的人血小板反应蛋白THBS2在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应 用，其特征在于抗人血小板反应蛋白THBS2的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。5. -种结直肠癌诊断试剂盒，包括固相、位于固相中的抗体、酶标记抗体，其特征在于 所述的抗体为抗人血小板反应蛋白THBS2的抗体。6. 如权利要求5所述的一种结直肠癌诊断试剂盒，其特征在于抗人血小板反应蛋白 THBS2的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
【专利摘要】THBS2作为直肠癌血清标记物的应用及诊断试剂盒，属于生物技术领域。本发明一方面提供THBS2作为直肠癌血清标记物的应用的技术方案，另一方面提供结直肠癌诊断试剂盒的技术方案。本发明的有益效果在于：1.提供的血清生物标志物的特异性为87.2%，敏感性为65.0%，具有较高特异性和敏感性。2.提供一种灵敏、可靠、可操作的方法，定量测定人血清中THBS2抗原水平，有助于辅助早期诊断结直肠癌。
【IPC分类】G01N33/574, G01N33/577
【公开号】CN105092846
【申请号】CN201510433036
【发明人】胡晓彤, 何超, 费伟强
【申请人】浙江大学医学院附属邵逸夫医院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月22日