专利名称：：乳腺良恶性肿瘤血清特异蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物检测
技术领域：
，尤其是涉及了一种新的肿瘤标志物一乳腺肿瘤早期血清特异蛋白，可在体外检测区分乳腺良性病变与乳腺癌的发生。
背景技术：
：乳腺癌(mammarycardnoma)是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。乳腺癌是人类最常见的一种恶性肿瘤，也是女性主要恶性肿瘤之一。各国因地理环境、生活习惯的不同，乳腺癌的发病率有很大差异。北美和北欧大多数国家是女性乳腺癌的高发区，南美和南欧一些国家为中等，而亚洲、拉丁美洲和非洲的大部分地区为低发区。据美国癌症协会估计，美国每年有12万乳腺癌新发病例，发病率为72.2/10万，1976年死于乳腺癌的人数为33000。乳腺癌在我国各地区的发病率也不相同，在世界上我国虽属女性乳腺癌的低发国，但近年来乳腺癌的发病率明显增高，尤其沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区。以上海最高，1972年上海的乳腺癌发病率为20.1/10万，1988年则为28/IO万，居女性恶性肿瘤中的第二位。其症状主要表现为肿块、疼痛、乳头溢液、乳房皮肤与外形改变等。乳腺良性疾病通常包括纤维囊性乳腺疾病(乳腺纤维瘤、乳腺囊性增生病)、多乳瘤病、乳腺大导管乳头状瘤、脂肪瘤、乳房平滑肌瘤、慢性乳腺炎、乳房发育失常、囊肿等，其绝大部分不会发生癌变成为恶性肿瘤即乳腺癌，基于乳房对于女性的重要意义，没有必要一发现就手术切除。然而这些乳腺良性肿瘤的症状却与恶性肿瘤相似，因此在良、恶性肿瘤的临床诊断上出现困难，医生为前来就诊诉说有肿块的患者所做的最重要的事就是确定肿块是不是癌。如果能找到一种方法对乳腺肿块进行快速高效的检测，用以区分良、恶性肿瘤，不仅可以大大降低治疗费用，而且可以避免患者出现不必要的心理压力。现有的区分乳腺良恶性肿瘤的标志物有CA153等，但其灵敏度和特异性远达不到要求。蛋白质是生命活动的最终执行者，肿瘤细胞基因的改变最终也都会反映在蛋白质的改变上，因此在肿瘤细胞的发生、发展以及侵袭转移过程中必定伴随着蛋白质种类与数量的改变，并且这些蛋白质有可能释放入血。从理论上讲，通过检测血清中蛋白质的动态变化就有可能筛査出与肿瘤相关的蛋白质，作为疾病早期的指标对肿瘤发生的危险性进行早期评估。近几年来，蛋白质组学的快速发展使我们从血清中寻找肿瘤特异相关蛋白质成为可能，尤其是质谱技术的产生，凭借其高灵敏度、高通量、快速简便等优点，己经成为微量蛋白质检测的最重要手段之一。SELDI-TOF-MS即蛋白质芯片和质谱技术相结合的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪技术，该技术中的蛋白质芯片具有高度并行性、高通量、微型化和自动化等其他方法难以比拟的优越性，同时该芯片采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好，使筛选低丰度小分子蛋白质甚至肽成为现实，弥补了传统方法如色谱、光谱、凝胶电泳等技术的不足，对筛选和鉴定新的肿瘤相关特异性标志物产生了巨大的影响。同时，该质谱技术可以直接对血清样品进行鉴定，方便快速，半天即可得出结果，提供了临床应用的价值。从包括中国专利在内的有关资料检索表明，自2001年以来，应用SELDI技术对血清样品进行检测来寻找新的肿瘤标志物用于肿瘤的早期诊断，成为了肿瘤研究的热点之一。美国的多家蛋白质组学研究机构己用该技术分别对卵巢癌、前列腺癌等体液样本进行了研究，发现了新的标志物，其特异性和灵敏度均优于现有的检测方法。国内也应用该技术对肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌等部分肿瘤进行了研究，得到了一些肿瘤标志物，取得了一些成果和专利。如专利申请号为200410053632.0，200410066304.4，200510080787.8等。但目前尚未有对乳腺良恶性肿瘤进行区分的研究，因此应用质谱技术对乳腺良恶性肿瘤患者血清进行分析来获得特异的肿瘤标志物，具有重要的意义。
发明内容为了克服现有技术的不足，本发明的目的是建立一套有效的方法，用于在分离的血清中体外检测区分乳腺良恶件肿瘤。即应用SELDI-TOF-MS技术，通过建立乳腺良性肿瘤患者与乳腺癌患者之间血清蛋白质的指纹图谱，并进行差异分析，寻找新的差异蛋白质标志物，从而对乳腺的良、恶性肿瘤进行区分。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是本发明提供了一种从分离的外周血血清中体外检测乳腺疾病的患者发生危险性的方法，该方法包括下列步骤(a)制备乳腺癌患者的血清样本；(b)利用表面增强激光解吸电离飞行质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测血清样品，获得血清蛋白质谱；(c)采用BiomarkerWizard和BiomarkerPattern软件对数据进行分析处理；(d)确定该血清所获自的患者发生乳腺癌的风险。本发明所述的利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术检测步骤(a)的血清样本的条件是使用CiphergenBiosystems,Inc.Fremont,USA提供的PBSII-C型蛋白质芯片阅读机，设定的最适激光强度为235，检测灵敏度8。本发明的有益效果是由于本发明应用SELDI-TOF-MS技术，从蛋白质组学的角度对乳腺良性肿瘤和乳腺癌患者外周血血清进行质谱检测、对比、分析，从而建立了有效的乳腺肿瘤血清蛋白质指纹图谱，并将其用于体外检测区分乳腺良恶性肿瘤的方法。该方法的灵敏度和特异性均优于传统的检测方法。下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明图1为乳腺癌与乳腺良性病变相关血清蛋白质谱分类模型图。选择100例乳腺癌和62例健康对照建立乳腺癌与乳腺良性病变相关血清蛋白质谱分类模型。此模型图根据差异性最显著的质核比为2726Da的标志蛋白将样本分为2组，划分的界值为39.645，然后依次根据质核比为9285Da，16077Da，15931Da标志蛋白分类，划分的界值分别为15.757，19.657，8.894，最终162样本被划分为乳腺癌的有92例，划分为乳腺良性病变的有70例。图2显示蛋白峰在200010000Da检测范围内乳腺癌和乳腺良性病变的血清差异蛋白质图谱。其中1代表乳腺良性病变，2代表乳腺癌，质核比为2726Da和9285Da的标志蛋白在乳腺癌组较乳腺良性病变组明显降低。图3是图2的胶图形式。其中l代表乳腺良性病变，2代表乳腺癌，，质核比为2726Da和9285Da的标志蛋白在乳腺癌组较乳腺良性病变组明显降低。图4显示蛋白峰在1000020000Da检测范围内乳腺癌和乳腺良性病变的血清差异蛋白质图谱。其中1代表乳腺良性病变，2代表乳腺癌，质核比15931Da和16077Da的标志蛋白在乳腺癌组较乳腺良性病变组明显升高。图5是图4的胶图形式。其中1代表乳腺良性病变，2代表乳腺癌，质核比为15931Da和16077Da的标志蛋白在乳腺癌组较乳腺良性病变组明显升高。图6为患者彭某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，检测范围20000000Da。其中1代表患者，2代表乳腺良性病变。显示患者质核比2726Da和9285Da蛋白峰较乳腺良性病变明显降低。图7同样为患者彭某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围1000020000Da。其中1代表患者，2代表乳腺良性病变。显示患者质核比15931Da和16077Da蛋白峰较乳腺良性病变明显升高。图8为患者阮某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，检测范围200010000Da。其中1代表患者，2代表乳腺良性病变。显示患者质核比2726Da和9285Da蛋白峰较乳腺良性病变明显降低。图9同样为患者阮某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围1000020000Da。其中1代表患者，2代表乳腺良性病变。显示患者质核比15931Da和16077Da蛋白峰较乳腺良性病变明显升高。图IO为患者张某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，检测范围200010000Da。其中l代表患者，2代表乳腺良性病变。显示患者质核比2726Da和9285Da蛋白峰较乳腺良性病变未见明显改变。图11同样为患者张某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围1000020000Da。其中1代表患者，2代表乳腺良性病变。显示患者质核比15931Da和16077Da蛋白峰较乳腺良性病变未见明显改变。具体实施例方式本发明的具体方案由以下实施例给出。实施例1:一、乳腺癌早期血清特异蛋白的确定(一)实验样本1、乳腺癌患者血清131例，均为女性，中位年龄52岁，经临床病理确诊且未经手术、放化疗的患者。2、乳腺良性病变患者血清91例，均为女性，中位年龄46岁，经临床病理确诊且未经手术、放化疗的患者。(二)实验材料1、试剂及芯片尿素、醋酸钠、乙腈、三氟乙酸、DTT、CHAPS均购自美国Sigma公司，Sinapinicacid(SPA)、弱阳离子交^奂芯片(weakcationexchanger)CM10购自CiphergenBiosytems，IncFremont,USA公司。2、蛋白芯片阅读机蛋白质芯片阅读机(PBSII-C型，CiphergenBiosystems,Inc.Fremont，USA)，根据激光解吸离子飞行时间的原理，可检测小到1000Da的多肽大到500000da的大分子蛋白质。(三)实验步骤1、血清的制备乳腺癌患者在取血前已经临床病理确诊且未接受任何药物治疗、手术治疗和放射治疗等干预措施，乳腺癌和乳腺良性病变患者于清晨空腹取外周血3ml置于未添加任何试剂的一次性玻璃采血管内，立即放入4。C冰箱静置2小时至血清析出后，4°C3000rmp/min离心15分钟，分离得到的血清-80。C冰箱保存。检测前取出血清样本，冰上融化后取5ul血清加入10ul尿素缓冲液(9mol/LUrea,20/oCHAPS，50mmol/LTris-HCl.pH9.0)变性，冰浴振荡孵育30min，向上述样品中加入180ti1结合缓冲液(0.1MNaAC,pH4.0)稀释,振荡混匀。2、芯片的预处理每孔加入200ul的结合缓冲液，室温振荡孵育5min，弃去结合缓冲液，重复一次。3、上样每个加样孔中加入100"稀释血清样品，室温振荡孵育l小时。4、洗脱弃去未结合的样品，每孔加入200"1的结合缓冲液，振荡洗脱5min。弃去结合缓冲液，重复操作一次。5、加能量吸收分子将芯片从处理器中取出，待表面自然晾干后，加入新鲜配置的SPA(5mgSPA加入200w1乙腈，200"1%TFA,充分振荡5min;12000g离心5min)，每孔lul，待芯片表面自然晾干后再次点样lul。室温晾干后即可上机检测。(四)芯片检测及数据的采集制备好的芯片放入PBsn-c型蛋白芯片阅读机读取芯片信息。使用前先对仪器进行校正，校正采用加有标准蛋白质的NP20芯片，使误差范围小于0.1%。设置仪器参数如下激光强度230，检测灵敏度8，优化范围200010000，最高分子量50000。用Ciphergenproteinchip3.0.2版本的分析软件采集数据，采用BiomakerWizard软件分析乳腺癌和乳腺良性病变患者外周血清蛋白质谱的差异，用BiomarkerPattern软件建立分类树模型并进行盲筛。(五)数据分析1、乳腺癌相关血清蛋白质谱模型的建立选取100例乳腺癌患者血清和62例乳腺良性疾病患者的血清建立乳腺癌相关差异蛋白模型。步骤如下(1)将乳腺癌患者和乳腺良性疾病患者血清的图谱进行归一化处理。即假定建模所用的所有图谱的的总离子流是相等的，用总离子流来校正所有图谱，剔除所有系数在0.52范围外的图谱，以减少不同芯片之间、仪器状态波动等因素所引起的误差。并对所有图谱的质核比(M/Z)进行校正。(2)采用BiomarkerWarzard软件计算样本中相同质核比(M/Z)在乳腺癌组和乳腺良性病变组峰值的差异及表达强度的差异，以P值表示，PO.01为有统计学意义。(3)采用BiomarkerPattern软件，通过优化参数，对乳腺癌组和乳腺良性疾病组间具有统计学差异的蛋白峰进行线性分析，确定最佳分类模型，即乳腺癌相关蛋白模型2、盲筛法验证乳腺癌相关蛋白模型的有效性随机选取另外的60例血清清标本(其中乳腺癌患者血清31例，乳腺良性病变患者血清29例)的蛋白质图谱，根据盲筛法的分析结果计算该模型能有效区分乳腺癌患者和乳腺良性病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，评价该模型的有效性。(六)实验结果1、乳腺癌癌相关血清蛋白质谱模型的数据分析采用BiomarkerWizard软件对100例乳腺癌患者和62例健康对照血清的蛋白质谱图进行比较和统计学分析，结果显示有6个蛋白质峰在乳腺癌患者和乳腺良性病变患者照血清中表达有显著差异(PO.01),乳腺癌患者血清中有4蛋白峰标志分子表达下调，2个蛋白标志分子表达上调。(见表l)表l乳腺癌与乳腺良性病变血清质谱差异蛋白峰质核比乳腺癌乳腺良性病变P值(Da)(均数士标准差)(均数土标准差)272630.69±13.541.19±17.932.34E-04160775.6±3.363.49±1.951.07E-03928515.39±6.5518.11±5.604.52E-03338512.14±6,5814.93±6.895.25E-031593110.54±7.876.88±4.896.08E-0329358.67±4.3410.38±4.238.05E-032、乳腺癌相关血清蛋白质谱分类模型的建立采用BiomarkerPattern软件对来源于BiomarkerWizard的数据进行分析。最终确定由质核比2726Da，16077Da，9285Da，15931Da四个蛋白质组合模型对乳腺癌和乳腺良性病变血清进行分类。此分类树具有6个节点(如图l所示)，162例样本在母节点1处被质核比为2726Da的标志蛋白划分为2组，划分的界值39.645，即峰值>39.645的被分到右边的节点，初步判定为良性病变患者，而峰值《39.645被分到左边的节点，初步判定为乳腺癌患者，再依次在节点2和节点3根据质核比为9285Da，16077Da的标志蛋白对初步判定为乳腺癌和乳腺良性病变患者的图谱进行再次分类，戈U分的界值分别为15.757和2.906，在节点2处，峰值《15.757被划分为乳腺癌，而峰值>15.757仍不能确定为乳腺癌或是乳腺良性病变，在节点3处，峰值《19.657被确定为乳腺癌良性病变，而峰值>19.657被确定为乳腺癌。如此根据分类树在未确定的节点4内根据质核比为2726Da蛋白标志再次划分，划分的界限18.831，在节点5内对可疑的乳腺良性病变根据质核比为15931Da蛋白标志，划分界限8.894。节点6根据2726蛋白标志，32.107的划分界限进行最后分类。根据此分类树162例样本中被划分为乳腺癌的有92例，戈U分为乳腺良性病变的有70例。结合病理资料，此蛋白质组合模型对建模的162例乳腺良性病变和乳腺癌照血清的分析结果如表2所示表2分类树模型对建模的162例乳腺癌和乳腺良性病变血清的分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3、乳腺癌相关血清蛋白质谱分类模型有效性的验证利用所建立的模型对另外随机选取的60例样本(其中乳腺癌31例，乳腺良性病变29例)的血清蛋白质谱进行盲筛，以判断此模型对区分乳腺癌患者和乳腺良性病变的灵敏度和特异性。结果表3所示表3对60例乳腺疾病血清样本的盲筛结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>阳性预测值48.33%阴性预测值51.67%有效率73.33%实施例2:乳腺癌良恶性相关血清蛋白质谱分类模型的具体实例，可辅助临床判断乳腺疾病的患者患乳腺癌的危险性1:彭某某，女，51岁，病历号80346，患者因发现右乳肿物2天，2007年3月来福建省肿瘤医院就诊，B超显示1、右乳内象限偏上实性占位(倾向右乳癌)2、左乳外上象限实性占位。钼靶显示右乳局部腺体增密，考虑腺体退化不全。CEA，CA153，TPS均正常。入院后行蛋白质飞行质谱仪检测(见图6，7)，可见质核比2766的蛋白峰强度14.9，质核比9285蛋白峰强度5.3，质核比15931的蛋白峰强度为28.8，质核比16077的蛋白峰强度为17.6。根据乳腺癌与乳腺良性病变的相关血清蛋白模型判断符合乳腺癌的诊断。后患者手术，术后病理诊断右乳侵润性导管癌，分期T1N0M0,I期。2:阮某某，女，51岁，病历号81933，患者因双乳肿物伴疼痛5年，于2007年6月来福建省肿瘤医院就诊，彩超显示1、左乳内上象限实性占位；2、左乳多发无回声及低回声；3、右乳多发无回声。双乳钼靶显示左乳肿物，右乳结节，双乳腺病。CEA，CA153,TPS均正常。入院后行蛋白质飞行质谱仪检测(见图8，9)，可见质核比2766的蛋白峰强度为13.3，质核比9285Da蛋白峰强度为4.5，质核比15931的蛋白峰强度为27.3，质核比16077的蛋白峰强度为10.6。根据乳腺癌与乳腺良性病变的相关血清蛋白模型判断符合乳腺癌的诊断。后患者手术，术后病理诊断左乳侵润性导管癌，分期PT1N0M0，I期。3:张某某，女，40岁，病历号80154，患者因右乳刺痛2月，于2007年3月来福建省肿瘤医院就诊，乳腺彩超显示右乳晕外下方实性占位，双乳多发性无回声及片状回声，左乳头外下方实性占位。钼靶X线摄片显示双乳增生伴有左乳瘤化。CEA，CA153，TPS均正常。入院后行蛋白质飞行质谱仪检测(如图10，11)，可见质核比2766的蛋白峰强度为59.6，质核比9285蛋白峰强度为15.2，质核比15931的蛋白峰强度为5.8，质核比16077的蛋白峰强度为7.2。根据乳腺癌与乳腺良性病变的相关血清蛋白模型判断符合乳腺良性病变的诊断。后患者手术，术中冰冻病理右乳腺纤维瘤。术后病理(右乳)腺病伴纤维瘤。以上病例显示本发明能在乳腺病变的患者中判断乳腺癌发生的危险性，对乳腺癌的诊断具有辅助的作用。可用于乳腺癌高危人群的筛查。其简单、快捷、准确度高的特点是其他方法所无法比拟的。权利要求1、一种从分离的外周血清中体外检测乳腺疾病的患者发生危险性的方法，该方法包括下列步骤(a)制备乳腺癌患者的血清样本；(b)利用表面增强激光解吸电离飞行质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测血清样品，获得血清蛋白质谱；(c)采用BiomarkerWizard和BiomarkerPattern软件对数据进行分析处理(d)确定该血清所获自的患者发生乳腺癌的风险。2、根据权利要求1所述的利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术检测步骤(a)的血清样本的条件是使用CiphergenBiosystems,Inc.Fremont,USA提供的PBSII-C型蛋白质芯片阅读机，设定的激光强度为235，检测灵敏度8。3、乳腺癌与乳腺良性病变血清质谱差异蛋白峰质核比乳腺癌乳腺良性病变P值(Da)(均数士标准差)(均数土标准差)272630.69士13.541.19±17.932.34E-04160775.16±3.363.49±1.951.07E-03928515.39±6.5518.11±5.604.52E-03338512.14±6.5814.93±6.895.25E-031593110.54±7.876.88±4.896.08E-0329358.67±4.3410.38±4.238.05E-0全文摘要本发明公开了一种乳腺良恶性肿瘤血清特异蛋白及其应用，属生物检测
技术领域：
。本发明应用SELDI-TOF-MS技术，通过建立乳腺良性肿瘤患者与乳腺癌患者之间血清蛋白质的指纹图谱，并进行差异分析，寻找新的差异蛋白质标志物，从而对乳腺的良、恶性肿瘤进行区分。由于本发明应用SELDI-TOF-MS技术，从蛋白质组学的角度对乳腺良性肿瘤和乳腺癌患者外周血血清进行质谱检测、对比、分析，从而建立了有效的乳腺肿瘤血清蛋白质指纹图谱，并将其用于体外检测区分乳腺良恶性肿瘤的方法。该方法的灵敏度和特异性均优于传统的检测方法。文档编号G01N27/64GK101354393SQ20081007066公开日2009年1月28日申请日期2008年2月28日优先权日2008年2月28日发明者叶韵斌,凡吴,应敏刚,郑弘宇,夏陈,强陈,陈慧菁申请人:福建省肿瘤医院