用于提取家禽dna的细胞裂解液、试剂盒和方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括：0.5g/L～2.5g/L?Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L?KCl；1.5g/L～2.5g/L?MgCl2；0.5g/L～1.5g/L?EDTA；20mL/L～30mL/L?Triton?X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8。本发明还提供了一种含有上述技术方案所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂盒。本发明还提供了一种家禽DNA提取方法。本发明提供的方法使得禽类血液DNA提取时间比传统方法显著缩短，在达到或超过试剂盒提取质量的同时，其成本远低于试剂盒方法，步骤少，操作难度低于主流试剂盒。
【专利说明】用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物育种【技术领域】，尤其涉及一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液、 试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 家禽分子育种作为现代家禽育种工作不可或缺的技术，常需要对核心群体进行遗 传背景鉴定、遗传疾病剔除、隐性遗传性状提纯，如鸡羽色性状中隐性白羽等分子检测相关 工作以控制后代群体质量。而DNA提取是后续分子实验的基础，因此，大规模、快速获取家 禽基因组对家禽分子育种工作的开展十分必要。
[0003] 针对禽类血液红细胞具有细胞核的特点并为了减少家禽对采样的应激，目前多以 翅下静脉采血为主，以达到从少量静脉血中提取足量的DNA以满足实验需要的目的。现有 技术公开了多种家禽血液DNA提取技术，如申请号为201210100069. 2的中国专利文献公 开了一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，其以SDS (十二烷基硫酸钠）与Trito X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚）相混合为红细胞裂解液，饱和氯化钠溶液为蛋白质沉淀 剂并使用乙醇沉淀DNA，该方法提取时间相对较短，能够完成DNA粗提取工作，能普遍应用 于血液DNA基因组提取。但是，该方法获得DNA具有较高的蛋白污染，而且使用样品量较 大，会加重采样负担、动物应激，减少血样使用次数，对禽类血液DNA提取针对性不强，其耗 时比本发明长。
[0004] 申请号为201110030176. 8的中国专利文献公开了一种动物DNA提取的细胞裂解 液、试剂盒和方法，以盐酸胍缓冲液为主要裂解液，并加入蛋白酶K后水浴过夜，以饱和酚 萃取DNA，该方法在传统DNA提取方法酚-氯仿抽提法上进一步改善，能得到一定质量的 DNA基因组。但是，该方法耗时长，需过夜消化，提取全过程长达16小时以上，不利于快速、 批量操作。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒 和方法，本发明提供的方法提取操作简便、用时短，成本低。
[0006] 本发明提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括：
[0007] 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1· 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ; 0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8〇
[0008] 作为优选，所述细胞裂解液包括：
[0009] 1. 576g/L Tris-HCl ；0. 7455g/L KC1 ；2. 033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA ；25mL/L Triton X-100 ;余量的水；用NaOH调节pH值为8。
[0010] 本发明还提供了一种用于提取家禽DNA的细胞缓冲液，包括：
[0011] 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. 0g/L KC1 ;1. 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ; 0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 调节pH值为8。
[0012] 作为优选，所述细胞缓冲液包括：
[0013] 1. 576g/L Tris-HCl ；0. 7455g/L KC1 ；2. 033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA； 23. 376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8。
[0014] 本发明提供的上述细胞裂解液和细胞缓冲液优选组合使用，即，本发明还提供了 一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括Buffer WY和Buffer YW，其中，
[0015] 所述 Buffer WY 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1· 5g/ L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH调节pH值为8 ;
[0016] 所述 Buffer YW 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1. 5g/ L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ; 余量的水；用NaOH调节pH值为8。
[0017] 作为优选，所述 Buffer WY 包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ;0· 7448g/L EDTA ;25mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8 ;
[0018] 所述 Buffer YW 包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ; 0· 7448g/L EDTA ;23. 376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8。
[0019] 本发明还提供了一种含有上述技术方案所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂 盒，即包括 Buffer WY 和 Buffer YW。
[0020] 作为优选，所述试剂盒还包括：NaCl溶液、异丙醇、75%酒精和TE裂解液。
[0021] 作为优选，所述试剂盒还包括蛋白酶K溶液，蛋白酶K溶液能够使获取的DNA纯度 和收量较高。
[0022] 作为优选，所述NaCl溶液的浓度为5mol/L。
[0023] 作为优选，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL。
[0024] 本发明还提供了一种家禽DNA提取方法，包括：
[0025] a)将新鲜抗凝家禽类血样与Buffer WY溶液混合，经水浴加热后离心，将弃上清 后得到的物质与Buffer WY溶液混合，离心后弃上清得到沉淀；所述Buffer WY溶液包括： 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. 0g/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ? 1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8 ;
[0026] b)将所述步骤a)得到的沉淀与Buffer YW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加热后 加入NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后离心，得到滤液；所述Buffer YW溶液包括：0. 5g/ L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. 0g/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?L 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8 ;
[0027] c)将所述步骤b)得到的滤液与异丙醇混合，离心后弃上清，然后与75%酒精混 合，离心后弃上清，加热后加入TE裂解液溶解。
[0028] 作为优选，所述步骤a)具体为：将10?20 μ L新鲜抗凝家禽类血样与1000 μ L Buffer WY溶液震荡混合，60?70°C水浴加热5min?8min后10000?15000rpm/min离心 1?3min，将弃上清后得到的物质与1000 μ L Buffer WY溶液震荡混合，10000?15000rpm/ min离心1?3min后弃上清得到沉淀。
[0029] 作为优选，所述步骤a)更具体为：将10yL新鲜抗凝家禽类血样与lOOOyL Buffer WY溶液震荡混合，6(TC水浴加热8min，12000rpm/min离心2min，将弃上清后得到的 物质与1000 μ L Buffer WY溶液震荡混合，使沉淀物质分散，12000rpm/min离心2min后弃 上清得到沉淀。
[0030] 作为优选，所述步骤b)具体为：将所述步骤a)得到的沉淀与200 μ L Buffer YW 溶液和10 μ L20mg/mL的蛋白酶K溶液震荡混合，60?70°C水浴加热20min?30min后加 入100 μ L5mol/L的NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后6000?10000rpm/min离心lmin，得 到滤液。
[0031] 作为优选，所述步骤b)更具体为：将所述步骤a)得到的沉淀与200 μ L Buffer YW 溶液和10 μ L20mg/mL的蛋白酶K溶液震荡混合，60°C水浴加热25min并摇晃两次；然后加 入100 μ L5mol/L的NaCl溶液，混合均勻后在核酸纯化柱中纯化，8000rpm/min离心lmin, 得到滤液，并将滤液转移到另一 1. 5mlEP管中。
[0032] 作为优选，所述步骤c)具体为：将所述步骤b)得到的滤液与等体积的异丙醇混 合，10000?15000rpm/min离心3?5min后弃上清，然后与1000?1500yL75%酒精震荡 混合，10000?15000rpm/min离心1?3min后弃上清，70?75°C烘箱加热1?3min后加 入50mLTE裂解液溶解。
[0033] 作为优选，所述步骤c)更具体为：将所述步骤b)得到的滤液与等体积的异丙醇充 分混合均匀，12000rpm/min离心5min后弃上清，然后与1000 μ L75%酒精震荡混合，混匀后 12000rpm/min离心3min后弃上清，72°C烘箱加热3min后加入50mLTE裂解液溶解，将样品 放于-20°C冰箱保存备用。
[0034] 作为优选，所述禽类血样可以为鹅血、鸡血、鸭血或者鸽子血。
[0035] 另外，本发明提供的方法也可以无需加入蛋白酶K溶液，此时得到的DNA纯度和收 量略低，但是能够满足普通PCR要求。
[0036] 与现有技术相比，本发明提供的家禽DNA提取方法具有如下优点之一：
[0037] 1、本发明解决了目前常规DNA提取方法需消化过夜或需数小时消化等耗时长的 问题，显著缩短常规方法提取禽类血样DNA所需时间，将整个DNA提取过程控制在1小时 内，理论时间为49min，真正实现快速获取家禽DNA基因组的目的，本方法比TaKaRa全血基 因组提取试剂盒省时约30min。
[0038] 2、本发明解决了常规方法提取DNA过程中操作步骤过多的问题，只需6步即可完 成DNA提取工作，而TaKaRa全血基因组提取试剂盒需15步操作，操作繁琐。
[0039] 3、本发明克服了试剂盒提取成本贵、无法大批量应用的问题：TaKaRa全血基因组 提取试剂盒成本约10元一个样，而本方法一个样成本在〇. 9元左右。
[0040] 4、本发明对核酸纯化柱的使用方法使得整个DNA提取过程无需吸取上清溶液，吸 上清是DNA提取的限速步骤，需要谨慎操作，常常需要消耗大量时间而且容易造成蛋白质 污染，人为操作因素对结果影响较大。本发明方法以核酸纯化柱滤过基因组DNA，使DNA在 滤液中而蛋白质等沉淀留在滤膜上。本发明对核酸纯化柱的使用方法与试剂盒相反，试剂 盒是滤过蛋白质而使DNA沉淀留在滤膜上，无需吸取上清液，使用核酸纯化柱滤过DNA液使 所得DNA蛋白污染低，纯度高，省时省力。
[0041] 5、本发明提取得到的DNA纯度和收量较高，能够达到甚至超过试剂盒提取质量。
[0042] 总之，本发明提供的方法使得禽类血液DNA提取时间比传统方法显著缩短，t匕 TaKaRa全血基因组提取试剂盒等主流试剂盒所需时间更短。在达到或超过试剂盒提取质量 的同时，其成本远低于试剂盒方法，步骤少，操作难度低于主流试剂盒。本发明实现了在实 验室快速、低廉、商质量获取禽类血液基因组DNA的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果；
[0044] 图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果；
[0045] 图3为本发明实施例1获取的DNA模板PCR扩增结果；
[0046] 图4为本发明实施例6?10提供的方法提取的DNA电泳结果。
【具体实施方式】
[0047] 以下结合实施例对本发明提供的用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法 进行进一步说明。
[0048] 以下各实施例中所用试剂如下：Buffer WY、Buffer YW、5mol/L NaCl溶液、异丙 醇、75%酒精、TE裂解液、20mg/ml蛋白酶K溶液；
[0049] Buffer WY ：Tris-HCll. 576g, KC10. 7455g, MgCl22. 033g, EDTAO. 7448g, Triton X-100 25ml，定容至 1000ml，NaOH 调节 PH 至 8. 0。
[0050] Buffer Yff ：Tris-HCll. 576g, KC10. 7455g, MgCl22. 033g, EDTAO. 7448g, NaC123. 376g，SDSlg，定容至 1000ml，NaOH 调节 PH 至 8. 0。
[0051] 实施例1
[0052] 1.取lOul新鲜抗凝鹅血于1. 5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震荡混匀， 于60°C水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入lOOOul BufferWY溶 液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
[0053] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震荡混匀，于60°C水浴25min并摇晃两次。
[0054] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移 至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心lmin，将所得滤液转入重新编号的1. 5ml EP管中。
[0055] 4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混勻后12000rpm/min离心5min，弃上 清。
[0056] 5.加入75%酒精lOOOul,震荡混勻后12000rpm/min离心3min，弃上清。
[0057] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于-20°C冰箱保 存备用。
[0058] 7.所得0嫩液用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪似11〇￥116?1118 检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其 中，Μ为Marker ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1 可知，本发明提供的方法提取鹅血的DNA的条带明亮单一。
[0059] 实施例2
[0060] 1.取10ul新鲜抗凝鸡血于1.5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震荡混匀， 于60°C水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入lOOOul Buffer WY溶 液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
[0061] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震荡混匀，于60°C水浴25min并摇晃两次。
[0062] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移 至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心lmin，将所得滤液转入重新编号的1. 5ml EP管中。
[0063] 4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混勻后12000rpm/min离心5min，弃上 清。
[0064] 5.加入75%酒精lOOOul,震荡混勻后12000rpm/min离心3min，弃上清。
[0065] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于-20°C冰箱保 存备用。
[0066] 7.所得0嫩液用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪似11〇￥116?1118 检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其 中，Μ为Marker ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1 可知，本发明提供的方法提取鸡血的DNA的条带明亮单一。
[0067] 实施例3
[0068] 1.取10ul新鲜抗凝鸽子血于1. 5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震荡混 勻，于60°C水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入lOOOul Buffer WY溶液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
[0069] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震荡混匀，于60°C水浴25min并摇晃两次。
[0070] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移 至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心lmin，将所得滤液转入重新编号的1. 5ml EP管中。
[0071] 4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混勻后12000rpm/min离心5min，弃上 清。
[0072] 5.加入75%酒精lOOOul,震荡混勻后12000rpm/min离心3min，弃上清。
[0073] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于-20°C冰箱保 存备用。
[0074] 7.所得0嫩液用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪似11〇￥116?1118 检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其 中，Μ为Marker ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1 可知，本发明提供的方法提取鸽子血的DNA的条带明亮单一。
[0075] 实施例4
[0076] 1.取10ul新鲜抗凝鸭血于1. 5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震荡混匀， 于60°C水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入lOOOul Buffer WY溶 液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
[0077] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震荡混匀，于60°C水浴25min并摇晃两次。
[0078] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移 至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心lmin，将所得滤液转入重新编号的1. 5ml EP管中。
[0079] 4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混勻后12000rpm/min离心5min，弃上 清。
[0080] 5.加入75%酒精lOOOul，震荡混勻后12000rpm/min离心3min，弃上清。
[0081] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于-20°C冰箱保 存备用。
[0082] 7.所得0嫩液用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪似11〇￥116?1118 检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其 中，Μ为Marker ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1 可知，本发明提供的方法提取鸭血的DNA的条带明亮单一。
[0083] 对比例1
[0084] 于宝生物工程（大连）有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鹅血样DNA,并用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图2和表 1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，Μ为Marker， E为实施例1，e为对比例1 ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结 果。由图2可知，本发明提供的方法提取鹅血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提 取的DNA。
[0085] 对比例2
[0086] 于宝生物工程（大连）有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸡血样DNA,并用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图2和表 1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，Μ为Marker， J为实施例2, j为对比例2 ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结 果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸡血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提 取的DNA。
[0087] 对比例3
[0088] 于宝生物工程（大连）有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鴻子血样DNA,并用 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图 2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，Μ为 Marker，G为实施例3, g为对比例3 ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白 仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸽子血的DNA的条带明亮单一，其亮度高 于试剂盒提取的DNA。
[0089] 对比例4
[0090] 于宝生物工程（大连）有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸭血样DNA,并用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图2和表 1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，Μ为Marker， Y为实施例4, y为对比例4 ;表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结 果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸭血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提 取的DNA。
[0091] 表1本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果
[0092]
【权利要求】
1. 一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，其特征在于，包括： 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/ L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8。
2. 根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，包括： 1.576g/L Tris-HCl ；0. 7455g/L KC1 ；2. 033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA ；25mL/L Triton X-100 ;余量的水；用NaOH调节pH值为8。
3. -种用于提取家禽DNA的细胞缓冲液，其特征在于，包括： 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/ L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为8。
4. 根据权利要求3所述的细胞缓冲液，其特征在于，包括： 1.576g/L Tris-HCl ；0.7455g/L KC1 ；2.033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA ；23.376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用NaOH调节pH值为8。
5. -种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，其特征在于，包括Buffer WY和Buffer YW， 其中， 所述 Buffer WY 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1. 5g/L ? 2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L?1. 5g/L EDTA ;20mL/L?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 调节pH值为8 ; 所述 Buffer YW 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1. 5g/L ? 2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ;余量 的水；用NaOH调节pH值为8。
6. 根据权利要求5所述的细胞裂解液，其特征在于，所述Buffer WY包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ;0· 7448g/L EDTA ;25mL/L Triton X-100 ;余量 的水；用NaOH调节pH值为8 ; 所述Buffer YW包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ;0· 7448g/ L EDTA ;23. 376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8。
7. 含有权利要求5或6所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂盒。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括：NaCl溶液、异丙醇、75%酒精和 TE裂解液。
9. 一种家禽DNA提取方法，包括： a) 将新鲜抗凝家禽类血样与Buffer WY溶液混合，经水浴加热后离心，将弃上清后得 到的物质与Buffer WY溶液混合，离心后弃上清得到沉淀；所述Buffer WY溶液包括：0. 5g/ L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8 ; b) 将所述步骤a)得到的沉淀与Buffer YW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加热后加 入NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后离心，得到滤液；所述Buffer YW溶液包括：0. 5g/L? 2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L?1. Og/L KC1 ;1· 5g/L?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L?1. 5g/L EDTA ; 15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?L 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 调节 pH 值为 8 ; c) 将所述步骤b)得到的滤液与异丙醇混合，离心后弃上清，然后与75%酒精混合，离 心后弃上清，加热后加入TE裂解液溶解。
10.根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述步骤a)具体为：将10?20 μ L 新鲜抗凝家禽类血样与l(KK)μLBuf?erWY溶液震荡混合，60?7(rC水浴加热5min?8min 后10000?15000rpm/min离心1?3min，将弃上清后得到的物质与ΙΟΟΟμ L BufferWY溶 液震荡混合，10000?15000rpm/min离心1?3min后弃上清得到沉淀； 所述步骤b)具体为：将所述步骤a)得到的沉淀与200yL Buffer YW溶液和 10 μ L20mg/mL的蛋白酶K溶液震荡混合，60?70°C水浴加热20min?30min后加入 100 μ L5mol/L的NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后6000?10000rpm/min离心lmin，得到 滤液； 所述步骤c)具体为：将所述步骤b)得到的滤液与等体积的异丙醇混合，10000? 15000卬111/1^11离心3?51^11后弃上清，然后与1000?150(^1^75%酒精震荡混合，10000? 15000rpm/min离心1?3min后弃上清，70?75°C烘箱加热1?3min后加入50mLTE裂解 液溶解。
【文档编号】C12N15/10GK104152438SQ201410403604
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】王也, 刘显庆, 刘益平, 金洁, 卿莹, 朱庆 申请人:四川农业大学