专利名称：用于增强基因表达的新型基因间元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和生物技术领域。更具体而言，本发明涉及一种改进筛选具有高表达水平的宿主细胞的手段和方法。
背景技术：
生物活性蛋白在各种宿主细胞中产生，从细菌和酵母菌到哺乳动物细胞。当蛋白质需要某种翻译后修饰如糖基化以发挥适当功能时，优选以哺乳动物细胞作为宿主细胞。通常，在哺乳动物细胞中产生的蛋白质由编码目的蛋白的所谓的“转基因”表达。为确保筛选出正确的产生蛋白质的细胞，将编码目的基因的转基因和编码可筛选标记的第二转基因相偶联，通常它们位于相同的载体上。当将筛选试剂添加到已经含有转基因的质粒转染的细胞培养物中时，只有那些含有可筛选标记的细胞能够存活下来。常见的问题是筛选的严格性很低。这就意味着该细胞不得不仅产生很少量的选定蛋白以保证能够在存在毒性筛选剂的条件下存活。尤其当可筛选标记是用来中和毒性筛选剂的酶时，就会发生这些问题。一个酶分子在一段时间内能够中和许多分子的筛选剂。这种组合的实例是新霉素和氨基糖苷磷酸转移酶(新霉素)可筛选标记。可筛选标记蛋白的限制性需求还限制了转基因蛋白质的表达水平。例如，可筛选标记的低表达水平可以通过仅引入几个拷贝的质粒来实现。然而，这也意味着仅有几个基因拷贝能够用于表达转基因蛋白，因而导致转基因蛋白的表达水平很低。因此，低筛选严格性通常伴随着目的蛋白的低表达水平。这显然是低筛选严格性带来的不良负面影响。 当使用博莱霉素和博莱霉素可筛选标记时，能够看到筛选严格性的改善。博莱霉素筛选蛋白质是一种以非酶方式起作用的可筛选标记蛋白。按化学计量它与两个博莱霉素筛选分子结合，但不进一步加工这些分子。因此，可用的博莱霉素筛选蛋白仅具有有限的能力来中和一定量的添加到培养基中的博莱霉素分子。因此，该细胞必须产生比(例如)新霉素可筛选标记mRNA多得多的博莱霉素可筛选标记，以便产生足够的筛选蛋白来分别中和博莱霉素或新霉素。当与目的基因偶联时，通常还产生较高水平的编码目的基因产物的mRNA。这些较高水平的mRNA意味着目的基因产物的较高表达。在筛选稳定转染的克隆时仅能针对用于可筛选标记的表达进行筛选，而不能针对目的基因的表达进行筛选。鉴于此，优选的是目的基因的表达和可筛选标记的表达水平有直接的联系。有多种方法使得目的基因和编码可筛选标记基因的基因以物理的方式相偶联。可以将内部核糖体进入位点(InternalRibosome Entry Site, IRES)序列置于目的基因和编码可筛选标记的基因之间。这就产生了双顺反子mRNA，从双顺反子mRNA上目的基因产物和筛选蛋白均被翻译(Rees et al.，1996，Biotechniques 20:102-110)o当需要大量的筛选蛋白例如博莱霉素筛选蛋白使得细胞存活下来时，需要高水平的双顺反子mRNA。这就意味着编码目的基因产物的高水平的mRNA能够随时用于翻译，因而获得了目的基因产物相对高的表达水平。与目的基因和编码可筛选标记的基因未通过IRES序列相结合时相比，这个原理提供了较高的筛选严格性。这一筛选相对高水平表达目的基因产物细胞克隆的过程是已被接受和经常使用的方法(参见例如WO 03/106684、WO 2006/005718和W02007/096399)。使筛选严格性达到较高水平的其他方法是使用具有能够减弱但不会完全破坏可筛选标记活性的突变的可筛选标记。为了中和培养基中的相似量的毒性筛选分子，必须产生比野生型筛选蛋白更加突变和更加受损的筛选蛋白。当通过IRES序列与目的基因相偶联时，较高受损的筛选标记mRNA水平确保了存在更多可用于翻译的目的基因的mRNA(参见例如 WO 01/32901 和 WO 2006/048459)。在另一个高筛选严格性体系的实例中，可筛选标记蛋白的翻译是严重受损的。在该实例中，经修饰的可筛选标记基因位于目的基因的上游，并未被IRES序列所分隔。本质上，可筛选标记的最佳翻译起始密码子ATG被一些不利的翻译起始密码子例如GTG或TTG所替代。任何情况下，翻译机制将不会在GTG上开始翻译，更不用说在TTG上翻译了，但将会继续阅读mRNA。假如在筛选基因中不存在ATG (这些已经被移除)，遇到的第一个ATG将是目的基因的ATG。在这种情况下，必须产生高水平的mRNA来获得足够的筛选蛋白，反过来这对于细胞的存活是必需的。然而，这些高水平的mRNA也能够确保同时具有高水平的偶联的目的基因的翻译。通过这种原理，获得了高筛选严格性体系，并导致a)仅少数克隆在筛选过程中存活，和b)该克隆表现出相对高的目的基因产物的表达水平。特别地，将TTG博莱霉素筛选标记和目的基因相偶联的情况提供了极高的筛选压力。这些筛选体系被统称为STAR-筛选(TO 2006/048459 和 TO 2007/096399)。本发明进一步公开了用于哺乳动物细胞的高度严格筛选的改进手段和方法，以便获得具有高表达水平的目的基因产物。
发明内容
定义本文中的“核酸构建体”指的是使用重组DNA技术人工制造的核酸分子。核酸构建体是单链或双链的核酸分子， 它已经被修饰并包括以一定方式组合和并列的核酸片段，它们在自然界中并不存在。核酸构建体通常是一个“载体”，也就是用于将创建的外源DNA送递至宿主细胞中的核酸分子。常见的载体类型来源于天然存在的质粒、噬菌体和病毒。通常载体进一步包括遗传元件例如在一种或多种宿主细胞等中有功能的可筛选标记、多克隆位点和复制起点，以促进它们在分子克隆中的应用。术语“表达”通常用于指在细胞内特定的核酸产物(优选特定的RNA产物)或特定的蛋白或蛋白质的产生。如果是涉及RNA产物，它指的是转录过程。如果是涉及蛋白质，它指的是转录、翻译和任选的翻译后修饰过程。如果是涉及分泌蛋白，它指的是转录、翻译和任选的翻译后修饰(例如糖基化、二硫键的形成等)、随之分泌的过程。如果是涉及多聚体蛋白，它任选地包括多肽单体的多聚体结构的组装。一种类型的核酸构建体是“表达构建体”或“表达盒”或“表达载体”。这些术语指的是能够影响宿主细胞或与该种序列相容的宿主生物体中的基因的表达的核苷酸序列。表达构建体、表达盒或表达载体通常至少包括适当的转录调控序列和任选的3’转录终止信号。也可以存在必要的或有利于实现表达的附加因子，例如表达增强子元件。术语“单顺反子基因”被定义为能够提供编码一个基因产物的RNA分子的基因。“多顺反子转录单元”(也被称为多顺反子基因)被定义为能够提供编码至少两个基因产物的RNA分子的基因。术语“双顺反子基因(bicistronicgene)”(也被称为“双顺反子基因”)被定义为能够提供编码两个基因产物的RNA分子的基因。因此双顺反子基因包括在多顺反子基因的定义内。本文中的术语“肽”指的是包括由肽键连接的氨基酸链的任何分子。因此术语“肽”包括寡肽、多肽和蛋白质，所述蛋白质包括多聚体蛋白，不限于特定的作用方式、大小、三维结构或来源。本文使用的“多肽”通常包括至少五个由肽键连接的氨基酸。术语“蛋白质”或“多肽”可以互换使用。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍然可被称为“蛋白质”。所使用的术语“分离蛋白质”指的是不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在试管内(in vitro)或在重组(真菌或植物)宿主细胞内的蛋白质。术语“肽”也包括经翻译后修饰(例如糖基化、乙酰化、磷酸化等)的肽。本发明使用的目的“基因产物”或“转录单元”包括染色体DNA、cDNA、人造DNA、它们的组合等。“目的基因产物”可以是任何基因产物，例如蛋白质、RNA1、shRNA等。目的蛋白的非限制性实例是酶、免疫球蛋白链、治疗性蛋白例如抗癌蛋白质或诊断蛋白质。含有几个顺反子的转录单元被转录为单个mRNA。本文中使用的术语“可操作地连接”指的是将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接。当核酸和其他核酸序列以有功能的方式连接时，它是“可操作地连接”。例如，如果转录调控序列能够影响编码序列的转录，它就是与编码序列可操作地连接。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的，且当必须连接两个蛋白编码区域时，应当连续并处于读码框内。“表达控制序列”指的是能够调控与其可操作地连接的核苷酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列能够控制和调控核苷酸序列的转录和/或翻译时，所述表达控制序列与所述核苷酸之间就是“可操作地连接”的。因此，表达控制序列可以包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IR ES)、转录终止子、位于编码蛋白质基因之前的起始密码子、内含子的剪接信号和终止密码子。术语“表达控制序列”意指至少包括被设计用于影响表达的序列，也包括附加的有利组件。例如，前导序列和融合伴侣序列都是表达控制序列。该术语也包括经设计从而从序列中移除框内外的非必需的潜在起始密码子的核酸序列。它也包括经设计从而移除非必需的潜在剪接位点的核酸序列。它包括序列或聚腺苷酸化序列(PA)，所述聚腺苷酸化序列指导附加的PolyA尾部，也就是位于mRNA的3’ -端的一串腺嘌呤残基(这一序列被称为polyA序列)。也可以通过设计来增强mRNA的稳定性。影响转录和翻译稳定性的表达控制序列例如启动子，以及影响翻译的序列例如Kozak序列，已知存在于真核(宿主)细胞中。本文所使用的术语“启动子”或“转录调控序列”指的是用来控制一种或多种编码序列的转录的核酸片段，相对于编码序列的转录起始位点的转录方向而言它位于上游，其结构特征是存在依赖DNA的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，所述其他DNA序列包括但并不限于转录因子结合位点、阻抑蛋白和激活蛋白结合位点、以及本领域技术人员所熟知的直接或间接地调控由启动子开始的转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“可诱导型”启动子是受生理或发育例如应用化学诱导剂调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。本文中使用的“内部核糖体进入位点”或“IRES”指的是这样的元件它促使内部核糖体直接进入顺反子(蛋白质编码区域)的翻译起始密码子(也称作起始密码子)，从而引起不依赖于帽结构(cap-1ndependent)的基因翻译。参见，例如Jackson R J, Howe
11M T, Kaminski A (1990)Trends Biochem Scil5 (12):477-83)和 Jackson R J andKaminski, A. (1995) RNA I (10) :985-1000。本发明包括使用任何不依赖于帽结构的翻译起始序列，尤其是任何能够促使内核糖体直接进入顺反子起始密码子的IRES元件。本文所使用的“在IRES翻译控制下”指的是翻译和IRES相联系并以不依赖于帽结构的方式进行。本文中使用的术语“IRES”包括IRES序列的功能性变体，只要该变体能够促使内核糖体直接进入顺反子的起始密码子即可。本文中使用的“顺反子”指的是多核苷酸序列(DNA)区段，包括产生单多肽链的所
有信息。
本文中“序列同一性”被定义为两个或多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，这种关系是通过比较序列来确定的。本领域中，“同一性”也指的是氨基酸或核酸序列之间的序列相关性的程度，这种情况下可以通过匹配成串的序列来确定同一性。通过将氨基酸序列和一个多肽的保守氨基酸置换与另一多肽序列比较来确定两个氨基酸序列之间的“相似性”。“同一性”和“相似性”很容易通过已知的方法计算出来。术语“序列同一性”或“序列相似性”指的是在最佳比对条件下，优选在序列全长(比较时至少是最短序列)上，使匹配的数量最大化，使间隙的数量最小化时，例如在默认参数下使用ClustalW (1.83)、GAP或BESTFIT软件进行比对时，两个(多)肽或两个核苷酸序列之间具有至少一定百分比的序列同一性(如本文所定义)。GAP使用了 Needleman和Wunsch全局比对算法来比对整条链上的两个序列，使匹配的数量最大化，使间隙的数量最小化。通常，使用GAP默认参数,空格创造罚分(gap creation penalty)=50 (核苷酸)/8 (蛋白质)，空格延伸罚分=3 (核苷酸)/2 (蛋白质)。对于核苷酸使用的默认记分矩阵是nwsgapdna,对于蛋白质使用的默认记分矩阵是Blosum62 (Henikoff &Henikoff，1992，PNAS 89,915-919)。优选用于比对本发明的蛋白质序列的多重比对软件是ClustalW (1. 83)，该软件使用的是blosum矩阵和默认设置(空格开放罚分10，空格延伸罚分0. 05)。序列同一性百分比的序列比对和记分可以通过使用计算机程序来确定，例如GCGWisconsin Package, 10. 3版本,可从Accelrys有限公司，9685斯克兰顿大道，圣地亚哥，CA 92121-3752美国获得，或使用开放源代码软件来确定，例如“needle”软件(使用全局 Needleman Wunsch 算法)或 EmbossWIN 2. 10. O 版本的“water” 软件(使用局部 SmithWaterman算法),使用和上述GAP相同的参数,或使用默认设置(对于“needle”和“water”以及用于蛋白质和DNA比对的默认空格开放罚分是10.0，默认空格延伸罚分是O. 5;用于蛋白质的默认记分矩阵是Blossum62,用于DNA的默认记分矩阵是DNAFull)。当序列的总长度相差很多时，优选使用局部对比例如使用Smith Waterman算法。可以使用例如FASTA、BLAST等算法通过检索公共数据库，来确定相似性或同一性的百分比。本发明的核苷酸序列也可以由它们和本文公开的或部分公开的特定核苷酸序列杂交(在温和、优选在严格杂交条件下)的能力来确定。本文所述的严格杂交条件被定义为允许核酸序列的至少约25，优选约50、75或100个核苷酸，最优选约200个以上的核苷酸在约65°C的溶液中发生杂交，所述溶液含有大约IM盐，优选6 X SSC或任何其他含有类似离子强度的溶液，并在约65°C的溶液中进行洗涤，洗涤溶液含有约O.1M以下的盐，优选O. 2 X SSC或任何其他含有类似离子强度的溶液。优选杂交过夜，也就是至少进行10小时，优选至少洗涤一小时，其间洗涤溶液至少更换两次。这些条件通常使得具有约90%以上的序列同一性的序列发生特异性杂交。本文中的温和杂交条件被定义为允许核酸序列的至少约50个核苷酸，优选约200个以上的核苷酸在约45°C的溶液中发生杂交，所述溶液含有约IM盐，优选6XSSC或任何其他含有类似离子强度的溶液，在室温的溶液中进行洗涤，洗涤溶液含有约IM盐，优选6XSSC或任何其他含有类似离子强度的溶液。优选杂交过夜，也就是至少进行10小时，优选至少洗涤一小时，其间洗涤溶液至少更换两次。这些条件通常使得具有约50%序列同一性的序列发生特异性杂交。本领域技术人员能够改变所述杂交条件以特异性识别同一性在50 %至90 %之间变化的序列。编码目的基因产物的核苷酸序列对于宿主细胞中的密码子使用的适应性由密码子适应指数(CAI)表达。本文中的密码子适应指数被定义为在特定宿主细胞或有机体内的基因的密码子使用相对于高表达基因的密码子使用的相对适应性的量度。各个密码子的相对适应性(w)是各个密码子的使用和对于相同氨基酸的最常用的密码子的使用之间的比值。CAI指数被定义为相对适应性值的几何平均值。非同义密码子和终止密码子(依赖于遗传编码)不计算在内。CAI值的范围从O至1，具有较高的CAI值说明具有较高比例的最常用的密码子(参见 Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15:1281-1295;还可参见Jansen et al. , 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8):2242-51)。根据本发明优选的核酸是核酸构建体，其中编码抗原结合蛋白的核苷酸序列可以与启动子以及任选地其他调控元件(例如终止子、增强子、聚腺苷酸化信号、分泌信号序列等)可操作地连接。这样的核酸构建体对于使用重组技术生产本发明的抗原结合蛋白尤其有用，其中，编码目的抗原结合蛋白的核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达，如 Ausubel et al. "Current Protocolsin Molecular Biology", Greene Publishingand ffiley-1nterscience, New York(1987)和 Sambrook and Russell(2001)"MolecularCloning:A LaboratoryManual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring HarborLaboratory Press, New York中所述。本文中使用的术语“可操作地连接”指的是将多核苷酸元件以有功能的方式连接。当核酸和其他核酸序列以有功能的方式连接时，它是“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子能够影响编码序列的转录，它就是与编码序列可操作地连接。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的，且当必须连接两个蛋白编码区域时，应当连续并处于读码框内。本发明的发明人发现，当将特定的核苷酸序列置于表达载体(包括可操作地连接启动子、在真核宿主细胞中起作用的编码可筛选标记的核苷酸序列以及编码目的基因产物的可选的开放读码框)时，能够增加在筛选条件下优选严格筛选条件下形成的克隆的数量(与在严格筛选条件下没有该特定序列的相同表达载体相比)，所述特定的核苷酸序列存在于视网膜母细胞瘤I (Rbl)编码序列(例如SEQ ID NO’ s: 1_4和如本文中进一步定义的部分)上游(也就是5’至)的几千碱基处和周期素依赖性蛋白激酶4抑制剂B编码序列(也称为pl5、CDKN2B、INK4B、MTS2、TP15)(例如SEQ ID NO:8和如以下进一步定义的部分)上游(也就是5’至)的几千碱基处。未发现本发明的核酸序列具有任何启动子活性，也未发现其具有增强子活性，它们也不会反式影响内源性Rbl和pl5启动子的转录。本发明的核酸序列也不具有STAR活性。但是，发现本发明的核酸序列是基因间转录的来源。已经在例如球蛋白基因座控制基因座(LCR)中发现基因间转录的现象(Ashe et al (1997) GenesDev. 11:2494-2509)。例如，在裂殖酵母中，发现fbp+基因座上游的非编码RNA的转录对于fbp+的表达是必需的(Hirota et al. (2008)Nature456:130-134)。本文中，通过 fbp+基因的转录产生了逐渐更加开放的染色质构型。基因间的转录通常和启动子的活性有关系，然而，还不清楚它是起因还是结果(Preker et al. (2008) Science 322:1851-1854)。不希望拘囿于理论，认为基因间转录物(低水平且经常不很稳定的基因间转录物)参与打开基因座或使得该基因座的染色质保持打开状态以进行转录。尽管不知道基因间转录是打开染色质结构的原因还是已经打开的并转录的基因座产生的结果，但是认为这种现象是重要的发生转录的开放染色质区域的表观遗传特征。根据本发明的核酸构建体可用来筛选真核细胞，优选植物细胞或哺乳动物细胞，通过对可筛选标记的表达进行筛选，可以得到目的基因产物具有高表达水平的真核细胞。随后或同时，可以识别一种或多种筛选出的细胞，并进一步用来表达高水平的目的基因产物。本发明基于可筛选标记的受损表达效率(impaired efficiency ofexpression)。可使用本领域技术人员已知的常规方法来检测可筛选标记的表达，例如通过测定在正常的筛选期后存活的克隆的数量来检测可筛选标记的表达。本领域技术人员公知的是，有许多参数可以表示可筛选标记多肽的表达水平，例如细胞耐筛选剂的最大浓度、给定浓度下存活的克隆的数量、筛选剂存在时细胞的生长速度(倍增时间)、上述参数的组合以及等。通过使用本发明，可以识别具有高水平表达的可筛选标记的细胞。第一方面，本发明涉及一种核酸片段，该核酸片段包括或由以下连续核苷酸组成a)位于脊椎动物Rbl基因的翻译起始位点上游的基因组区域的1000至15000个连续核苷酸；或b)位于脊椎动物pl5基因的翻译起始位点上游10. 5至7千碱基位置的基因组区域的至少 1000、1100、12 00、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2250、2500、2750、3000或3500个连续核苷酸；其中，在实施例1的条件下进行测试，所述片段当与具有SEQ IDN0:9的核苷酸序列的表达盒直接在表达盒的上游位置和下游位置侧面连接时，与在表达盒的上游侧面连接STAR 7和STAR 67且在表达盒的下游侧面连接STAR 7的相同表达盒(SEQID勵10)相比，至少产生50、75、90、100、101、110、125或150%的克隆数。优选地，所述片段的全长与 SEQ ID NO: 1-4 或 8 中的至少一个的至少 1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000个或全部的连续核苷酸具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的核苷酸序列同一性。在优选的实施方式中，所述核酸片段的全长与SEQ ID N0:l-4或8的至少 1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2250、2500、2750、3000或3500个连续核苷酸具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的核苷酸序列同一性。优选地，所述核酸片段是分离的核酸片段，这应当理解为是从自然环境中分离或纯化的片段。优选地，所述核酸片段来自哺乳动物的基因组，更优选来自灵长类动物或啮齿类动物的基因组，最优选地，所述核酸片段来自人、小鼠、大鼠、仓鼠、牛、鸡、犬、豚鼠、猪或兔的基因组。优选的核酸片段来自SEQ ID N0:1或8(人)、SEQ ID NOjpjHllhSEQ IDN0:3(牛)或 SEQ ID N0:4(豚鼠)。在另一个优选的实施方式中，所述核酸片段选自以下片段组成的组中全长与包括或由 SEQ ID NO: 5 的 1-1019、1-1482、1-2018、1-3498、479-2018 或 479-1482 的核苷酸残基、SEQ ID NO:6 的 1-2448、1-3424 或 2425-3424 的核苷酸残基、SEQ ID NO:7 的 1-3064、1-2500或1-2000的核苷酸残基和SEQ ID NO:8的1_1500、822_3352或1-3352的核苷酸残基组成的片段具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的核苷酸序列同一性的片段。更优选地，所述核酸片段选自以下片段组成的组中全长与包括或由SEQ IDNO: 5 的 1-3498、1-2018 或 1-1482 的核苷酸残基、SEQID NO:6 的 1-3424 或 2425-3424 的核苷酸残基、SEQ ID NO:8的1-2500或1-3064的核苷酸残基和SEQ ID NO:8的822-3352或1-3352的核苷酸残基组成的片段具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的核苷酸序列同一性的片段。再更优选地，所述核酸片段选自以下片段组成的组中全长与包括或由SEQ ID NO:5的1-2000的核苷酸残基、SEQID NO:6的2500-3424的核苷酸残基、SEQ ID NO:7的1-3064的核苷酸残基和SEQ ID NO:8的850-3352的核苷酸残基组成的片段具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的核苷酸序列同一性的片段。最优选地，所述核酸片段选自以下片段组成的组中全长与包括或由SEQ ID NO: 7的核苷酸残基或SEQ ID N0:8的850-3352残基组成的片段具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的核苷酸序列同一性的片段。应当理解的是，上述定义的参照标准是所指SEQ IDNO的连续核苷酸残基。本发明的第二方面涉及含有以上定义的核酸片段的核酸构建体，其中，所述片段至少和一个核苷酸连接，所述核苷酸在所述片段来源的基因组中不直接与所述片段发生天然连接。优选地，所述核酸构建体包括一个以上的与所述片段连接的非天然状态的核苷酸，例如包括一个或多个限制性位点或与 PCR引物互补的接头序列(adapter sequences)的一段核苷酸。更优选地，所述核酸构建体包括以上定义的核酸片段，其中，所述片段和表达盒相连接。优选地，所述表达盒至少含有与编码目的基因产物的核苷酸序列可操作地连接的启动子。该启动子可以是如下定义的启动子。所述表达盒可以进一步含有在真核宿主细胞中具有功能的编码可筛选标记的核苷酸序列，如下所述。根据本发明的核酸片段以“顺式(in cis)”的方式发挥作用。因此，优选地，在核酸构建体中，本发明的核酸片段与所述表达盒或更优选地与所述表达盒的最上游启动子之间的距离在5kb以内，更优选2kb以内，更优选Ikb以内，最优选500bp以内。如果本发明的核酸片段位于构建体中表达盒的下游，本发明的核酸片段与所述表达盒或更优选地与所述表达盒的最下游的转录终止序列和/或聚腺苷酸化位点之间的距离在5kb以内，更优选2kb以内，更优选Ikb以内，最优选500bp以内。因此，核酸构建体可以含有位于表达盒下游或上游的本发明的核酸片段。如果在核酸构建体序列中，本发明的核酸片段位于表达盒的下游，优选核酸片段是如上定义的Rbl上游的核酸片段，这是因为在严格条件下与以上定义的基于SEQ ID N0:8，也就是P15上游序列的序列相比，该位置的该片段能够产生更多的克隆。然而，在优选的实施方式中，本发明的核酸构建体含有位于表达盒上游和下游的核酸片段。在核酸构建体中，位于表达盒上游和下游的本发明的核酸片段可以独立选自如上定义的核酸片段。因此，在核酸构建体中，表达盒上游的核酸片段和表达盒下游的核酸片段可以不同。或者，在核酸构建体中，表达盒上游和下游的核酸片段可以(基本上)相同。优选地，核酸构建体的构型是线性形式并从5’至3’端依次包括下列序列元件本发明的第一核酸片段、表达盒和本发明的第二核酸片段，其中所述表达盒包括转录单元，所述转录单元包括与编码目的基因产物的核苷酸序列可操作地连接的启动子和任选的可筛选标记。两侧分别连接有本发明的两个核酸片段的表达盒的优势是与仅具有一个本发明核酸片段的核酸构建体相比，当在严格条件下培养细胞时，能够获得较多数量的克隆，因此可筛选标记的表达和目的基因产物的表达也较高。本文使用的“表达盒”是一种核苷酸序列，该核苷酸序列至少包括与编码目的基因产物的核苷酸序列功能性连接的表达所需的启动子。优选地，所述表达盒进一步包括转录终止和聚腺苷酸化序列。表达盒中还可以包括其他调控序列例如增强子。除了编码目的基因产物的核苷酸序列以外，优选地，所述表达盒还包括用于筛选含有表达盒的宿主细胞的编码可筛选标记的核苷酸序列。在优选的实施方式中，编码目的基因产物的核苷酸序列和编码可筛选标记的核苷酸序列在表达盒中具有部分相同的(多顺反子)转录单元。因此，本发明提供了一种表达盒，优选地，所述表达盒在5'至3'方向上包括，并可操作地连接a) 5'-启动子-编码可筛选标记的核苷酸序列-编码目的基因产物的开放读码框-任选的转录终止和/或聚腺苷酸化序列-3'，或b)5'-启动子-编码目的基因产物的开放读码框-编码可筛选标记的核苷酸序列-任选的转录终止和/或聚腺苷酸化序列-3'。启动子和其他调控序列必须能够在目的真核宿主细胞中发挥作用，也就是它们必须能够驱动目的基因产物和可筛选标记的转录。因此，启动子和转录单元可操作地连接，该转录单元包括可筛选标记和编码目的基因产物的开放读码框。表达盒可以进一步任选地包括本领域已知的其他因子，例如含有内含子的剪接位点等。在一些实施方式中，内含子位于启动子之后，编码开放读码框的序列之前。在另外的实施 方式中，IRES位于转录单元中，该转录单元包括可筛选标记密码子序列和编码目的基因产物的序列，IRES可以位于可筛选标记的开放读码框和目的基因产物之间。在病毒和哺乳动物基因中内部核糖体结合位点(IRES)因子是已知的(Martinez-Salas, 1999, Curr Opin Biotechnol 10:458-464),已通过筛选小的合成寡核苷酸而被识别(Venkatesan & Dasgupta, 2001 Mol Cell Biol 红:2826-2837)。来自脑心肌炎病毒的 IRES 已经被详细地分析(Mizuguchi et al. , 2000, Mol Ther 1:376-382)。IRES是在DNA中编码的因子，在转录RNA中它产生了真核核糖体能够结合和起始翻译的结构。IRES促使从单个RNA分子上产生两种或多种蛋白质(在它的5'端的帽结构上与RNA结合的核糖体翻译了第一个蛋白质，(Martinez-Salas, 1999，见上文)。因此，本发明提供了这样一种表达盒，优选地，该表达盒在5'至3'方向上包括5'-启动子-编码目的基因产物的开放读码框-1RES-可筛选标记-任选的转录终止和/或聚腺苷酸化序列-3'或5'-启动子-可筛选标记-1RES-编码目的基因产物的开放读码框-任选的转录终止和/或聚腺苷酸化序列-3'。优选地，本发明核酸构建体所含有的应用于表达盒的启动子在真核宿主细胞中起作用；更优选地，所述启动子在植物或动物宿主细胞中起作用；更优选地，所述启动子在脊椎动物宿主细胞中起作用，最优选地，所述启动子在哺乳动物宿主细胞中起作用，均用于转录单元的起始转录。启动子可以是组成型的或是受控的，也可以从各种来源中获得，包括病毒、原核或真核来源，或是人工设计的。目的核酸的表达可以来自天然的启动子或它的衍生物或完全来自异源启动子(Kaufman, 2000, Mol. Biotechnol 16:151-160)。根据本发明，在选定的真核细胞中提供高转录水平的强启动子是优选的。熟知的经常用于真核细胞表达的强启动子包括来自病毒例如腺病毒的启动子，例如EIA启动子；来自巨细胞病毒(CMV)的启动子例如CMV立即早期(IE)启动子(本文称为CMV启动子)(例如从pcDNA，Invitrogen 获得)；来自猿猴病毒 40 (SV40) (Das et al, 1985, Prog Nucleic Acid ResMol Biol.迪:217-36)的启动子等。适当的强启动子也可以来自真核细胞，例如金属硫蛋白(MT)启动子、延长因子(EF-Ια )启动子、泛素C或UB6启动子(Gill et al. , 2001, GeneTherapy8:1539-1546; Schorpp et al, 1996, Nucleic Acids Res 24:1787-8)、肌动蛋白启动子例如肌动蛋白启动子，例如仓鼠或人肌动蛋白启动子(SEQ IDN0:11)、免疫球蛋白启动子、热激启动子等。测试启动子的功能和启动子的强度是本领域技术人员的常规工作，通常包括例如在启动子序列的之后克隆报告基因例如半乳糖苷酶(lacZ)、荧光素酶、GFP等，并测试报告基因的表达。当然，可以通过序列的删除、增加和突变来改变启动子，并测试它的功能性来找到新的、减弱的或增强的启动子序列。本发明使用的启动子优选为人β -肌动蛋白启动子、CMV启动子、SV40启动子、泛素C启动子或EFl- α启动子。本文中的开放读码框应被理解为核苷酸序列，它从5'至3'方向上包括1)翻译起始密码子，2)用于编码目的基因产物(优选为蛋白质)的一个或多个密码子，和3)翻译终止密码子，应当理解的是1)、2)和3)在框中是可操作地连接的。因此，开放读码框由3重核苷酸(三联体)组成。根据本发明的目的基因产物可以是任何基因产物，例如蛋白质。目的基因产物可以是单体蛋白质或(部分)多聚体蛋白。多聚体蛋白至少包括两个多肽链。本发明的目的蛋白的非限制性实例是本领域技术人员已知的酶、激素、免疫球蛋白或它们的链或片段、治疗性蛋白质例如抗癌蛋白质、凝血蛋白质例如因子VII1、多功能蛋白质例如红细胞生成素、诊断蛋白质、或用于疫苗接种目的的它们的蛋白质或片段。目的基因产物可以来自任何来源，在某些实施方式中来自哺乳动物蛋白质、人造蛋白质(例如融合蛋白质或突变 蛋白质)，优选来自人蛋白质。在优选的实施方式中，利用宿主细胞的密码子适应指数针对表达目的肽的宿主细胞，对编码基因产物的核苷酸序列进行了密码子优化。编码酶的核苷酸序列相对于宿主细胞中密码子使用的适应性可以用密码子适应指数(CAI)来表达。本文中的密码子适应指数被定义为在特定宿主细胞或有机体内的基因的密码子使用相对于高表达基因的密码子使用的相对适应性的量度。各个密码子的相对适应性(w)是各个密码子的使用和对于相同氨基酸的最常用的密码子的使用之间的比值。CAI指数被定义为相对适应性值的几何平均值。非同义密码子和终止密码子(依赖于遗传编码)不计算在内。CAI值的范围从O至1，具有较高的CAI值说明具有较高比例的最常用的密码子(参见Sharp and Li, 1987, Nucleic AcidsResearch J_5:1281-1295;还可参见 Kim et al. , Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede etal. , Journal of Virology, 2000，74:2628-2635)。优选地，编码目的基因产物的核苷酸序列的 CAI 至少是 O. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9 或 O. 95。在一种实施方式中，当最终目标不是生产目的多肽，而是RNA分子例如用表达盒生产更大量的RNA时，可以使用本发明的核酸构建体，所述RNA可以用于调控其他基因(例如RNAi，反义RNA)、基因治疗、在体外生产蛋白质等。为了生产多聚体蛋白，可以使用两个或多个本发明的核酸构建体。例如两个表达盒可以均是多顺反子核酸构建体，各自用于编码不同的可筛选标记蛋白，从而有可能筛选两个表达盒。例如该实施方式对于表达轻链或重链免疫球蛋白例如抗体是有利的。显而易见的是，在两个核酸构建体被引入宿主细胞之前，它们可以位于一个核酸分子中或位于分离的核酸分子中。当两个核酸构建体被引入宿主细胞时，将它们置于一个核酸分子上的优势是两个核酸构建体以单一的预定比率(例如1:1)存在。另一方面，当两个核酸构建体被置于两个不同的核酸分子上，它们被引入宿主细胞时就有可能改变它们的摩尔比，如果优选的摩尔比不是1:1或预先不知道优选的摩尔比是多少时，这是有利的，从而本领域的技术人员能够容易的找到它们的变化并凭经验找到最佳摩尔比。根据本发明，优选至少一个核酸构建体，更优选每个核酸构建体至少包括一个优选包括两个本发明的核酸片段。在另一种实施方式中，单一表达构建体中含有不同的亚基或部分多聚体蛋白。WO2006/048459 (例如第40页)已经描述了和表达构建体相结合的有用的抗抑制因子的构型，通过引用的方式将其纳入本文。在优选的实施方 式中，目的基因产物是凝血因子例如因子VIII或因子VI1、干扰素和白介素，例如人干扰素-Y或治疗性的抗癌单克隆抗体例如赫赛汀(抗EGF受体)或阿瓦斯丁 (抗血管内皮生长因子(VEGF))或ΕΡ0。本发明的核酸构建体可以以双链DNA的形式存在，对于可筛选标记和编码目的基因产物的开放读码框具有编码链和非编码链，编码链与被翻译的RNA具有相同的序列，除了存在的T代替了 U。因此，AUG起始密码子在编码链中被ATG序列编码，含有与RNA中的AUG起始密码子相应的ATG序列的链被称为DNA的编码链。对本领域技术人员而言显而易见的是，起始密码子或翻译起始序列事实上存在于RNA分子中，但也可以认为它们同样存在于编码该RNA分子的DNA分子中；因此，无论本发明指的是起始密码子还是翻译起始序列，均包括相应的DNA分子，该DNA分子具有和RNA序列相同的序列但在所述DNA分子的编码链中T替代了 U,反之亦然，除非明确指明。换句话说，例如起始密码子是RNA中的AUG序列，而在DNA的编码链中相应的ATG序列也指的是本发明的起始密码子。同样可以借鉴到
'框内，编码序列，指的是RNA分子中的三联体(3个碱基)被翻译为氨基酸，但也认为是DNA分子的编码链中的相应的三核苷酸序列。优选地，本发明的核酸构建体所包括的在表达盒中应用的可筛选标记在真核宿主细胞中起作用，更优选地该标记在植物或动物宿主细胞中起作用，更优选地在脊椎动物宿主细胞中起作用，最优选地在哺乳动物宿主细胞中起作用。术语“可筛选标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语，在本文中用于描述在表达时可用来筛选含有(和/或表达)可筛选标记的细胞的任何基因实体。可筛选标记可以是显性的或隐性的或双向的。可筛选标记可以是编码产物的基因，它使得细胞表达耐筛选剂例如抗生素或除草剂的基因。可筛选标记可以编码例如筛选蛋白质，该蛋白质能够中和毒性筛选剂或使毒性筛选剂失活，并保护宿主细胞免受制剂致死效应或生长抑制的影响。在特定条件下其他可筛选标记能够补足细胞的生长抑制性缺陷。这种基因的实例包括使原养型转变为营养缺陷型菌株的基因。使用的术语“报告物”主要指的是可见标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、荧光素酶、⑶S等，以及nptll标记等。这种报告物被用来筛选表达可见标记的细胞(通过主动将表达标记的细胞和不表达标记的细胞分类)，例如使用突光激活细胞分选仪(FACS)筛选表达荧光标记蛋白的细胞。优选地，本发明的可筛选标记能够提供对筛选剂的致死和/或生长抑制影响的抗性。本发明使用的编码可筛选标记的核苷酸序列编码被用于筛选真核宿主细胞的蛋白质，例如相比于没有蛋白质表达的宿主细胞，由于宿主细胞中蛋白质的表达,为表达可筛选标记蛋白质的宿主细胞提供了生长优势。基于宿主细胞中被编码的可筛选标记蛋白质的表达，优选编码可筛选标记的核苷酸序列能够提供对筛选剂(例如抗生素)的抗性，而筛选剂能够引起不表达可筛选标记蛋白的宿主细胞的致死效应和/或生长抑制。因此，本发明的可筛选标记必须在真核宿主细胞中起作用，因而能够在真核宿主细胞中被筛选出来。满足这一标准的任何可筛选标记多肽基本上都可以在本发明中使用。当用于在真核宿主细胞中获得克隆时，这种可筛选标记在本领域中是已知的并是常规使用的，本文还提供一些实例。为了方便并通常被技术人员接受，在许多出版物以及本文中，通常编码可筛选标记的基因和引起耐筛选剂的可筛选标记分别被称为“(耐)筛选剂基因”或“(耐)筛选剂蛋白”，尽管官方名称不同，例如编码耐新霉素(以及G418和卡那霉素)的蛋白质的基因通常被称为(耐)新霉素(或neo')基因，然而官方名称是氨基糖苷3'-磷酸转移酶基因。在本发明的优选实施方式中，可筛选标记能够提供对筛选剂的致死效应或生长抑制效应的抗性，所述筛选剂选自以下组成的组中博莱霉素抗生素家族、嘌呤霉素、杀稻痕素、潮霉素(hygromycin)、氨基糖苷抗生素、氨甲蝶呤和氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulphoximine)。编码提供耐博莱霉素抗生素家族的可筛选标记的核苷酸序列是例如编码野生型“ble”基因的核苷酸序列，包括但不限于Sh ble、Tn5 ble和Sa ble或它们的变体。SEQID NO: 14记载了其实例。通常被ble基因编码的基因产物使得它们的宿主可以耐博莱霉素家族的铜螯合的糖肽 类抗生素，它是切割DNA的糖肽类。本发明中作为筛选剂使用的博莱霉素家族抗生素的实例包括但不限于博莱霉素、腐草霉素、他利霉素、培洛霉素和ZeocinTM。博莱霉素(Zeocin)作为筛选剂是特别有优势的，因为耐博莱霉素蛋白(博莱霉素-R)通过与药物相结合起作用从而使其变得无害。因此很容易通过滴定确定杀死具有低水平博莱霉素-R表达的细胞而使高表达子存活的药物的用量。大多数(即使不是全部)常用的其他耐抗生素可筛选标记都是酶，因此它们都是以催化的方式起作用(也就是说酶和筛选剂的化学计量不是特定的，例如为1:1)。因此，抗生素博莱霉素是优选的可筛选标记。编码提供耐氨基糖苷类抗生素的可筛选标记的核苷酸序列是例如编码野生型氨基糖苷类3,-磷酸转移酶的核苷酸序列或其变体。本发明的氨基糖苷类是通常已知的氨基糖苷类抗生素(Mingeot-Leclercq, M. et al. , 1999, Chemother. 43:727-737),它至少包括一个通过糖苷键和其他半数分子相结合的氨基-吡喃糖或氨基-呋喃糖部分。它们的抗生素的影响基于抑制蛋白质的合成。本发明作为筛选剂使用的氨基糖苷类抗生素的实例包括但不限于卡那霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、G418 (遗传霉素)、新霉素B (弗氏囷丝素)、紫苏霉素、丁胺卡那霉素、异帕米星等。本发明中可以使用的可筛选标记的其他实施例是DHFR、胱硫醚Y -裂解酶和谷氨酸合成酶(GS)基因。使用这些类型的代谢酶作为可筛选标记多肽的潜在优势是能够将它们用于使宿主细胞保持连续的筛选，这在特定环境下是有利的。通过氨甲蝶呤，尤其是通过增加氨甲蝶呤细胞的浓度来筛选DHFR基因，可以筛选DHFR基因以增加DHFR基因的拷贝数。DHFR基因也可以被用来弥补DHFR缺陷，例如具有DHFR-表型的CHO细胞中，含有叶酸而缺乏甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基中。如果可筛选标记是DHFR，在有利的实施方式中，用含有叶酸的培养基培养宿主细胞，该培养基基本上缺乏次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，优选还缺乏甘氨酸。通常，本文中的术语“培养基基本上缺乏”指的是在培养基中维持细胞生长的指定组分的不足，从而，当指定酶的遗传信息在细胞中被表达，且指定前体组分在培养基中存在时，进行好的筛选是可能的。优选培养基中不含指定组分。缺乏指定组分的培养基可以根据标准方法由本领域技术人员制备，或从培养基供应商处获得。通过不含谷氨酰胺的培养基培养的缺乏GS (例如NS-O细胞)的细胞中，或通过添加GS抑制剂、氨基亚砜蛋氨酸(MSX)而缺乏GS (例如CHO细胞)的细胞中，筛选谷氨酰胺合成酶(GS)基因例如野生型人或小鼠谷氨酰胺合成酶基因是可能的。胱硫醚Y -裂解酶(EC 4. 4.1.1)是合成氨基酸L-半胱氨酸重要的酶。CHO细胞是用于将胱硫醚转化为半胱氨酸的天然的营养缺陷体。因此，可以利用例如来自小鼠或人的胱硫醚Y -裂解酶(cys-裂解酶)基因通过在不含L-半胱氨酸和L-胱氨酸的培养基中培养细胞借助互补作用来筛选细胞。基于cys-裂解酶标记的筛选可能需要培养基中存在无毒性前体L-胱硫醚。在一些脊椎动物细胞系中作为可筛选标记使用的cys-裂解酶可能首先需要内源性胱硫醚Y-裂解酶基因的失活(敲除)。可以在本发明的内容中使用的其他可筛选标记和它们的筛选剂如US5，561，053的表I中所描述，通过引用将其并入本文；Kaufman，MethodsinEnzymology, 185:537-566(1990)也总结了这些可筛选标记和它们的筛选剂。在优选的实施方式中，本发明的核酸构建体中的表达盒包括是严格可筛选标记的可筛选标记。本文的严格可筛选标记应被理解为是需要在表达标记的待筛选的宿主细胞(即希望从筛选中存活的宿主细胞)中被高水平地转录(和/或表达)的可筛选标记。在本发明中，优选地，可筛选标记的严格性至少能够被下列因素之一增强a)降低可筛选标记的翻译(起始)效率，和b)降低可筛选标记多肽的活性和/或效率。因此，本发明的核酸构建体中的表达盒优选含有编码可筛选标记的核苷酸序列，该核苷酸序列至少是下列核苷酸序列其中之一a)在起始密码子中具有突变的核苷酸序列，该突变能够降低可筛选标记多肽在真核宿主细胞中的翻译起始效率； b)作为多顺反子转录单元一部分的核苷酸序列，所述多顺反子转录单元含有i)编码可筛选标记的核苷酸序列；和ii)含有在5'至3'方向上的翻译起始密码子、至少一个氨基酸密码子和翻译终止密码子的功能性开放读码框；其中所述功能性开放读码框的终止密码子位于编码可筛选标记的核苷酸序列的独立翻译起始密码子的上游的0-250个核苷酸处，其中分隔功能性开放读码框的终止密码子和编码可筛选标记的核苷酸序列的独立翻译起始密码子的序列缺乏翻译起始密码子；以及c)含有突变的编码可筛选标记多肽的核苷酸序列，该突变编码至少一个氨基酸置换(amino acid change),与其相应的野生型相比,可筛选标记多肽的活性降低。在(翻译)起始密码子(次优的非AUG起始密码子)中具有突变的编码可筛选标记的核苷酸序列降低了真核宿主细胞中的可筛选标记多肽的翻译起始效率，这是本领域已知的(参见例如WO 2007/096399)。本文中的非ATG(非AUG)起始密码子应当理解是在起始密码子中具有突变的翻译起始密码子，这降低了真核宿主细胞中可筛选标记多肽的翻译起始效率。本发明可用于编码可筛选标记序列的非ATG起始密码子的实例包括例如GTG、TTG、CTG、ATT和ACG。在优选的实施方式中，ATG起始密码子突变为GTG起始密码子。更优选地，ATG起始密码子突变为TTG起始密码子，它提供了比GTG起始密码子更低表达水平的可筛选标记多肽。当使用非ATG起始密码子时，优选非ATG起始密码子存在于最有利于翻译起始密码子的环境中，例如下文定义的Kozak共有序列。当将非ATG起始密码子应用到可筛选标记时，编码可筛选标记的核苷酸序列可以发生突变而缺乏内在ATG密码子，尤其缺乏非ATG起始密码子框内的内在ATG密码子。优选在构建体中可筛选标记位于编码目的基因产物的核苷酸序列的上游，并且在编码目的基因产物的序列和标记之间没有使用IRES。W02006/048459公开了如何实现(例如通过置换、插入或缺失，优选置换)和如何测试获得的可筛选标记多肽的功能性。以上b)所述的降低翻译起始效率的第二项，在可筛选标记的翻译起始密码子之前直接使用了(短的)功能性开放读码框(ppx，其中PPx是X个氨基酸残基的小肽)。功能性开放读码框(PPx)的长度是可以变化的，目的是微调低水平的可筛选标记多肽的翻译效率，从而获得理想的精确的严格筛选水平。因此，功能性开放读码框可以编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80 或 90 个氨基酸残基(在Y端具有起始密码子，在V端具有终止密码子)，优选编码至多200、180、160、150、140、130、120、110、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91 或 90 个氨基酸残基(在 5'端具有起始密码子，在3'端具有终止密码子)。因此，通过改变功能性开放读码框(PPx)的长度，转录过程中直接在编码可筛选标记的序列之前，提供了可筛选标记的翻译效率的连续变化范围。功能性开放读码框(PPx)可以直接位于独立的可筛选标记的起始密码子的上游，在这种情况下，功能性开放 读码框的起始密码子直接与编码可筛选标记的序列的起始密码子相邻。另外，功能性开放读码框(PPx)的上游终止密码子和编码可筛选标记的序列的起始密码子可以相隔 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250个以上的核苷酸。分隔功能性开放读码框(ppx)的上游终止密码子和编码可筛选标记的序列的起始密码子的间隔序列的长度的变化进一步增加了可筛选标记的翻译效率的微调水平。分隔功能性开放读码框(PPx)的终止密码子和编码可筛选标记的核苷酸序列的独立翻译起始密码子的间隔序列缺乏翻译起始密码子。因此优选所述间隔序列缺乏ATG密码子。更优选所述间隔序列还缺乏次优非ATG密码子例如嵌入在Kozak序列(如下所述)中的GTG、TTG、CTG、ATT和ACG (如下所述)。最优选所述间隔序列缺乏任一的ATG、GTG、TTG、CTG、ATT和ACG密码子。在另一个优选的实施方式中，分隔功能性开放读码框(PPx)的终止密码子和编码可筛选标记的核苷酸序列的独立翻译起始密码子的间隔序列缺乏终止密码子，也就是缺乏TAA、TAG和TGA密码子。在优选的实施方式中，编码可筛选标记的核苷酸序列和功能性开放读码框(ppx)的翻译起始密码子中的至少一个是ATG密码子。更优选地，至少编码功能性开放读码框(PPx)的核苷酸序列的起始密码子是ATG密码子，在这种情况下，编码可筛选标记的核苷酸序列的起始密码子可以是非ATG起始密码子(也被称为次优或不太有利的翻译起始密码子)，目的是允许更加严格的筛选(如上所述)。最优选地，编码可筛选标记的核苷酸序列和功能性开放读码框(PPx)的翻译起始密码子都是ATG密码子。然而，本发明不排除编码功能性开放读码框(PPx)的核苷酸序列的起始密码子是非ATG起始密码子。在一种实施方式中，编码可筛选标记的核苷酸序列和功能性开放读码框(PPx)的起始密码子中的至少一个被嵌入到Kozak共有序列中。本文中将Kozak共有序列(脊椎动物宿主细胞)定义为 ANN (AUG)N (SEQ IDN0:11)和 GNN (AUG) G (SEQ ID NO: 12)，其中(AUG)代表了相关编码序列的起始密码子。优选在(AUG)之前的N’ s是C’ S。更优选的Kozak共有序列是GCCRCC(AUG)G(SEQ ID NO: 13)，其中R是嘌呤。在另一个优选的实施方式中，Kozak共有序列之前还可以存在另一个GCC三联体。优选的上游带有功能性开放读码框(ppx)的可筛选标记为例如ρρ9°ΖΕ0 (编码新霉素抗性蛋白前面的90个氨基酸的ppx开放读码框；pp9°编码序列如SEQ ID NO: 15所示)。在一种实施方式中，择一实施或组合使用以上a)或b)所述的降低翻译起始效率的方法，也可以有利于提供可筛选标记多肽的降低的翻译延伸效率。例如可以通过改变编码可筛选标记多肽的序列，从而降低所讨论宿主细胞中密码子使用的适应性来实现。这就再次提供了进一步控制本发明核酸构建体的筛选严格性水平。因此，编码可筛选标记蛋白的核苷酸序列优选能够适应所讨论宿主细胞中的次优密码子使用。优选地，适应本发明的核苷酸序列的密码子具有不超过O. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3或O. 2的CAI (见以上有关CAI的定义)。在一种实施方式中，择一实施或组合实施以上a)或b)所述的具有降低的翻译起始效率的可筛选标记的实施方式，根据本发明，可以使用适当的可筛选标记的突变体或衍生物，因此只要可筛选标记仍然起作用，它们便在术语“可筛选标记”的范围内。优选地，可筛选标记的突变体或衍生物与它相应的野生型相比，可筛选标记的活性降低，从而使得可以进一步微调本发明核酸构建体筛选严格性的控制水平。择一实施或组合实施一个或多个其他实施方式，在优选的 实施方式中，编码可筛选标记的核苷酸序列编码可筛选标记多肽，该可筛选标记多肽包括一个或多个(共同地)能够降低可筛选标记多肽活性(与它相应的野生型相比)的突变。突变的可筛选标记多肽的活性可以为其相应的野生型活性的90、80、70、60、50、40、30、20、10、5 或 1% 以上。作为非限制性的实例，博莱霉素抗性多肽中第9位的脯氨酸可能突变为例如Thr或Phe (参见例如WO 2006/048459的实施例14，通过引用将其引入本文)，对于新霉素抗性多肽，第182或261位的氨基酸残基或第182和261位的氨基酸残基可发生突变(参见例如TO 01/32901)。优选的具有降低活性的可筛选标记多肽是具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的博莱霉素抗性多肽，其中第21位的谷氨酸变为甘氨酸，第76位的丙氨酸变为苏氨酸
/ V EPP5 \
CZeo J0特别优选的严格可筛选标记是PP8ZEOepp5,它结合了 8个氨基酸的开放读码框ppx和具有降低的活性的ZeoEPP5博莱霉素抗性蛋白。PP8ZEOepp5的序列如SEQ ID NO: 16所示。本发明的核酸构建体优选被包括在质粒中或所述表达构建体可以是质粒。使用本领域技术人员已知的方法能够容易地操作质粒，例如被设计为能够在原核和/或真核细胞中复制。或者，核酸构建体可以是载体。许多载体可以直接或以所需的分离片段的形式用于真核细胞的转化，并可整体或部分地整合到这些细胞的基因组中，从而获得在其基因组中含有所需核酸的稳定的宿主细胞。常规的表达体系是重组质粒或重组病毒基因组形式的DNA分子。通过本领域已知的方法将质粒或病毒基因组引入(真核宿主)细胞中，优选地整合到它们的基因组中，WO2006/048459 (例如第30-31页)中已经描述了一些有关的方面，通过引用将其纳入本文。在一种实施方式中，本发明的核酸构建体含有附加的可筛选标记，例如如前所述的DHFR代谢可筛选标记。这种核酸构建体的优势是通过使用与IRES可操作地连接的可筛选标记例如博莱霉素、新霉素等，能够实现对具有闻表达的宿主细胞的筛选，从而在筛选出具有高表达的宿主细胞后，停止抗生素的筛选，再使用附加的可筛选标记进行连续的或间歇的筛选。本实施方式中的多顺反子转录单元至少是三顺反子。优选使用分离的核酸构建体来表达不同的目的基因产物，当需要这些产物来形成多聚体蛋白的各部分时也是如此(参见例如WO 2006/048459的实施例13，通过引用将其纳入本文)抗体的每个重链和轻链由本发明分离的转录单元所编码。根据本发明，当本发明的两个转录单元在单个的宿主细胞中被筛选出来时，优选每个转录单元含有用于不同可筛选标记的编码序列，促使两个转录单元的筛选。当然，两个转录单元可以都存在于单个核酸分子中或每一转录单元可以存在于分离的核酸分子中。
第三方面，本发明涉及一种含有本发明的核酸构建体的表达载体或表达构建体。第四方面，本发明涉及一种含有本发明的核酸构建体或本发明的表达载体的宿主细胞，优选真核宿主细胞。术语“细胞”或“宿主细胞”和“细胞系”或“宿主细胞系”分别被定义为细胞或它们的同源群体，可以通过本领域已知的方法将它们在培养基中培养，并具有表达异源或同源蛋白质的能力。宿主是真核宿主细胞，例如真菌、植物或动物来源的细胞。优选地，宿主细胞是昆虫或脊椎动物来源的动物细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是细胞系的细胞。WO 2006/048459 (例如第41-42页)已经描述了可以使用的宿主细胞的一些示例，通过引用将其纳入本文，这样的细胞包括例如哺乳动物细胞，包括但不限于CHO 细胞，例如 CHO-Kl、CHO-S、CH0-DG44、CH0-DG44-S、CH0-DUKXBI I，包括具有 dhfr-表型的CHO细胞，以及骨髓瘤细胞(例如Sp2/0，NS0)、HEK293细胞、HEK294细胞和PER. C6细胞。可以使用的宿主细胞的其他实例是U-2 OS骨肉瘤、HuNS-1骨髓瘤、WER1-Rb-1视网膜母细胞瘤、BHK、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0_Ag 14、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO和NC1-H295R肾上腺癌细胞系。这样的真核宿主细胞能够表达所需的基因产物，并经常被用于上述目的。优选以本发明的表达构建体、表达盒或表达载体的形式将本发明的核酸构建体引入细胞中可以获得这样的真核宿主细胞。优选将核酸构建体整合到宿主细胞的基因组中，可以整合到各种宿主细胞的不同位置，筛选将提供克隆，在其中转基因被整合到适当的位置，依据表达水平、稳定性、生长特性等方面性质得到具有所需属性的宿主细胞克隆。或者，不含启动子的核酸构建体可以被定向或随机选择地整合到具有转录活性的染色体区域，例如基因组中存在的启动子之后。可以使用本领域技术人员已知的常规方法，通过筛选可筛选标记多肽来进行含有本发明的DNA的细胞的筛选。当将这种不含启动子的核酸构建体整合到基因组的启动子之后时，本发明的核酸构建体能够在原位产生，也就是在宿主细胞的基因组内产生。优选地，宿主细胞来自稳定的克隆，可以根据本领域技术人员已知的标准流程来筛选和繁殖该克隆。如果细胞含有本发明的多顺反子转录单元，这种克隆的培养物能够生产目的基因产物。可以通过几种方法之一来引入将要在细胞中表达的核酸，这些方法是本领域技术人员已知的，也依赖于待引入的核酸的形式。所述方法包括但不限于转染、感染、注射、转化等。可以通过筛选来获得适当的表达目的基因产物的宿主细胞。在优选的实施方式中，本发明的核酸构建体被整合到本发明的真核宿主细胞的基因组中。这将赋予核酸构建体稳定的遗传性。第五方面，本发明涉及一种生产用于表达目的基因产物的宿主细胞的方法，其中，该方法包括以下步骤a)将本发明的核酸构建体或本发明的表达载体引入多个宿主细胞中；b)在能够筛选表达可筛选标记多肽的条件下培养从a)中获得的多个宿主细胞；和c)筛选至少一个表达可筛选标记多肽的宿主细胞，用于表达目的基因产物。
`
这一方法的优势和WO 2006/048459 (例如第46_47页)中公开描述的方法的优势相似，通过引用将其纳入本文。当能够获得具有相对低拷贝数的核酸构建体和高表达水平的克隆时，可以将本发明的筛选体系与扩增方法结合从而进一步改进表达水平。例如这可以通过使用氨甲蝶呤扩增共-整合的DHFR基因来实现，例如将DHFR置于与本发明的多顺反子转录单元相同的核酸分子上，或当DHFR在分离的DNA分子上时使用共转染。DHFR基因也可以是本发明核酸构建体的一部分或是本发明表达载体的一部分。筛选存在的可筛选标记多肽并用于表达的过程可以在最初获得宿主细胞的过程中进行。在某个实施方式中，筛选剂至少在培养过程的部分时间中存在于培养基中，可以以足够的浓度或以较低的浓度来筛选表达可筛选标记的细胞。第六方面，本发明涉及一种表达目的基因产物的方法，该方法包括培养含有本发明核酸构建体或本发明载体的宿主细胞、本发明的宿主细胞或根据本发明的方法获得的宿主细胞，以及从核酸构建体中表达目的基因产物。在优选的实施方式中，在生产目的基因产物的最后阶段过程中，筛选剂不再存在于培养基中，从而能够避免可能存在的微量毒性筛选剂污染基因产物的任何风险。在某些实施方式中，本发明的表达载体编码免疫球蛋白重链或轻链或抗原结合部分，以及它们的衍生物和/或类似物。在优选的实施方式中，提供了根据本发明的蛋白表达单元，其中所述目的蛋白是免疫球蛋白重链。在另一个优选的实施方式中，提供了根据本发明的蛋白表达单元，其中所述目的基因产物是免疫球蛋白轻链。当这两个蛋白表达单元存在于相同的(宿主)细胞中时，可组装成多聚体蛋白特别是免疫球蛋白。因此，在某个实施方式中，目的蛋白是免疫球蛋白例如抗体，它是多聚体蛋白。优选地，这种抗体是人或人源化抗体。在某个实施方式中，它是IgG、IgA或IgM抗体。免疫球蛋白可以在不同的表达载体上或在单一表达载体上编码重链和轻链。因此，各个重链和轻链可以存在于分离的表达载体上，各自都具有它自己的启动子(两个表达载体可以相同或不同)，各自都含有根据本发明的转录单元，重链和轻链是目的基因产物，优选各自编码不同的可筛选标记蛋白，以使得当表达载体被引入和/或存在于真核宿主细胞时，能够进行重链和轻链表达载体的筛选。或者，编码重链和轻链的序列可以存在于根据本发明的含有多顺反子转录单元的单一表达载体上，由单个启动子驱动，其中轻链和重链是它们各自的编码序列之间具有IRES的目的
基因产物。对细胞进行培养，以使得它能够代谢和/或生长和/或分裂和/或产生目的基因产物。这可以通过本领域技术人员已知的方法来实现，包括但不限于给细胞提供营养。所述方法包括表面粘附生长、悬浮生长或它们的组合。使用批量(batch)、分批补料(fed-batch)、连续系统例如灌注系统等，例如可以在培养皿、摇瓶或生物反应器中完成培养。为了通过细胞培养大规模(连续)生产重组基因产物，本领域优选细胞能够悬浮生长，优选地，细胞能够在缺乏动物或源自人的血清或缺乏动物或源自人的血清组分的条件下进行培养。生长或增殖细胞的条件(如Tissue Culture, Academic Press, KruseandPaterson, editors (1973)所述)和表达重组产物的条件是本领域技术人员所公知的。总体而言，使哺乳动物细胞培养的生产能力达到最大化的原理、方案和实用技巧在Ma_alianCell Biotechnology:a Practical Approach(M. Butler, ed. , IRL Press, 1991)中有记载。在优选的实施方式中，根据本发明的表达目的基因产物的方法进一步包括收获目的基因产物。可以收获、从细胞或从培养基、或从细胞和培养基中收集或分离表达的基因产物例如蛋白质。然后使用已知的方法将其纯化，例如过滤、柱色谱法等，通常使用本领域技术人员已知的方法。 除非另外说明，本发明的操作使用的是免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些是本领域的常规技术。例如参见Sambrook, Fritschand Maniatis，Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989;CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel FM，et al，eds，1987;the series Methods inEnzymology(Academic Press,Inc. );PCR2:APractical Approach, MacPherson MJ，HamsBDj Taylor GRj eds, 1995;Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow and Lane，eds，1988.。下面的实施例进一步解释了本发明。实施例不以任何方式限制本发明，它们仅仅用来说明本发明。在本说明书和它的权利要求中，使用动词“含有”和它的词形变化形式非限制性指的是包括以下所述的项目，但没有特别提到的项目并不排除在外。另外，涉及被不定冠词“一”或“一个”修饰的要素，并不排除一个以上要素存在的可能性，除非上下文明显另有所指是一个或只有一个要素。因此不定冠词“一”或“一个”通常指的是“至少一个”。通过引用将本说明书中引用的所有专利和参考文献将其整体纳入本文。下面的实施例仅以说明为目的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
图1.筛选在严格筛选体系中能够增加克隆形成的片段的基因的基因组结构。图1显示了起始转录位点上游的6个 3500bp DNA延伸，以及基因编码区域的 3500bp的DNA延伸，覆盖了用于每个基因座的在相应mRNA(被称为Z)中的起始翻译位点。仅包括非编码DNA的6个上游DNA延伸被称为A到F。图2.在严格筛选体系中，能够诱导出比STAR元件更多的克隆的基因组序列。
CH0-DG44细胞被3 μ g DNA构建体转染，使用TTG-Zeo (如图2A所示)或pp8-Ze0-EPP5(如图2B所示)作为可筛选标记。对于阴性对照，没有序列被引入作为元件X。对于阳性对照，使用STAR 7/67作为5'端的元件X，使用STAR 7作为3'端的元件X。图1中不同DNA的延伸被用作如本文所述的元件X。在含有400μ g/ml博莱霉素的培养基中进行筛选，转染24小时后添加博莱霉素。培养基由HAMF 12:DMEM=1:1+4. 6%的胎牛血清组成。大约两周后可以计算稳定产生了的克隆数。图3. RblE, RblF和pl5C诱导出与STAR元件相等的或比STAR元件高的GFP表达水平。在含有如图2所述的DNA构建体的稳定克隆中测定d2EGFP的表达水平。相对荧光水平的结果用任意单位表示。用直线表示每个构建体的d2EGFP的平均表达水平。用粗线表示本文中TTG Zeo筛选体系的STARs7/67/7诱导的615的d2EGFP的平均表达水平。图4. RblE和P15C元件不具有启动子活性。通过用RblE或pl5C元件代替β -肌动蛋白启动子，修饰了含有STARs7/67/7和β -肌动蛋白启动子的构建体。这就产生了含有Rb IE和P15C元件的构建体，其中所述元件被直接置于TTG Zeo d2EGFP表达盒的上游。作为对照，使用如图2所示的含有β-肌动蛋白启动子构建体。我们将构建体转染到CH0-DG44细胞上并测定d2EGFP瞬时值(transientd2EGFP values)。图4A显示了 d2EGFP相对瞬时值。图4B显示了稳定的博莱霉素抗性克隆数。图5. RblE和pl5C元件不是增强子。 制备了如图5所示的构建体。RblE或pl5C元件被置于结合有TTGZeo_d2EGFP基因SV40最小启动子的上游。作为对照，肌动蛋白启动子被置于TTG Zeo-d2EGFP基因的上游。在另一个对照中，SV40最小启动子被置于TTG Zeo-d2EGFP基因的上游。图5显示了不同构建体的d2EGFP相对瞬时值。图6. RblE和pl5C元件不反式(in trans)影响内源性Rbl和pl5启动子的转录。图6显示了与野生型CH0-DG44相比的Rbl/肌动蛋白相对信号和pl5/肌动蛋白相对信号。肌动蛋白和Rbl mRNA水平的比率或β-肌动蛋白和pl5 mRNA水平的比率由实时PCR测定。对每个元件的4个独立的克隆进行了比较。图7. RblE和pl5C元件不具有STAR活性。图7A显示了如果元件具有或不具有STAR活性时会发生什么情况的示意图。简而言之，所述元件被置于靶向LexA-HPl抑制因子和博莱霉素筛选基因之间。当元件不具有STAR活性时，HPl介导的基因抑制将使得博莱霉素可筛选标记基因沉默。随后在培养基中添加博莱霉素将导致细胞死亡。另一方面，当元件具有STAR活性时，HPl介导的基因抑制没有强大到足以使博莱霉素可筛选标记沉默。随后在培养基中添加博莱霉素将导致这些细胞能够存活下来。图7B显示了人细胞系的U2-0S细胞存活的结果(HumanOsteosarcoma CellIine1ATCC HTB-96;described in Heldin, CH, et al. 1986, Nature 319:4511-514)。图8和9. RblE元件和pl5C元件是基因间转录的来源。为了测定基因间的转录是否和RblE和pl5C元件有关，针对RblE和pl5C基因组元件设计了 4个引物对。使用随机六聚体，从U2-0S细胞中分离的总RNA制备cDNA。使用实时PCR在整个转录测试区域内测定RNA的水平是否提高。实时PCR反应针对由U2-0S细胞制得的cDNA进行。作为对照，使用总RNA (cDNA根据其制得)作为实时PCR反应的样品。RNA或cDNA样品的各自信号水平的差别被用作基因间转录的水平的量度。图8显示了 RblE引物的结果。图9显示了 pl5C引物的结果。图10.含有RblE或STAR元件的克隆的拷贝数。图11. RblE和pl5C针对不同的启动子起作用。图11显示了在被构建体转染后的博莱霉素抗性克隆中的d2EGFP的平均荧光水平，如图11的示意图所示，该构建体含有CMV启动子。图上方示出了被诱导产生的克隆的数量。图12. RblE和pl5C特定组合能够诱导最佳克隆数和蛋白质表达水平。图12显示了稳定的博莱霉素抗性克隆的数量，其中克隆被图12示意图所示的构建体转染，X轴表示元件X和元件Y。图13. RblE和P15C特定组合能够诱导最佳克隆数和蛋白质表达水平。图13显示了图12所示细胞的d2EGFP的平均荧光水平。图14.对RblE和pl5C区域内的最高活性的测试。图14显示了被图14示意图所示的构建体转染后的稳定的博莱霉素抗性克隆的数量,其中元件X是完整的RblE或pl5C元件或是它们的一部分。图15.对RblE和pl5C区域内的最高活性的测试。图15显示了图14所示细胞的d2EGFP的平均荧光水平。图16.对RblE和RblF区域内及其组合的稳定的克隆数的测试。下面的片段被用来测试它们产生的稳定的克隆数RblE: 1-3498、1-2018、1-1482、1-1019、1-479、479-2018、1019-2018,1482-2018,479-1482 ;RblF:1-3424、1_2425、2425_3424 ；Rb1E/RbIF:2425-3424 (RblF)-1-2018(RblE)。图17.对RblE和RblF区域内及其组合的活性的测试。下面的片段被用来测试它们产生的稳定的克隆数:RblE: 1-3498、1-2018、1-1482、1-1019、1-479、479-2018、1019-2018、1482-2018、479-1482 ；RblF:1-3424,1-2425,2425-3424；RblE/RblF:2425-3424(RblF)-1-2018(RblE)。图18. RblE和pl5C诱导高EPO蛋白质表达水平。显示了在被如示意图所示的构建体转染的细胞中实现的EPO生产水平。EPO报告基因由β_肌动蛋白启动子控制。使用PP8ZeoEPP5变体作为可筛选标记。图18A显示了特异性EPO活性(pg/细胞/天)。图18B显示了 EPO的体积产量(pg EPO/天)。
具体实施例方式实施例1.实施例1 :筛诜特定的基因组基因座，以找到能够产牛与STAR元件相等的稳定转染克隆或能够产生比STAR元件更多的稳定转染克隆的序列。当CH0-DG44被含有严格可筛选标记(例如在它的翻译起始密码子处被修饰的博莱霉素抗性标记)的质粒转染时，仅出现少量克隆或没有克隆出现。特别是当博莱霉素抗性标记含有TTG翻译起始密码子和在人β-肌动 蛋白启动子(SEQ ID NO: 17)(如图2Α所示)控制下时更是如此。然而，当整个表达盒两侧均连接有STAR元件时，就会出现多得多的克隆，当将400 μ g/ml博莱霉素添加到CH0-DG44培养基中时，克隆数的范围是50-100/转染(例如图2A所示)。通常，产生的克隆能够产生高蛋白表达水平。本文试图识别这样的基因组序列在相同筛选条件下，所述基因组序列能够产生至少和STAR元件一样多的CH0-DG44克隆。因此，我们使用的博莱霉素抗性标记和STAR元件所使用的博莱霉素抗性标记相同，即TTG Zeo0将表达盒置于人β-肌动蛋白启动子(图2A所示)的控制之下。选择三个人基因的基因组基因座Rbl、pl5和ρ13。使用BAC克隆作为模板通过PCR分离基本上相同长度的DNA的延伸Γ350(Λρ)。对于Rbl、pl5和p73，这些BAC克隆的数量分别为RP11-136N2、RP11-478M20和RP5-1092A11 (从BacPAC来源中心-BPRC获得)。对每一个基因座，我们分离和分析了 6个 3500bp的转录起始位点的上游DNA延伸，以及基因编码区域的 3500bp的DNA延伸，涵盖了相应的mRNA (被称为Z)的翻译起始。仅含有非编码DNA的6个上游DNA延伸被称为A至F(图1所示)。表I中给出了特异性引物系列。克隆了特定的DNA延伸以使其处于含有人肌动蛋白启动子、TTG Zeo抗性基因和d2EGFP报告基因的构建体的两侦U。在分离的DNA序列上进行短DNA测序(run)以证实分离到了目的序列。这已经被证实了。作为对照构建体，我们使用了不含任何侧翼DNA元件的相同构建体和表达盒上游含有STARs 7 和 67 (W0 2007/096399 公开)以及表达盒下游含有 STAR 7 (W0 2007/096399 公开)的相同构建体(图2A所示)。表I用于分离基因组元件的引物系列(5’——>3’方向)
权利要求
1.一种核酸片段，该核酸片段包括a)位于脊椎动物Rbl基因的翻译起始位点上游的基因组区域的1000至15000个连续核苷酸；或，b)位于脊椎动物pl5基因的翻译起始位点上游10.5至7千碱基位置的基因组区域的至少1500个连续核苷酸；其中，在实施例1的条件下进行测试，所述片段当与具有SEQ ID N0:9的核苷酸序列的表达盒直接在表达盒的上游位置和下游位置侧面连接时，与在表达盒的上游侧面连接STAR 7和STAR 67且在表达盒的下游侧面连接STAR 7的相同表达盒(SEQ ID NO: 10)相比，至少产生50%的克隆数。
2.根据权利要求1所述的核酸片段，其中，所述片段的全长与SEQIDN0:l-4或8中的至少一个的至少1000个连续核苷酸具有至少80%的核苷酸序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的核酸片段，其中，所述片段来自人、小鼠、大鼠、仓鼠、牛、 鸡、犬、豚鼠、猪或兔的基因组。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的核酸片段，其中，所述核酸片段的全长与含有下列核苷酸残基的片段具有至少80%的核苷酸序列同一'丨生a)SEQ ID NO: 5 的 1-1019、1-1482、1-2018、1_3498、479_2018 或 479-1482 的核苷酸残b)SEQ ID NO:6 的 1-2448、1-3424 或 2425-3424 的核苷酸残基；c)SEQ ID NO:7 的 1-3064、1-2500 或 1-2000 的核苷酸残基；和d)SEQ ID NO:8 的 1-1500,822-3352 或 1-3352 的核苷酸残基。
5.—种核酸构建体，该核酸构建体含有根据权利要求1-4中任意一项所述的核酸片段，其中，所述片段至少和一个核苷酸连接，所述核苷酸在所述片段来源的基因组中不直接与所述片段发生天然连接。
6.根据权利要求5所述的核酸构建体，其中，所述核酸片段连接有表达盒，所述表达盒含有与编码目的基因产物的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中，所述构建体含有位于所述表达盒上游和下游的根据权利要求1-4中任意一所述的核酸片段。
8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其中，表达盒上游的核酸片段和表达盒下游的核酸片段不同。
9.根据权利要求6-8中任意一项所述的核酸构建体，其中，所述表达盒进一步含有在真核宿主细胞中具有功能的编码可筛选标记的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其中，所述可筛选标记能够提供对筛选剂的致死效应或生长抑制效应的抗性，所述筛选剂选自以下组成的组中博莱霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素、潮霉素、新霉素、氨甲蝶呤、氨基亚砜蛋氨酸和卡那霉素。
11.根据权利要求9或10所述的核酸构建体，其中，所述编码可筛选标记的核苷酸序列至少是下列核苷酸序列其中之一a)在起始密码子中具有突变的核苷酸序列，该突变能够降低可筛选标记多肽在真核宿王细胞中的翻译起始效率；b)作为多顺反子转录单元一部分的核苷酸序列，所述多顺反子转录单元含有i)编码可筛选标记的核苷酸序列；和ii)含有在5'至3'方向上的翻译起始密码子、至少一个氨基酸密码子和翻译终止密码子的功能性开放读码框；其中所述功能性开放读码框的终止密码子位于编码可筛选标记的核苷酸序列的独立翻译起始密码子的上游的0-250个核苷酸处，其中分隔功能性开放读码框的终止密码子和编码可筛选标记的核苷酸序列的独立翻译起始密码子的序列缺乏翻译起始密码子；以及c)含有突变的编码可筛选标记多肽的核苷酸序列，该突变编码至少一个氨基酸置换， 与其相应的野生型相比，可筛选标记多肽的活性降低。
12.根据权利要求9-11中任意一项所述的核酸构建体，其中，编码可筛选标记的核苷酸序列和编码目的基因产物的核苷酸序列存在于单个多顺反子转录单元中，其中所述多顺反子转录单元与启动子和位于多顺反子转录单元下游的转录终止序列可操作地连接。
13.根据权利要求6-12中任意一项所述的核酸构建体，其中，所述启动子是β-肌动蛋白启动子、CMV启动子、SV40启动子、泛素C启动子或EFl- α启动子。
14.一种表达载体,该表达载体含有根据权利要求1-4中任意一项所述的核酸片段或根据权利要求5-13中任意一项所述的核酸构建体。
15.—种宿主细胞，该宿主细胞含有根据权利要求5-13中任意一项所述的核酸构建体或根据权利要求14所述的表达载体。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是植物细胞或哺乳动物细胞。
17.根据权利要求15或16所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是细胞系的细胞。
18.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中，所述细胞系选自以下组成的组中U-20S 骨肉瘤、CH0、CH0-K1、CH0-DG44、CH0-DG44-S、PER· C6、HEK 293, HuNS-1 骨髓瘤、WER1-Rb-1 视网膜母细胞瘤、BHK、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0_Ag 14、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO 和NC1-H295R肾上腺癌细胞系。
19.一种生产用于表达目的基因产物的宿主细胞的方法，其中，该方法包括以下步骤a)将根据权利要求5-13中任意一项所述的核酸构建体或根据权利要求14所述的表达载体引入多个宿主细胞中；b)在能够筛选表达可筛选标记多肽的条件下培养从a)中获得的多个宿主细胞；和c)筛选至少一个表达可筛选标记多肽的宿主细胞，用于表达目的基因产物。
20.—种表达目的基因产物的方法,该方法包括培养根据权利要求15-18中任意一项所述的宿主细胞或根据权利要求19所述的方法获得的宿主细胞，以及从核酸构建体中表达目的基因广物。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括收获所述目的基因产物。
全文摘要
本发明涉及含有基因组核苷酸序列的核酸片段和构建体，所述基因组核苷酸序列位于与基因间转录有关的Rb1和p15C的上游，用于在真核宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞中在严格可筛选标记存在的条件下生产目的基因产物。本发明进一步涉及含有所述核酸构建体的宿主细胞，生产所述宿主细胞的方法和使用所述宿主细胞生产目的基因产物的方法。
文档编号C12N15/65GK103038352SQ201180029783
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月15日 优先权日2010年6月15日
发明者A·P·奥特, M·西普, J·A·沃赫斯, F·霍克萨马, H·J·M·范布洛克兰德 申请人:萨拉基尼克有限公司