人工多能性干细胞的制造方法

专利名称：人工多能性干细胞的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种人工多能性干细胞的制造方法。
背景技术：
人工多能性干细胞(iPS细胞)用于对各种疾病的移植疗法中，并期待其应用于再生医疗中。近年来有报告:通过从在成纤维细胞或肝细胞等体细胞中导入0ct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、及c-Myc基因并表达的细胞中，选择表达Fbxl5基因的细胞，可以制作iPS细胞(例如参照:W02007/069666国际公开公报、TakahashiK, YamanakaS.(2006).“Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonicand adultfibroblast cultures by defined factors，，.Cell 126:663-676 ;Takahashi K, OkitaK, Nakagawa M, Yamanaka S.(2007).“Inductionof pluripotent stem cells fromfibroblast cultures”.Nature Protocols 2:3081-3089 ；Aoi T,Yae K, NakagawaM, Ichisaka T, Okita K, TakahashiK, Chiba T, Yamanaka S.(2008).“Generation ofpluripotent stem cellsfrom adult mouse liver and stomach cells，，.Science321(5889):699-702)。

发明内容
发明要解决的课题然而，在现有的iPS细胞制 作方法中，需要采集皮肤或肝脏等组织，因此病人的负担大且iPS细胞制作效率也低。因此，本发明的目的在于提供一种侵袭性低、且高效率地制造iPS细胞的方法。解决课题的方法本发明的人工多能性干细胞(iPS细胞)的制造方法的特征在于:将来自周边血的单核细胞群作为原料。所述iPS细胞的制造方法优选包括:(I)在抗⑶3抗体及白细胞介素2的存在下，将来自周边血的单核细胞群培养3天-14天的步骤；以及(2)对培养后的所述单核细胞群进行脱分化处理的步骤。另外更优选在步骤(2)中，对所述单核细胞群进行脱分化因子的导入操作。在所述脱分化因子的导入操作中，也可以进行表达所述脱分化因子的重组表达载体的导入操作。此处优选脱分化因子为Sox2、0ct3/4、Klf4及c_Myc,更优选重组表达载体为仙台
病毒载体。本发明的iPS细胞的制造方法优选进一步包括:(3)在生长因子的存在下，将进行了脱分化处理的所述单核细胞群培养14天-25天的步骤。另外优选周边血来自人类。另外，本说明书中不附加“基因”、“ cDNA ”等，而以称为“ Sox2 ”、“ Oc 13/4 ”、“ Kl f 4 ”、“c-Myc”的方式仅使用因子名时，是指这些基因的基因产物即蛋白质。==相互参照==
本申请案主张基于2010年4月16日提出申请的日本专利申请2010-95404的优先权，通过引用该基础申请案，而将其包含在本说明书中。


图1是表示在本发明的一个实施例中，在CD3抗体存在下培养的单核细胞群的培养基中，以MOI 1-20添加病毒对单核细胞群进行脱分化处理，由此获得的碱性磷酸酶阳性干细胞的菌落率的图表。图2是在本发明的一个实施例中，由通过碱性磷酸酶染色及DAPI染色而染色的来自周边血的单核细胞制造的iPS细胞的显微镜照片。图3是在本发明的一个实施例中，由来自周边血的单核细胞制造的iPS细胞中的干细胞标记蛋白质的免疫组织化学性染色的照片。图4是在本发明的一个实施例中，通过RT-PCR对由周边血单核细胞制造的iPS细胞中的干细胞标记基因的表达进行解析的结果。图5是在本发明的一个实施例中，对通过FACS选出的T细胞以MOI 20添加病毒对单核细胞群进行脱分化处理而获得的碱性磷酸酶阳性干细胞的菌落数(比较例)，与实施例中以MOI 20进行脱分化处理而得的菌落数(实施例)进行比较的图表。图6是表示本发明的一个实施例中，在抗CD3抗体及白细胞介素2的存在下培养单核细胞群而制作iPS细胞的情形(抗⑶3 + IL2 +群)，与不存在抗⑶3抗体及白细胞介素2下培养单核细胞群而制作iPS细胞的情形(抗⑶3-1L2-群)时的iPS建立效率的图表。
具体实施例方式以下，一边列举实施例，一边详细地说明根据所述发现而完成的本发明的实施方案。 在未对实施方案及实施例进行特别说明的情况下，是使用J.Sambrook, E.F.Fritsch&T.Maniatis(Ed.) , Molecular cloning,alaboratory manual(3rdedition), Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, New York (2001) ；F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons Ltd.等标准性方案集所记载的方法、或者将其加以修改、或改变的方法。另外，在使用市售的试剂盒或测定装置时，在无特别说明的情况下，使用它们所随附的实验手册。

另外，本发明的目的、特征、优点、及其意图，是通过本说明书的记载而为本领域的技术人员所知晓，根据本说明书的记载，若是本领域的技术人员，则可以容易地再现本发明。以下所记载的发明的实施方案及具体的实施例等表示本发明的优选的实施方案，是为了例示或说明而表示，且本发明并不限定于这些实施方案及具体的实施例。本领域的技术人员明白，在本说明书所揭示的本发明的意图以及范围内，根据本说明书的记载，可以进行各种修改。以下，详细叙述将来自周边血的单核细胞群作为材料来制造iPS细胞的方法。周边血优选来自哺乳动物，可以来自小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、羊、马、猪、猫、狗、猴等动物，更优选来自人类。这些动物的成长阶段可以是成体、幼体、胎儿、胚胎的任意一种，在可以获得包含单核细胞的周边血的范围内并无限制。至于采血方法，考虑到动物体型的大小或采血量，从本领域的技术人员众所周知的方法中适当选择即可，并无特别限制，为了减轻动物的负担，优选使用注射器采血。另外，将通过本发明的方法制造的iPS细胞用于治疗患有某种疾病的病人或病兽时，周边血优选来自与病人或病兽同种的动物，更优选来自病人或病兽本身。单核细胞群可以和单核细胞以外的来自周边血的细胞或成分混合在一起，也可以仅包含单核细胞，但若考虑到iPS细胞的制造效率，则优选以高比例包含单核细胞。至于由周边血制备单核细胞群的方法，本领域的技术人员可以从众所周知的方法中适当选择，例如可以使用:密度梯度离心法、淋巴细胞分离(LYMPH0 KWIK)法(One Lambda公司)、免疫磁珠法等。作为密度梯度离心法的比重液，例如本领域的技术人员从蔗糖溶液或聚蔗糖溶液、或者聚鹿糖-碘酞葡胺(Ficoll-Conray)、聚鹿糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)等鹿糖与表氯醇的水溶性共聚物的溶液、或者Percoll等由聚乙烯吡咯烷酮被覆的胶体二氧化硅的溶液等众所周知的溶液中适当选择即可。另外，周边血优选新鲜的周边血，但也可以是经冷藏、冷冻保存的周边血。==来自周边血的单核细胞群的培养==首先，在抗CD3抗体及白细胞介素的存在下，将由周边血制备的单核细胞群培养3天-14天、优选为3天-7天。认为通过该培养，会特异地促进单核细胞中CD3阳性T细胞的增殖。至于培养条件，本领域的技术人员进行适当选择即可，例如在5%0)2存在下以350C -40°C、优选为37°C进行培养即可。至于培养基，本领域的技术人员可以从通常用于单核细胞培养的培养基中适当选择，例如可以是KBM502、DMEM/F12、DMEM、KBM530、KBM540、KBM560、RPM1640，优选为 KBM502。此处，抗⑶3抗体可以固定在培养皿或培养管中，或者也可以是在液体培养基中悬浮的状态。在将抗CD3抗体 固定时，例如可以经由共价键、或静电相互作用等非共价键，固定在构成培养皿或培养管的塑料等上，但固定化方法并无特别限制，可以从本领域的技术人员所公知的方法中适当选择。另外，固定有抗CD3抗体的培养皿等也可以从BDBioCoat公司等购买。至于液体培养基中的抗CD3抗体的浓度,本领域的技术人员设定最佳浓度即可，若考虑到最终的iPS细胞的产率，优选为I μ g/ml-100 μ g/ml。另外，抗⑶3抗体只要是可以对作为材料的单核细胞的CD3抗原给予特异性刺激，并促进CD3抗原阳性单核细胞的增殖的抗体即可，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，并且还可以是从某种动物获得的抗体，并无特别限制。此处，抗体可以是包含含有可变区域的抗原结合部位的抗体的一部分，例如可以是Fab片段、F (&13’)2片段等。白细胞介素可以是众所周知的任意一种白细胞介素，例如可以列举:白细胞介素
1、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素11、白细胞介素12等，若考虑到操作或制备的容易性，优选使用市售的白细胞介素2。另外，培养基中除了所述抗体和白细胞介素外，还可以含有在单核细胞的培养时所通常添加的一种以上的物质。此种物质例如可以列举:成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor, FGF)或表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等生长因子、胎牛血清(FetalBovine Serum, FBS)或 knockout 血清替代品(knockout serumreplacement)(Invitrogen公司)、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、青霉素或链霉素等抗生素、巯基乙醇等，但并不限定于这些。==单核细胞群的脱分化处理==接着，对单核细胞群进行脱分化处理。单核细胞群的脱分化处理可以通过本领域的技术人员所公知的方法来进行，在可以制作所期望的iPS细胞的范围内并无限制。例如可以使用脱分化因子，或者可以投入促进单核细胞脱分化的众所周知的药剂。在使用脱分化因子时，可以使用在制作iPS细胞时所通常使用的脱分化因子(初始化因子)。例如可以使用高桥(Takahashi)等人的论文(Cell2007vol.131 =861-872)所记载的初始化方法，通过引用该发行物而将其包含在本说明书中。特别是，优选包含分别选自Oct基因群、Klf基因群、Sox基因群的基因产物的组合，优选进一步包含Myc基因群的基因广物。属于Oct基因群的基因可以列举:0ct3/4、OctlA、0ct6等各基因。属于Klf基因群的基因可以列举:Klfl、Klf2、Klf4、Klf5等各基因。属于Sox基因群的基因可以列举:Soxl、Sox2、Sox3、Sox7、Soxl5、Soxl7、Soxl8等各基因。属于Myc基因群的基因可以列举:c-Myc、N-Myc、L-Myc等各基因。而且，除了这些基因的组合外，可以在培养基中添加作为辅助因子的细胞因子或化合物。作为所述以外的脱分化因子的组合，除了 Oct基因群的基因产物、Sox基因群的基因产物外，可以例示包含Nanog基因的基因产物、lin-28基因的基因产物等的组合。另外，除了这些脱分化因子的组合外，例如可以使用SV40LargeT抗原基因产物、及TERT基因产物、永生化诱导因子等。另外，在通过脱分化因子进行脱分化的单核细胞中，在所述的脱分化因子的任意一种或多种均表达时，也可以不加入该脱分化因子。另外，只要是可以代替特定的脱分化因子的功能的化合物，就可以代替该脱分化因子而使用。例如有时Myc基因群的基因产物可以用细胞因子或化合物代替，作为该情况中的细胞因子可以列举SCF或bFGF等。另外，作为可以代替c-Myc基因或Klf4基因的化合物，例如可以列举丙戊酸等。编码脱分化因子的基因是在脊椎动物中均高度保守的基因，在本说明书中只要未特别示出动物名，则表示包含同源染色体(homologue)的基因。另外，即使是包含基因多型并具有变异的基因的基因产物，也可以包含具有与野生型基因产物相同的功能的基因产物、例如野生型基因产物的I个-10个、优选为I个-6个、更优选为I个-4个、尤其优选为1个-3个、特别优选为1个-2个氨基酸发生置换、插入或缺失的变异基因产物。使用如上所述的脱分化因子的单核细胞群的脱分化处理方法并无特别限制，例如可以通过对单核细胞群进行脱分化因子的导入操作而进行脱分化处理。具体而言，制备SAINT-PhD (Cosmobio股份有限公司)或Cellvader (GE Healthcare公司)等阳离子性脂质试剂与脱分化因子的复合物、或者被称为蛋白转导域(Protein TransductionDomain)(PTD)的肽与脱分化因子的复合物等。将这些复合物添加至单核细胞群的培养基中，并与单核细胞群接触，由此可以将脱分化因子导入于单核细胞中。如此导入了脱分化因子的单核细胞进行脱分化，而获得多能性。另外，本领域的技术人员可以适当确定所添加的脱分化因子的量。另一方面，通过对单核细胞群进行可以表达脱分化因子的表达载体的导入操作，可以进行单核细胞群的脱分化处理。为DNA载体时，将编码脱分化因子的基因(脱分化因子基因)导入至用于在单核细胞中表达的适当的启动子的下游，而制备重组表达载体。或者为如仙台病毒之类的负链RNA病毒时，利用来自病毒的启动子使脱分化因子基因表达，但为来自此种病毒的RNA载体时，制备在基因组具有编码脱分化因子的RNA的重组病毒载体。此时，可以在一个载体中插入两种以上的脱分化因子基因。此处，所使用的表达载体在具有所期望的脱分化诱导功能的范围内则并无特别限制，也可以是野生型、变异型、天然型、人为改变型等的任意一种，并无限制，优选病毒载体。例如可以是来自仙台病毒、来自逆转录病毒、来自腺病毒、来自腺伴随病毒、来自痘病毒(poxvirus)等的病毒载体，优选来自仙台病毒的具有不会引起因转移至宿主染色体而产生的融合的特征的载体。此种仙台病毒载体为了发挥单核细胞中的脱分化的诱导功能，优选具有编码N蛋白质、P蛋白质、及L蛋白质等在基因组复制中所必需的蛋白质的基因。此处，人为改变型仙台病毒载体可以是在细胞毒杀性或温度敏感性方面具有变异的仙台病毒载体。例如可以是在来自负链RNA病毒的F基因、H基因、HN基因、或G基因等对病毒包膜蛋白质或外壳蛋白质进行编码的基因中具有变异或缺失的仙台病毒载体(参照W000/70055、W000/70070、Li, H.-0.等.，J.Virol..74 (14) 6564-6569 (2000))。此种仙台病毒载体在单核细胞中可以复制基因组，但无法形成感染性病毒粒子，因此安全性高。特别是，优选使用F基因缺失型仙台病毒载体。将如此制备的重组表达载体或病毒粒子导入至单核细胞中。此时,通过将质粒等重组表达载体或病毒粒子添加至培养基中，而可以在单核细胞中导入目标基因。在添加质粒等重组表达载体时，可以根据磷酸钙法、脂质体转染法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法等众所周知的基因导入方法进行处理，从而将重组表达载体导入至单核细胞中。另一方面，在添加重组仙台病毒等病毒粒子时，通过使病毒感染单核细胞来在单核细胞中导入目标基因。由于脱分化因子在导入了重组表达载体的单核细胞中表达，因此该单核细胞通过表达的脱分化因子而脱分化。另外，本领域的技术人员可以适当确定所添加的重组表达载体的量。另外，在对单核细胞群进行脱分化因子导入操作期间，在无血清培养基中，在5%C02存在下、在35°C _4 0°C、优选为37°C下培养I天_5天、优选为2天。无血清培养基可以为 DMEM/F12、VP-SFM、DMEM、KBM530、KBM540、KBM560、R0M1640、或 KBM502，优选 KBM502。此时，可以使用由MEF (小鼠胚胎成纤维细胞)或SNL (株化小鼠胚胎成纤维细胞)等制作的饲养细胞。==脱分化处理后的培养==在培养iPS细胞的通常的条件下，将以如上方式进行了脱分化处理的单核细胞群培养10天-30天、优选为14天-25天、更优选为20天。例如使用含有生长因子的DMEM/Fl2，在5%C02存在下、在35°C -40 V、优选为37°C下进行培养即可。或者可以使用DMEM等培养基，也可以使用由MEF或SNL等制作的饲养细胞。另外，生长因子并无特别限制，本领域的技术人员可以从众所周知的生长因子中适当选择，例如可以是成纤维细胞生长因子(FGF)或表皮生长因子(EGF)。另外，在培养基中除了所述生长因子外，还可以包含在单核细胞的培养时通常所添加的一种以上的物质。此种物质可以列举:FBS等血清或knockout血清替代品(Invitrogen公司)、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、青霉素或链霉素等抗生素、巯基乙醇等，但并不限定于这些。实施例本实施例中表示:通过本发明的iPS细胞制造方法，可以从来自周边血的单核细胞群有效地制造iPS细胞。另外，培养均在37°C、5%C02条件下进行。==单核细胞成分的制备==根据庆应大学医院伦理委员会所承认的实验方案，从知情同意的各健康人志愿者(11岁-66岁、男女、计5名),采集lml-20ml的周边血。将聚鹿糖_泛影葡胺(GE Healthcare公司)制成比重液，进行离心分离(30分钟，400Xg)，从周边血分离单核细胞成分。==重组仙台病毒载体==根据公知的方法(W02010/008054)，制备将以下(I) - (4)的脱分化因子基因导入至SeV18 +八5八？载体(102010/008054)的仙台病毒。(l)0ct3/4 基因(2) Klf4 基因(3)c_Myc 基因(4)Sox2 基因具体而言，将表达包含(I)- (4)的基因的编码负链RNA病毒基因组RNA (负链)或其互补链(正链)的cDNA的重组病 毒基因组的质粒载体、及表达病毒的自我复制所必需的蛋白质(F、N、P、L、T7RNA聚合酶)的质粒载体，导入至293T/17细胞中，接着将表达F蛋白质的LLC-MK2/F/A细胞重叠(overlay)而进行培养，并通过回收包含所生成的病毒的培养上清液进行制造。==饲养细胞的制备==(株化小鼠胚胎成纤维细胞、SNL)在培养皿中添加0.1%明胶，在37°C下静置约I小时，并涂布培养皿。将SNUEGACC公司)制备成1.5X IO5细胞/ml的密度，每一个培养皿(直径IOcm)添加10ml，并培养一晚，而制备饲养细胞。==使用抗⑶3抗体的单核细胞群的培养==利用PBS将抗⑶3抗体(BD Biosciences公司)制备成10 μ g/ml。利用该抗体稀释液覆盖六个孔培养皿的底面，在37°C下培养30分钟-3小时。在将要使用前将抗体稀释液去除，用PBS清洗而制成抗CD3抗体结合培养皿。将来自周边血的单核细胞群以I X IO5细胞/ml-1 X IO6细胞/ml的密度播种于抗⑶3抗体结合培养皿中，在含有KBM502的培养基(含有20U/ml重组白细胞介素2) IOml中
培养5天。==单核细胞的脱分化处理==(脱分化处理的第一天)将使用抗CD3抗体而培养的单核细胞群制备成7.5X IO5细胞/ml的密度，在其中以MOI K MOI 3、MOI 5、MOI 10、或MOI 20添加仙台病毒，从而导入重组载体，然后在KBM502培养基中培养24小时。(脱分化处理的第二天)利用细胞刮刀(cell scraper)剥取细胞，将每个孔中包含细胞的培养基回收至管中。以20°C、800rpm-1000rpm进行5分钟离心后，在沉淀物中添加KBM502培养基2ml，吸取数次，将沉淀物破坏至其不能形成单个细胞的程度并悬浮。将该悬浮液返回至原来的培养皿的孔中，在KBM502培养基中培养24小时。(脱分化处理的第三天)利用细胞刮刀剥取细胞，将每个孔中包含细胞的培养基回收至管中。通过吸取使细胞成为单个细胞，并计数细胞数。在20°C、以800rpm-1000rpm进行5分钟离心后，在沉淀物中添加适量的KBM502培养基。通过吸取使沉淀物成为单个细胞，在IOcm培养皿中所制备的饲养细胞(SNL)上，以5 X IO4/培养皿、5 X IO5/培养皿、5 X IO6/培养皿的密度播种单核细胞，在KBM502培养基中培养24小时。==脱分化处理后的培养==将以如上所述的方式进行了脱分化处理的细胞播种于饲养细胞(SNL)上，将培养基更换成添加10ng/ml人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF、和光纯药工业)的iPS细胞培养基(lOml/lOcm培养皿)。然后，每48小时更换培养基，持续培养20天。另外，iPS细胞培养基由以下物质组成:DMEM/F12( Invitrogen公司)、20%knockout血清替代品(Invitrogen公司)、2mM L-谷氨酰胺、(Invitrogen公司)、I X 1(Γ4Μ非必须氨基酸(Invitrogen公司)、I X 10_4M2-巯基乙醇(Invitrogen公司)、0.5%青霉素-链霉素(和光纯药工业)。==碱性磷酸酶染色及结晶紫染色==对通过脱分化处理而得到的菌落进行碱性磷酸酶染色及结晶紫染色。首先，用10%中性缓冲福尔马林液(和光纯药工业)固定菌落后，用1-St印NBT/BCIP (Pierce公司)进行染色。接着，将结晶紫溶解于甲醇而制备4%结晶紫溶液，并添加于细胞中进行30分钟染色。另外，已知碱性磷酸酶在干细胞中进行表达，其可以用作干细胞的标记物(例如参照Riekstina U.et al., Stem Cell Rev.2009Dec 5 (4):378-386)。另外，通过结晶紫染色来仅对活细胞进行染色。接着，使用DAPI (Molecular Probes公司)适当进行核的对比染色。如图1所示，即使以MOI 3-M0I 20的任意一种进行脱分化处理时，活细胞的80%-90%的菌落也为碱性磷酸酶阳性。==通过免疫组织化学性染色进行的干细胞标记蛋白质表达的解析==随机对所述碱性磷酸酶阳性细胞的菌落中的三个菌落进行克隆，为了确认这些细胞为iPS细胞，使用DAPI染色及碱性磷酸酶染色进行形态学观察，结果三个克隆均具有胚胎干细胞或iPS细胞的典型的形态，且为碱性磷酸酶阳性。接着，用10%中性缓冲福尔马林液(和光纯药工业)固定通过脱分化处理而得到的克隆的菌落后，使其与抗Nanog抗体(ReproCELL公司，1000倍稀释)、抗0ct3/4抗体(Santa Cruz公司，100倍稀释)、抗SSEA3抗体(Millipore公司，200倍稀释)、抗SSEA4抗体(Millipore公司，200倍稀释)、抗Tral60抗体(Millipore公司，200倍稀释)、抗Tral81抗体(Millipore公司，200倍稀释)反应。然后，适当使用了经Alexa488或Alexa568标记的抗兔IgG抗体、抗小鼠IgG抗体或抗小鼠IgM抗体(均为Molecular Probes公司)作为二次抗体。在荧光显微镜(1X70，Olympus股份有限公司)下观察经染色的细胞，如图3所示，三个克隆均检测到所调查的全部干细胞标记蛋白质。==根据RT-PCR法的干细胞标 记基因表达的解析==接着，通过免疫组织学染色及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法，对各克隆的细胞解析各种干细胞标记蛋白质及基因表达。在RT-PCR法中，以相同的方式，对脱分化处理前的单核细胞及脱分化处理后的单核细胞进行解析，使用了作为阳性对照细胞的人类胚胎干细胞(KhES-2、从京都大学获得)。使用TRIZOL (Invitorgen公司)从各克隆的细胞分离所有的RNA。使用Superscript First-Strand Synthesis System (Invitorgen 公司),从该所有的 RNA 制备cDNA。将该cDNA作为模板，使用下述引物利用KOD plus (DNA聚合酶、东洋纺公司)进行RT-PCR，结果如图4所示，在人体胚胎干细胞中表达的干细胞标记基因在三个克隆的所有细胞中均被检测到。引物:Nanog-F: CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC (序列编号 I)Nanog-R:CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC (序列编号 2)Oct 3/4-F:GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG (序列编号 3)Oct 3/4-R:CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC (序列编号 4)Sox 2-F:GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG (序列编号 5)Sox 2-R:TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG (序列编号 6)Klf 4-F:ACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACC (序列编号 7)Klf 4-R:TGATTGTAGTGCTTTCTGGCTGGGCTCC (序列编号 8) cMyc-F:GCGTCCTGGGAAGGGAGATCCGGAGC (序列编号 9)cMyc-R:TTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTG (序列编号 10)GDF 3-F: CTTATGCTACGTAAAGGAGCTGGG (序列编号 11)⑶F3-R: GTGCCAACCCAGGTCCCGGAAGTT (序列编号 12)Rex 1_F: CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT (序列编号 13)Rex 1_R:GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA (序列编号 14)DPPA 4-F:GGAGCCGCCTGCCCTGGAAAATTC (序列编号 15)DPPA 4-R:TTTTTCCTGATATTCTATTCCCAT (序列编号 I6)DPPA 2-F:CCGTCCCCGCAATCTCCTTCCATC (序列编号 17)DPPA 2-R:ATGATGCCAACATGGCTCCCGGTG (序列编号 18)GAPDH-F: CAGAACATCATCCCTGCCTCTAG (序列编号 19 )GAPDH-R:TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG (序列编号 20)这些结果表示在本实施例中所制作的细胞为iPS细胞。如此，不使用FACS等从来自周边血的单核细胞群分离抗⑶3阳性T细胞，在抗⑶3抗体的存在下培养来自周边血的单核细胞群后，通过进行脱分化处理，可以高效率地制作iPS细胞。[比较例I]在比较例中，利用FACS从周边血单核细胞成分选出T细胞，而制造iPS细胞。首先，利用FACS从和实施例中所用相同量的来自周边血的单核细胞成分，选出⑶3阳性T细胞。通过该选择而获得来自周边血的单核细胞成分的约30%-40%作为⑶3阳性T细胞。将被选出的T细胞播种于抗CD3抗体结合培养皿中，在含有重组白细胞介素2(20U/ml)的KBM502培养基IOml中培养5天。
将培养后的T细胞制备成7.5X IO5细胞/ml的密度，以与实施例相同的方式，以MOI 3或MOI 20添加重组仙台病毒，由此导入重组载体,进行⑶3阳性T细胞的脱分化处理。在通过脱分化处理而得到的菌落的细胞中，进行碱性磷酸酶染色及结晶紫染色。将在本比较例中以MOI 20进行脱分化处理时的菌落数与在实施例中以MOI 20进行脱分化处理时的菌落数进行比较的图表示于图5。比较例中得到的菌落包含碱性磷酸酶阳性、阴性的也只有几个菌落。若将比较例的结果与实施例的结果进行比较，则实施例的方法与比较例的方法相t匕，显示了建立iPS细胞的效率高约100倍。[比较例2]本比较例表示:从实施例所记载的单核细胞群制作iPS细胞时,需要在抗CD3抗体及白细胞介素2的存在下进行培养单核细胞群的步骤。首先，根据实施例的记载，将从周边血取得的单核细胞群播种于抗CD3抗体结合培养皿中，使在白细胞介素2存在下培养5天的细胞脱分化而建立iPS细胞(抗CD3 +IL2 +群)。另一方面，将从周边血取得的单核细胞群播种于未结合抗CD3抗体的培养皿中，使使用不含白细胞介素2的KBM502培养基培养5天的细胞脱分化而建立iPS细胞(抗CD3-1L2-群)。另外，抗CD3 + IL2 +群、抗CD3-1L2-群的单核细胞的脱分化处理均是在单核细胞群中以MOI 3添加表达初始化因子的仙台病毒而进行。在以上的iPS建立步骤中，将碱性磷酸酶阳性菌落数相对于添加了仙台病毒的单核细胞数的比例(％)作为iPS细胞 建立效率进行了计算，结果如图6所示，iPS细胞建立效率在抗CD3-1L2-群中为0%，但在抗CD3 + IL2 +群中为0.016%。因此，为了从单核细胞群制作iPS细胞，需要在抗CD3抗体及白细胞介素2的存在下的培养步骤。产业上的可利用性根据本发明，可以从来自周边血的单核细胞高效率地制造iPS细胞。
权利要求
1.一种人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于:将来自周边血的单核细胞群作为原料。
2.权利要求1所述的人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于包括: (1)在抗CD3抗体及白细胞介素2的存在下，将来自周边血的单核细胞群培养3天-14天的步骤； (2)对培养后的所述单核细胞群进行脱分化处理的步骤。
3.权利要求2所述的人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于: 在所述步骤(2)中，对所述单核细胞群进行脱分化因子的导入操作。
4.权利要求3所述 的人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于: 在所述脱分化因子的导入操作中，进行表达所述脱分化因子的重组表达载体的导入操作。
5.权利要求3或权利要求4所述的人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于: 在所述步骤(2)中，所述脱分化因子为Sox2、0ct3/4、Klf4以及c_Myc。
6.权利要求4或5所述的人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于: 所述重组表达载体为仙台病毒载体。
7.权利要求2至6中任一项所述的人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于进一步包括: (3)在生长因子的存在下，将进行了脱分化处理的所述单核细胞群培养14天-25天的步骤。
8.权利要求1至7中任一项所述的人工多能性干细胞的制造方法，其特征在于:所述周边血来自人类。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种侵袭性低、且高效率地制造iPS细胞的方法。通过如下方法可以高效率地制造iPS细胞，该方法包括在抗CD3抗体的存在下将来自周边血的单核细胞群培养3天-14天的步骤；以及对所培养的单核细胞群进行脱分化处理的步骤。
文档编号C12N5/10GK103097521SQ20118002984
公开日2013年5月8日 申请日期2011年4月15日 优先权日2010年4月16日
发明者福田惠一, 汤浅慎介, 关伦久, 长谷川护 申请人:学校法人庆应义塾, 生物载体株式会社