专利名称：用于获得干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及用于从哺乳动物尸体获得干细胞的方法，用于从可能包含非干细胞的样品中获得或纯化干细胞的方法，用于使受损组织再生的方法以及治疗方法。
背景技术：
由于干细胞对生物研究、干细胞治疗和再生医学具有很大的重要性，因此对发现容易获得的干细胞新资源存在极大的临床和科学兴趣。哺乳动物干细胞的两种主要类型存在于胚胎干细胞(以下简称“eSC”)，及“成体(adult)”或“体(somatic)”干细胞(以下简称“sSC”)。十几年以前从人胚胎中分离出前一种类型的干细胞(Thomson等，Science,282(5891) :1145-1147,1998) o Thomson等发现了一种从胚胎和胎儿生殖细胞中取得和分离这些细胞的方法。eSC具有发育成几乎所有超过200种不同已知人体细胞的潜能。第二种类型的已知干细胞是在已分化的体组织(somatic tissue)中发现的未分化细胞。通常这些细胞是多能(multipotent)的，即具有在它们存在的组织内分化成几种类型的体细胞的能力。在最近十年中，已经在许多器官和组织中发现了 sSC，其中该器官和组织包括中央神经细胞、骨髓、外周血、血管、脐带血(umbilical cordon blood)、骨骼肌、皮肤表皮、牙髓、心脏、肠(gut)、肝脏 、胰腺、肺、脂肪组织、卵巢上皮、视网膜、角膜和睾丸。sSC被认为存在于每一组织的特定区域中，该每一组织的特定区域被称为“干细胞小生境(stem cellniche)”。在体内，sSC的主要作用是维持动态平衡，且取代因为使用、凋亡、损伤或疾病而已经死亡的细胞。但是,大部分sSC对于处理导致细胞和组织大量丢失的重大创伤或疾病仅具有有限的能力。两种类型的干细胞均具有在维持未分化状态的同时进行增殖的能力，且具有引起成熟的已功能性分化的细胞进行演替(succession)的能力。但是,虽然eSC是多能性的(pluripotent)(即它们可以分化成躯体的几乎所有的细胞类型，且拥有发育成任意的器官或组织类型的能力)。而sSC是多能的，这意味着sSC仅可以分化成几种类型的细胞，该几种类型的细胞与取得sSC的组织密切相关。例如，造血干细胞可能仅产生最终分化为血细胞的任意不同类型。即使胚胎干细胞具有最大程度的分化潜能，但它们并不是能够轻易得到的，从胚胎或胎儿组织(包括流产儿)获得这些细胞会引发宗教和伦理问题。相反，几种类型的SSC(诸如间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、脂肪来源的基质干细胞)比esc更容易得到，且引起更少的伦理争论。进一步地，在一些情况中，由于自体移植物避免了排斥反应的风险，因此可以从要被移植的患者(即受体)体内获得比eSC更适于移植目的的干细胞。遗憾的是，sSC是稀少的，且仅少量存在于体组织中。由于极少量的干细胞存在于成体组织中，因此从组织中取得这些细胞的提取过程通常导致被其它细胞类型(诸如成纤维细胞)所污染。因此，当收获组织样品时，需要对包括干细胞和非干细胞的不均匀混合物进行分选。但是，并不总是存在为一种类型sSC特征的特异性细胞标记，使得难以从样品的其它细胞类型中分离出sSC。因此，迄今为止，从成体组织分离正常出现的干细胞群在技术上是困难的，且也是昂贵的。此外，即使sSC比eSC更易得到，仍待解决的主要问题是由于少量捐赠者而导致的严重的器官和骨髓短缺，且难以发现特别用于少数群体的匹配的捐赠者增加了该主要问题的难度。因而需要有容易取得干细胞的新的来源。进一步地，还非常需要能够从包括非干细胞的生物材料中特异性选择任意类型干细胞的简单方法。最近，已示出当大鼠储存在4°C时，甚至可以从死亡后(after death)六天的已死成体或出生后早期的大鼠的大脑中分离来自大鼠的神经干细胞(Yi Xu等，Journal ofNeuroscience Research, 74 :533-540, 2003)。于是Yi Xu等建议使用尸体作为可用于临床目的的神经干细胞的新来源。Yi Xu等的研究进一步示出从大鼠尸体获得的干细胞的量依赖于大鼠的年龄，因为出生后早期的大鼠比成体中存在显著更多的神经干细胞。此外，YiXu等示出从死后(post-mortem)第二天神经干细胞的数量急剧下降，且4周龄的大鼠在死后仅有少量神经干细胞能够存活4天。最近对人神经干细胞进行的研究表明当在低氧条件(氧气浓度在2. 5%和5%之间)培养这些细胞时获得最高的增殖率，但I %的氧气对细胞存活是不利的(Santilli等，PLOS One, 5 (1) :e8575，2010)。该研究暗示小于2. 5%的氧气浓度对干细胞是有害的。对在4°C保藏的人流产儿实施的另一研究清楚地示出当保藏延长至死亡后12小时能存活的神经干细胞的数量急速减少(Xinchun Liu等，Journal ofNeurosciencemethods, 157 =64-70,2006)。还从死亡后20小时的脑组织中获得来自人尸体的能存活的神经祖细胞(progenitor) (Palmer 等，Nature, 411 :42-43, 2001)。在国际申请W001/53462中还提出使用尸体的组织作为祖细胞和干细胞的来源，尤其作为具有发育成肝细胞和胆管细胞能力的祖细胞的来源。W001/53462推荐使用在捐赠者心跳已经停止后大约六小时内收集的组织，且对于肝脏组织表明最多为死后30小时。但是还应注意到该申请示出仅用于肝脏祖细胞的实验，其中该肝脏祖细胞来源于在死亡后不超过30小时获得的肝脏。还示出当在37°C缺氧条件下培养24小时时，成年大鼠的神经干细胞的细胞存活力比常氧条件增加达 60% (Biirgers 等，Exp. Brain Res. , 188 (I) :33-43, 2008),且细胞分裂活性从常氧条件下的2%增加至缺氧条件下的16%。但是，没有检测在缺氧中的较长时间段对干细胞存活能力的影响，且没有评价干细胞的移植潜能。关于神经干细胞，组织学和免疫组化分析暗示存在于脑(尤其是脑室下区)中的丰富的血管床是负责在死后期间神经干细胞存活的重要因素，且很可能起到维持神经干细胞小生境的作用(Yi Xu 等，Journal of Neuroscience Research, 74 :533-540, 2003)。如上面所表明的，现有技术主要涉及神经干细胞，且并没有声明可以从尸体获得除肝脏干细胞之外的其它类型的干细胞。进一步地，对于大鼠神经干细胞，可以发现死亡之后可存活的干细胞的最长时间段是6天。评价人神经干细胞的存活能力仅是到死后20小时为止。此外，因为神经干细胞的生物环境是特异性的且不能在其它组织中找到，因此从现有技术中涉及神经干细胞的数据不能推断出可以从尸体中获得其它类型的干细胞。出乎意料的，本发明人已经观察到干细胞(尤其是人的骨骼肌干细胞和造血干细胞)具有在缺氧情况中比之前在现有技术中报道的时间段耐受更长时间段的能力。本发明人尤其已经示出来自人尸体的干细胞可以在死亡后耐受达17天，且比非干细胞更好的耐受氧气缺乏。他们还示出首先小鼠骨骼肌干细胞可以在死亡后存活至少10天，且可以在体外重新形成肌肉；且其次，可以有效地移植死亡后至少到4天为止收集的骨髓，且最终连续地移植在被辐照的小鼠中以重构骨髓，从而证明干细胞(甚至长期重新住入的(repopulate)干细胞)在体内是可存活的且具有功能。这些结果表明尸体(甚至死亡后几天的尸体)是干细胞，尤其是肌肉干细胞(特别是从骨骼肌或平滑肌获得的肌肉干细胞)和造血干细胞的重要来源，可用于干细胞治疗和再生医学。
发明内容
用于从尸体获得干细胞的方法因此，本发明的涉及一种用于获得哺乳动物干细胞的方法，所述方法包括以下步骤a)从储存在1°C 6°C的哺乳动物尸体收获组织，在所述尸体的部分躯体上进行所述收获，在所述尸体的所述部分躯体中干细胞通常存在于活的对应部分中；以及b)从收获的所述组 织中提取单核细胞。在死亡后尽可能早地，优选在死亡后0分钟至48小时，且按照在死亡后0分钟至24小时、0分钟至12小时和0分钟至6小时的优选顺序将哺乳动物的尸体储存在TC 6 0C，优选储存在3°C 5°C，且理想地储存在4°C。更加优选地，在死亡后24小时内将尸体储存在4°C。所述尸体可以是胚胎、胎儿、新生儿、婴幼儿(infant)、儿童、青少年或成年人。哺乳动物尸体可以是人的尸体，或不是人的尸体，例如啮齿动物、犬科动物、猫科动物、灵长类动物、马类动物、绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物。根据本发明的优选实施方式，所述哺乳动物尸体是人的尸体。在死亡后至多30天收获的组织可以有效地用于进行根据本发明的方法。具体地，可在死亡后的一段时间后进行组织收获的步骤a)，所述死后的一段时间包括在0分钟和30天，0分钟和25天，0分钟和20天，0分钟和15天，0分钟和10天，或0分钟和5天之间；优选地，在20小时和30天，20小时和25天，20小时和20天，20小时和15天，20小时和10天，或20小时和5天之间；仍然优选地,在I天和30天，I天和25天，I天和20天，I天和15天，I天和10天，或I天和5天之间；
仍然优选地，在2天和30天，2天和25天，2天和20天，2天和15天，2天和10天，或2天和5天之间；仍然优选地，在3天和30天，3天和25天，3天和20天，3天和15天，3天和10天，或3天和5天之间。在优选的实施方式中，在进行组织收获步骤a)之前，哺乳动物尸体的温度是I。。 6。。。最长的时间段取决于哺乳动物的种类和干细胞的类型，本领域的技术人员可以容易地确定该最长的时间段，在该最长的时间段后可能因为组织不再包含可存活的干细胞(部分由于组织分解)而不能收获该组织。例如，对于人肌肉干细胞，该时间段包括在20和30天之间。在本发明中，“死亡”旨于指哺乳动物心脏确定停止跳动的时刻。在步骤a)收获的组织来自尸体的部分躯体，在所述尸体的所述部分躯体中干细胞通常存在于活的对应部分中，其中活的对应部分包括中央神经系统(脑和脊髓)、骨髓、外周血、血管、脐带血、肌肉(尤其是骨骼肌或平滑肌)、皮肤表皮、牙髓、心脏、肠、肝脏、胰腺、肺、脂肪组织、卵巢上皮、视网膜、角膜和睾丸。一旦从尸体获得组织，则可将该组织立即用于步骤b)中，或在用于步骤b)之前将该组织储存在I 10°C，优选在I 6°C，更优选地在3 5°C，且仍然更优选地在4°C，且在常氧条件中(氧气浓度大约为21% )，优选在低氧条件中(氧气浓度低于5% )，且更优选在氧气浓度等于或小于0.1 %，优选在无氧条件中。在任何情况中，收获的组织不应储存超过最长的时间段，在该 最长的时间段之后组织不再包含可存活的干细胞。如上所述，该时间段取决于哺乳动物的种类。如文中所用，术语“提取单核细胞”指将单核细胞与收获的组织中存在的其它类型的细胞体外分离。进行单核细胞提取的标准方法对本领域技术人员是公知的。例如可使用如下方法组织的机械分解(即将组织切碎成小块)，然后进行酶消化(使用蛋白水解酶，诸如链霉蛋白酶、胰蛋白酶、分散酶(dispase)、胶原酶和/或几种酶的结合(Chazaud等，Exp. Cell. Res. ,258(2) :237_44，2000))，和 / 或非酶的过程(Ca2+螯合作用);和 / 或机械分解和酶消化结合，且与免疫磁珠细胞分选或荧光激活的细胞分选(FACS)-细胞分选组合(Arnold L，等，J. Exp. Med. ,204(5) : 1057-69，2007);和/或机械分解、酶消化或非酶消化结合，然后再使用适当标记物(用于人肌肉干细胞的CD56+、CD45-)进行多重免疫染色后进行荧光激活的细胞分选(FACS)。当细胞在诸如血液或骨髓等的悬浮液中时，可使用 Ficoll Paque plus (Amersham Biosciences)密度梯度或粘附步骤(Friedenstein AJ,Calci Tissue Int，56 :S17，1995)，以及免疫磁珠或FACS细胞分选(使用交叉反应的抗人的单克隆抗体从多种哺乳动物种类中潜在的分离间充质干细胞)。使用抗生素和抗真菌剂(诸如青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B)以防止细胞制备物的细菌/真菌污染。术语“单核细胞”旨于指如下的任意细胞i)具有没有分裂的核，也没有多核的核；或ii)具有单核，且优选地能够从组织分离且被收集在悬浮液中。在优选的实施方式中，所述方法包括在步骤b)后的额外的步骤b ’)，所述步骤b ’)由培养经提取的单核细胞组成。
典型地，在步骤b’ )中，将提取的单核细胞培养如下的时间段I天至30天，I天至25天，I天至20天，I天至15天，I天至10天,或I天至5天；优选地,在2天至30天，2天至25天，2天至20天，2天至15天，2天至10天，或2天至5天之间；仍然更优选地，在3天至30天，3天至25天，3天至20天，3天至15天，3天至10天,或3天至5天之间。对于从人组织提取的单核细胞，优选进行培养步骤c)5至20天的时间段，且更优选地为7至14天的时间段。在I 37°C，优选在20 37°C，仍然更优选地在25 37°C，仍然更优选地在370C，且在氧气浓度等于或小于21 %且优选在氧气浓度等于或小于0.1 % 10 %，仍然更优选从0至5 %，仍然更优选从0至3. 5%且更优选在3. 5%时，进行由培养在步骤b)中提取的单核细胞组成的步骤b’ )。优选地，在5%的CO2浓度下进行步骤c)。用于进行步骤b’ )的培养基可以是普遍用于培养哺乳动物细胞的任意适当的化学定义的培养基。这样的培养基对于本领域技术人员是公知的。例如可以是MEM、杜氏改良培养基(Dulbecco，s Modified Eagle’ s medium)、或改良的 MEM 或 DMEM、RPMI 1640 培养基、CMRL-1066 培养基、Ames’ 培养基、Ham’ sF10 和 F12 培养基、Leibovitz’ s, Williams培养基。优选地，培养基添加有至少一种通常用于培养哺乳动物细胞的生长因子，且这些生长因子对本领域技术人员是公知的。适当的生长因子可以选自包括成纤维细胞生长因子(例如FGF-1和FGF-2)、红细胞生成素或其它集落刺激因子表皮生长因子(EGF)、胰岛素(IGF)、基质生长因子、白介素-1、白介素_3、白介素-6，、Flt3-配体的组。根据要培养的干细胞的类型选择生长因子。进一步地，可在步骤b’ )中使用饲养细胞(feeder cell)以向干细胞提供营养且使干细胞保持为未分化状态。适用于培养干细胞的饲养细胞对本领域技术人员是公知的，且可选自包括小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞的组。根据本发明的优势实施方式，培养基以从大约0. 5g/升至4. 5g/升的最终浓度添加有葡萄糖，且以包括大约2. 5和20%之间的最终浓度添加有人血清或胎牛血清(或牛血清替代物)。通过“大约”指轻微低于或高于可使用的葡萄糖或血清的量。当例如为了移植的目的而意于将通过本发明的主题方法获得的干细胞引入人体时，通过用作血清的化学定义的组合物(composition)(即血清替代物)替换人血清或胎牛血清。这样的化学定义的组合物对本领域技术人员是公知的，且例如是ultroserG 或血小板裂解液(见BemardoME, J. Cell. Physiol.，207 ；211 :121-130)。在所述方法的具体实施方式
中，在松质骨(trabecular bone)或外周血上进行步骤a)，收获的组织是骨髓或外周血，且通过所述方法获得的干细胞是造血干细胞或间充质干细胞。外周血意于指另外的活哺乳动物中的循环血液，即在血管或动脉中发现的血液的细胞组分，且该循环血液没有被隔离在淋巴系统、脾脏、肝脏或骨髓中。在所述方法的另一具体实施方式
中，在肌肉上，特别在骨骼肌或平滑肌上进行步骤a)，收获的组织是肌肉样品，特别是骨骼肌样品或平滑肌样品。且通过该方法获得的干细胞是肌肉干细胞。
在本发明的上下文中，术语肌肉干细胞意于指优选从骨骼肌样品或平滑肌样品中获得的卫星细胞、肌源性祖细胞、间质肌肉或间充质干细胞。在所述方法的又一具体实施方式
中，优选在死亡后至少24小时在神经组织(诸如脑或脊髓或脑膜)上进行步骤a)。收获的组织是脑样品或脊髓样品，且通过该方法获得的干细胞是神经干细胞。根据本发明的方法适用于获得任意类型的干细胞，例如胚胎干细胞或胎儿干细胞，其它成体干细胞，诸如上皮干细胞(皮肤、消化道、呼吸道、口腔粘膜、生殖器粘膜)、生殖细胞、眼睛干细胞、癌症干细胞。当意于将从尸体获得的干细胞给予有需要的受试者时，例如用于受损组织再生，用于治疗获得性障碍(disorder)、先天性障碍或遗传性障碍(例如肌肉障碍或神经障碍)，用于治疗功能性障碍或疾病(例如造血系统功能性障碍或疾病)，所述方法优选包括在步骤b)或适当情况下的步骤b’)后的最终步骤，所述最终步骤由将提取或培养的单核细胞重悬在药学上可接受的载剂中组成。由此获得的细胞悬浮液适用于给予至受试者。在该最终步骤中使用的药学上可接受的载剂既不会对干细胞的存活力和功能不利，也不会对需要被给予该组合物的受试者有毒。药学上可接受的载剂的非限制性实例包括盐溶液，即与血液具有相同渗透压的溶液(例如0. 90% w/v的NaCl，大约300m0sm/L的溶液)；林格氏溶液；乳酸盐林格氏溶液；或醋酸盐林格氏溶液。从尸体获得的哺乳动物干细胞还可能用于制备表达感兴趣的多核苷酸序列的转基因哺乳动物干细胞。由此本发明还涉及一种用于获得表达感兴趣的转基因的哺乳动物干细胞的方法，其中，使用载体(特别是表达载体)转化或转染，或使用病毒载体(优选是逆转录病毒载体，有利的是慢病毒载体)转导从步骤b)收获的组织提取的单核细胞，或适当情况下的步骤b’ )的培养的单核细胞，所述载体或病毒载体包括至少一个感兴趣的多核苷酸序列，以便通过单核细胞表 达所述至少一个感兴趣的多核苷酸序列。在本发明的上下文中，术语“转化”指感兴趣的“外源”(即外来的或细胞外的)多核苷酸序列(即基因，基因的一部分，DNA或RNA序列)引入宿主细胞，以便宿主细胞将表达引入的基因、基因的一部分或序列以产生期望的物质，典型地是由引入的感兴趣的基因或序列编码的蛋白或酶。术语“转染“指将外源核酸引入细胞。术语“使用逆转录病毒载体转导”意于指通过使用有感染性的逆转录病毒载体感染所述干细胞而将感兴趣的“外源”多核苷酸序列稳定引入所述干细胞的基因组中，该逆转录病毒载体的基因组序列包括感兴趣的多核苷酸序列。在本发明的上下文中，术语“感兴趣的多核苷酸序列”(还称为“转基因”)指期望在步骤b)或适当情况下的步骤b’ )的单核细胞中表达的任何基因、基因的一部分、DNA或RNA序列。感兴趣的多核苷酸序列可以与单核细胞基因组是同源或异源的。用于设计载体(病毒和非病毒载体)、特别是表达载体的方法，以及用于使用包括感兴趣的至少一个多核苷酸序列的载体、特别是表达载体转化、转染或转导哺乳动物干细胞以便所述细胞表达感兴趣的多核苷酸序列(被称为转基因干细胞)的方法在本领域是公知的，且例如 Cossu 和同事(Dellavalle A, Sampaolesi M, Tonlorenzi R, TagliaficoE， Sacchetti B， Perani L， Innocenzi A， Galvez BG, Messina G， Morosetti R， Li S，Belicchi M,Peretti G,Wright WE,Torrente Y,Ferrari S,Bianco P,Cossu G Pericytesof human skeletal muscle aremyogenic precursors distinct from satellitecells. Nat Cell Biol. 2007Mar ；9(3) :255-67. Epub 2007Feb 11)或 Chamberlain(Li S,Kimura E, Ng R, FallBM, Meuse L, Reyes M, Faulkner JA, Chamberlain JS. A highlyfunctionalmin1-dystrophin/GFP fusion gene for cell and gene therapy studiesof Duchennemuscular dystrophy. Hum Mol Genet. 2006May 15 ； 15 (10) 1610-22. Epub2006Apr4)所描述的。当意于将根据上面叙述的方法从尸体获得的转基因干细胞给予至有需要的受试者时，所述方法优选包括由将转基因干细胞重悬在药学上可接受的载剂中以获得适于给予至受试者的组合物组成的额外的步骤。转基因可能是用于治疗疾病的任何多核苷酸序列。例如，当干细胞是肌肉干细胞时，转基因可以是编码如下蛋白的多核苷酸序列抗肌萎缩蛋白(dystrophin)、I丐蛋白酶(calpain)、核纤层蛋白、dysferlin蛋白、小窝蛋白(caveolin)、肌糖、肌收缩蛋白、纤维质(nemaline)、结蛋白、酶(诸如线粒体酶或糖酵解酶)或生长因子。通过暴露于缺氧中的干细胞选择
进一步地，本发明人意外地发现在缺氧条件下培养包括干细胞和其它细胞类型的生物样品会引发非干细胞的死亡，而干细胞存活下来。由于对缺氧的耐受性似乎是干细胞的一般特性，且因为在几小时或几天的缺氧之后非干细胞和大部分癌细胞不能耐受住，因此本发明人利用该特性用于富集和纯化用于干细胞的生物样品。因此，本发明的另一目标是提供另一种简单的方法，该方法导致可能存在且污染收获到的组织的非干细胞(诸如癌细胞)的减少，且促进干细胞的富集和纯化。在本发明的上下文中，术语“非干细胞”意于指如下的任意类型的细胞在保持未分化状态的同时不能增殖，且不具有引起成熟的已功能分化的细胞进行演替的能力。术语“癌细胞”意于指显示不受控制的生长且具有体内侵入邻近组织的能力的细胞。该术语包括来源于干细胞的癌细胞。因此，本发明还涉及一种用于获得干细胞的方法，所述方法包括以下步骤a)将通常包括干细胞的生物材料保持在氧气浓度等于或小于0.1 %下；以及b)选择可存活的细胞，其中所述可存活的细胞是干细胞。在步骤a)中，在足以引发包括在生物材料中的非干细胞凋亡和死亡，但不会影响大部分干细胞的存活力的时间段中，使所述生物材料保持在这样的条件下。根据本发明的优选实施方式，对生物材料进行组织的机械分离(即将组织切碎成小块)，然后进行酶消化(在进行步骤a之前使用链霉蛋白酶、胰蛋白酶、分散酶和/或胶原酶或几种酶的结合)，和/或非酶的过程(Ca2+螯合作用)，和/或磁珠细胞分选，和/或荧光激活的细胞分选(FACS)。本领域的技术人员应容易地确定杀死非干细胞而不杀死干细胞所需的时间段，且该时间段将根据在要处理的生物样品中存在的非干细胞和干细胞的类型调整。典型地，该时间段包括在12小时和60天之间，优选地,在I天和30天，I天和25天，I天和20天，I天和15天，I天和10天，或I天和5天之间；
仍然优选地，在2天和30天，2天和25天，2天和20天，2天和15天，2天和10天，或2天和5天之间；仍然优选地，在3天和30天，3天和25天，3天和20天，3天和15天，3天和10天，或3天和5天之间；仍然优选地，在4天和30天，4天和25天，4天和20天，4天和15天，4天和10天，或4天和5天之间；仍然优选地，在5天和30天，5天和25天，5天和20天，5天和15天，5天和10天之间。典型地，可能进行步骤a)的温度包括在I 37°C之间，且优选顺序是I 6°C、3 5。。和 4。。。优选地，将所述生物材料在I 37°C且在氧气浓度小于0. 1%时保持2至20天。步骤b)意于通过从干细胞移除大部分死亡细胞或细胞碎片来纯化干细胞。例如可以通过使用FACS和活细胞特异性表达的标记物(例如钙黄绿素)分选活的干细胞，或排除对膜联蛋白V或碘化丙啶阳性的死亡细胞，或通过使用物理分离过程(诸如差速离心)来实现该步骤。在步骤a)中，将生物材料保持在培养基中，该培养基可以是MEM，杜氏改良的Eagle’ s培养基，或改良的MEM或DMEM，RPMI 1640培养基，CMRL-1066培养基，Ames’培养基，Ham’ s FlO 和 F12 培养基，Leibovitz，s, Williams 培养基。根据本发明的优选实施方 式，在缺氧的条件下进行所述方法。在所述方法的另一优选实施方式中，生物材料是细胞培养物，包括源自脑、脊髓、骨髓、外周血、血管、脐带血、肌肉(特别是骨骼肌或平滑肌)、皮肤表皮、牙髓、心脏、肠、肝脏、胰腺、肺、脂肪组织、卵巢上皮、视网膜、角膜和睾丸的细胞培养物。优选地，所述生物材料是骨髓或肌肉细胞培养物，特别是骨骼肌细胞培养物或平滑肌细胞培养物。在所述方法的优选实施方式中，所述生物材料选自由骨髓和循环血或外周血所组成的组，且获得的干细胞是造血干细胞、外周造血干细胞或循环造血干细胞或间充质干细胞。在所述方法的又一优选实施方式中，所述生物材料是肌肉，特别是骨骼肌样品或平滑肌样品，且获得的干细胞是肌肉干细胞。在所述方法的另一优选实施方式中，所述生物材料选自包括脑、脊髓和脑膜样品的组，且其中富集的干细胞是神经干细胞。通过本发明的所述方法获得的干细胞适用于被移植进入有需要的受体中。可以从除了人胚胎或胎儿之外的活的捐赠者获得上述生物样品；或在死亡后立即、优选在死亡后0分钟至48小时，且以在死亡后从0分钟至24小时、从0分钟至12小时和从0分钟至6小时的优先顺序，从储存在I 6°C、优选在3 5°C、仍优选在4°C的尸体获得上述生物样品。可以从人或非人类捐赠者(例如啮齿动物、犬科动物、猫科动物、灵长类动物、马类动物、绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物)获得上述生物样品。根据本发明的优选实施方式，上述哺乳动物是人。
捐赠者可以是活的或死的。当意于将在缺氧条件(氧气浓度等于或小于0. 1% )下培养后获得的干细胞给予至有需要的受试者时，例如用于受损组织再生，用于治疗获得性障碍、先天性障碍或遗传性障碍(例如肌肉障碍或神经障碍)，用于治疗功能性障碍或疾病(例如造血系统功能性障碍或疾病)，所述方法优选包括在步骤b)之后的最终步骤C)，所述最终步骤c)由将步骤b)的可存活的细胞重悬在药学上可接受的载剂中，以获得适用于给予至受试者的组合物组成。在该最终步骤中使用的药学上可接受的载剂既不会对干细胞的存活力和功能不利，也不会对需要被给予该组合物的受试者有毒。药学上可接受的载剂的非限制性实例包括盐溶液，即与血液具有相同渗透压的溶液(例如0. 90% w/v的NaCl，大约300m0sm/L的溶液)；林格氏溶液；乳酸盐林格氏溶液；或醋酸盐林格氏溶液。用于通过暴露于缺氧中获得哺乳动物干细胞的方法还可以用于获得表达感兴趣的多核苷酸序列(还称为“转基因”)的转基因哺乳动物的干细胞。在该用于获得表达感兴趣的基因或基因的一部分 的哺乳动物干细胞的方法中，使用载体(特别是表达载体)转化、转染或转导在步骤b)中选择出的可存活的细胞，以便由单核细胞表达至少一个感兴趣的多核苷酸序列。当意于将通过暴露于缺氧中获得的转基因干细胞给予至有需要的受试者时，所述方法优选包括由将转基因干细胞重悬在药学上可接受的载剂中以获得适用于给予至受试者的组合物组成的额外的步骤。所述转基因可以是例如用于治疗疾病的任何多核苷酸序列。例如，当干细胞是肌肉干细胞时，上述转基因可以是编码如下蛋白的多核苷酸序列抗肌萎缩蛋白、I丐蛋白酶、核纤层蛋白、dysferlin蛋白、小窝蛋白、肌糖、肌收缩蛋白、纤维质、结蛋白、酶(诸如线粒体酶或糖酵解酶)或生长因子。分离的肌肉干细胞本发明人已经发现肌源性细胞定型状态(commitment)和类干细胞状态的一些标记物的表达水平在源自肌肉干细胞的死后是特异性。因此，本发明的另一目的涉及一种分离的肌肉干细胞，其特征在于，所述分离的肌肉干细胞不表达肌细胞生成素基因(肌细胞生成素_)。优选地，本发明的所述分离的肌肉干细胞是Pax7胃和/或⑶34+。可以将Pax7胃水平确定为比从活的受试者和休眠组织中分离的肌肉干细胞中的Pax7水平显著高的Pax7的表达水平。还优选地，本发明的分离的肌肉干细胞具有比从活的受试者和休眠组织中分离的肌肉干细胞低的线粒体活性的水平，可以通过测量活性线粒体的数量确定线粒体活性。在一个实施方式中，本发明的分离的肌肉干细胞是如上所述的表达感兴趣的“外源”多核苷酸(还被称为“转基因”)的转基因细胞。转基因可以例如是用于治疗肌肉疾病或障碍的任意多核苷酸序列。例如，当干细胞是肌肉干细胞时，转基因可能是编码如下蛋白的多核苷酸序列抗肌萎缩蛋白、钙蛋白酶、核纤层蛋白、dysferlin蛋白、小窝蛋白、肌糖、肌收缩蛋白、纤维质、结蛋白、酶(诸如线粒体酶或糖酵解酶)或生长因子。
在另一实施方式中，将分离的肌肉干细胞或分离的转基因肌肉干细胞配制在包括药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物中。所述载剂和稀释剂应不会对干细胞的存活力和功能不利，也不会对需要被给予该组合物的受试者有毒。已经在上文描述了载剂和稀释剂的适当的实例。治疗的应用本发明的又一目的涉及一种用于使受损组织再生的方法，其中通过上文公开的本发明的任意方法获得适用于使受损组织再生的干细胞；且其中将干细胞引入有需要的患者体内，优选地引入有需要的患者的受损组织中。本发明还涉及通过本发明的用于获得如上所述干细胞的方法获得或选择的干细胞，该干细胞用于受损组织的再生。所述干细胞可以已经转化以表达转基因。可以经由脉管壁血管(小的或大的动脉，小的或大的静脉)不经肠道地将干细胞引入体内，或直接将干细胞引入包括受损组织的器官中。要通过所述方法再生的受损组织可以是躯体的任意组织，包括脑、脊髓、骨髓、夕卜周血、血管、脐带血、肌肉(尤其是骨骼肌或平滑肌)、皮肤表皮、牙髓、心脏、肠、肝脏、胰腺、肺、脂肪组织、卵巢上皮、视网膜、角膜和睾丸。优选地，要再生的受损组织选自由骨髓、肌肉(尤其是骨骼肌或平滑肌)、脑和脊髓所组成的组。当受损组织是脑或脊髓时，适用于使受损组织再生的干细胞是通过上述公开的用于获得干细胞的方法获得的神经干细胞。
当受损组织是血液组织或骨髓时，适用于使受损组织再生的干细胞是通过上述公开的用于获得干细胞的方法获得的造血干细胞。当受损组织是肌肉组织时，尤其是骨骼肌组织或平滑肌组织时，适用于使受损组织再生的干细胞是通过上面公开的用于获得干细胞的方法获得的肌肉干细胞。根据本发明，肌肉干细胞具体可以是肌细胞生成素-干细胞，且优选是Pax7 S、⑶34+。本发明还涉及一种用于治疗造血系统功能性障碍或疾病的方法，其中将通过本发明的用于获得或选择上述干细胞的任意方法获得的造血干细胞引入有需要的患者体内。优选地，将造血干细胞引入患者的血管系统中。本发明的另一目的涉及由上述方法获得或选择出的造血干细胞，所述造血干细胞用于治疗造血系统功能性障碍或疾病。要通过所述方法治疗的造血系统功能性障碍或疾病可以选自包括以下疾病的组白血病和淋巴瘤，包括急性髓系白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、青少年单核细胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤；多发性骨髓瘤和其它浆细胞障碍；重型再生障碍性贫血和其它骨髓衰竭状态，包括重型再生障碍性贫血、范可尼贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、纯红细胞再生障碍、巨核细胞缺乏/先天性血小板减少症；SCID和其它遗传性免疫系统障碍，包括重症综合性免疫缺陷(SCID，所有亚型)、威斯科特-奥尔德里奇综合症；血红蛋白病，包括乙型地中海型贫血、镰状细胞疾病；赫尔勒综合症和其它遗传性代谢障碍，包括赫尔勒综合症(MPS-1H)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良；脊髓发育不良障碍和骨髓增生性障碍，包括难治性贫血(Refractory anemia)(所有类型)、慢性单核细胞白血病、特发性髓样化生(Agnogenic myeloidmetaplasia)(骨髓纤维化)；家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其它组织细胞性障碍。本发明还涉及用于治疗获得性肌肉障碍、先天性肌肉障碍或遗传性肌肉障碍，创伤(诸如肌肉的压碎或辐射损伤)，或尿道或肛门括约肌机能不全(失禁)，或心肌梗塞的方法；或涉及以增加肌肉质量的方法，例如用于治疗在老年人或长期卧床的人的肌肉质量降低；其中将通过本发明的用于获得或选择上述干细胞的任意方法获得的肌肉干细胞引入有需要的患者体内。优选地，将肌肉干细胞直接引入有需要的患者的肌肉中。在另一优选的实施方式中，将肌肉干细胞给予至动脉中以获得干细胞的系统分布。本发明还涉及通过上面定义的本发明的方法获得或选择的肌肉干细胞，所述肌肉干细胞用于治疗获得性、先天性或遗传性肌肉障碍，创伤(诸如肌肉的压碎或辐射损伤)，或尿道或肛门括约肌机能不全(失禁)，或心肌梗塞。要治疗的获得性肌肉障碍、先天性肌肉障碍或遗传性肌肉障碍选自包括如下的组A)遗传决定的肌肉疾病，包括
(i)X染色体伴性遗传肌肉萎缩症(Duchenne和Becker肌营养不良症)；(ii)常染色体营养不良症，包括肢带型肌营养不良(诸如Miyoshi或远端肌病、dysferlin 蛋白肌病(dysferIinopathies)、小窝蛋白肌病(caveoIinopathies)、肌聚糖病(sarcoglycanopathies)、肌源纤维肌病(myotilinopathies)),先天性肌营养不良、面肩肱型进行性肌肉萎缩症(fascio-scapulo-humeral myopathy)和眼咽型肌营养不良(oculo-pharyngeal dystrophy)；(iii)肌强直性营养不良和非营养不良型肌强直性遗传(nondystoophicmyotonias hereditary)或非(DMl或肌强直性营养不良(Steinert)、DM2或近端肌强直性肌病)；B)没有或具有结构异常的先天性肌病(杆状体肌病(nemaline myopathy)、肌管肌病或中央核肌病、中央轴空病(central-core disease)或其它轴空病(othercoredisease)),例如结蛋白肌病；C)代谢肌病，包括⑴线粒体肌病(诸如MELAS、MNGIE, MERRF等);(ii)脂质肌病；(iii)糖原忙积病(诸如麦尔德尔疾病(Me Ardle disease)、庞贝氏疾病(pompedisease)、塔瑞氏疾病(Tarui disease)。本发明还涉及一种用于治疗神经障碍的方法，其中将通过本发明的用于获得上述干细胞的任意方法获得的神经干细胞引入有需要的患者体内。
本发明还涉及通过上面公开的本发明的方法获得的神经干细胞，该神经干细胞用于治疗神经障碍。在具体实施方式
中，要治疗的神经障碍选择包括以下的组A)具有神经元缺失(neuronal loss)特征的神经退行性障碍,诸如i)痴呆或皮质变性(cortical degeneration),包括阿尔茨海默病、额颞叶萎缩、具有路易氏小体的痴呆(dementia with Lewy Bodies)、皮克氏疾病(Pick disease)、与染色体17连锁的痴呆；ii)运动障碍，包括帕金森病、进行性核上性麻痹(Progressivesupra-nucIearpalsy)、多系统萎缩、皮层基底节变性(cortico-basal degeneration)、亨丁顿病(Huntington disease)、肌张力障碍(distonias)、小脑共济失调、遗传性疫挛性截瘫；B)白质的原发性疾病，诸如i)脑白质营养不良；以及ii)具有炎症的白质疾病，诸如多发性硬化； C)缺血性血管病变。在上述受损组织再生的方法和治疗方法中使用的干细胞被提供在药学上可接受的载剂或稀释剂中，所述药学上可接受的载剂或稀释剂即不会对干细胞的存活力和功能不利，也不会对需要被给予该组合物的受试者有毒。上面已经描述了载剂和稀释剂的适当的实例。进一步地，在上述受损组织再生的方法和治疗方法中使用的干细胞的量是治疗有效量。干细胞的治疗有效量是足以实现组织修复或再生，或足以治疗或促进治疗给定疾病、功能性障碍或病症，且不会对被给予干细胞的受试者引起负效应。要使用的干细胞及要给予的组合物的精确量将依据以下条件进行变化被治疗的患者的年龄和重量，损伤、功能性障碍或疾病的类型，给予的方式，给予的频率，以及包括干细胞的组合物中的其它成分。优选地，使用至少大约1. O X IO5个细胞/kg、至少大约5. O X 105、至少大约1.OX 106、至少大约5. OX 106、至少大约1. OX 107、至少大约5. OX 107、至少大约1. OXlO8,至少大约5. OX IO8或至少大约1. OX IO9个细胞/kg进行任意治疗。可以将这些量的干细胞一次或以连续的方式提供给有需要的患者。进一步地，应注意当要治疗的疾病或病症不是遗传性病症，则给予的干细胞可以来源于患者(自体移植)。相反，当要治疗的疾病或障碍是遗传性病症，则要治疗的患者不可以是干细胞的捐赠者(同种异体移植)。干细胞培养系统本发明还涉及缺氧细胞培养系统的应用，用于在氧气浓度等于或小于0.1%，优选小于0.1 %，且更优选在无氧条件下培养哺乳动物干细胞。通常意于使厌氧细菌生长的任意已知的装置均适用于培养哺乳动物。该装置优选完全无菌，即没有任何细菌。这样的装置可以是密封的容器，通过化学反应，例如通过使用提供在装置中的、与氧气反应以除去容器中原来包含的氧气的起始化学材料来实现缺氧环境。很好理解供应的起始化学品优选是无菌的，且必须对干细胞没有毒性，且反应产物必须对干细胞存活力或功能没有不利影响。还可以使用诸如能够注入N2替代氧气的培养箱等装置，因为这样的装置也可以调节用于培养的O2的水平。这样适当的装置和化学产物对于本领域的技术人员是公知的，且包括 genbag 、genbox (biomerieux clinical diagnostic)、gaspak (BDdiagnosticsystems)、anaert)Cult (vwr international)。根据本发明的优选实施方式，将哺乳动物干细胞在I 6°C，优选在3 5°C，仍然优选地在4°C培养12小时至30天。本发明的另一目的涉及缺氧细胞培养系统的应用，用于通过将包括干细胞和非干细胞的生物样品保持在缺氧环境下(即在氧气浓度等于或小于0. 1%，优选小于0. 1%，且更优选在无氧条件下)来获得(选择)干细胞。可以将哺乳动物干细胞在I 37°C下保持2小时至30天，6小时至30天，优选12小时至30天,且更优选地24小时至30天。根据本发明的优选实施方式，将哺乳动物干细胞在I 6°C，优选在3 5°C，仍然优选地在4°C下保持2小时至30天，6小时至30天，优选地12小时至30天，且更优选地24小时至30天。通过下面额外的描述及附图将进一步阐述本发明，该下面额外的描述及附图涉及阐述以下过程的实施例从尸体获得干细胞；通过将肝细胞保持在4°C缺氧条件下来富集干细胞；及，通过该富集方法获得的造血干细胞和肌肉干细胞用于被辐照的小鼠的骨髓再生或小鼠骨骼肌再生的应用。但是应理解仅以阐述本发明的方式给出这些实施例，且这些实施例不得以任何方式限制本发明。
图1. A.例示了在死亡后每4天产生肌源性培养物(培养14天后)的动物的百分比。在每个时间点处，N = 10。图2.A.例示了从死亡后达8天的小鼠尸体的Img肌肉中提取的可存活干细胞的数量。基于钙黄绿素并入和碘化丙啶排除，通过流式细胞术估算活细胞数量(在每个时间点η > 5)。X-轴示出死亡后的天数,且y_轴示出被I丐黄绿素标记的细胞数量。本图示出在死亡后4天和8天后肌肉组织中活细胞的线性减少。图2. B.例示了在从Tg:Pax7-nGFP转基因小鼠尸体的胫骨前肌肌肉提取的样品中可存活的卫星细胞(肌肉干细胞)的数量(在每个时间点η >5)。通过基于GFP表达的流式细胞术估算可存活的卫星细胞的数量。在X-轴上示出死亡后的天数，且在I—轴上示出GFP-阳性细胞的数量。图2. C.例示了从基因敲入小鼠Pax7^z/+的尸体中提取的表达Pax7的卫星细胞的富集。通过检测X-Gal阳性细胞的百分比评估该富集。在X-轴上示出死亡后的天数，且在y-轴上示出X-Gal+细胞的数量。图2. D.例示了在从幼年Tg:Pax7_nGFP转基因小鼠的尸体提取的样品中，死亡后存活的卫星细胞的比率。已经使用了其中所有SC均为活性的幼年小鼠。该图示出在死后第O天和第4天之间SC没有减少，示出活性SC还可以在死后耐受4天。死后8天，仅有非常少的细胞仍然存活。结果表示为每mg组织中的细胞数量。在X-轴上示出死亡后的天数，且在y_轴上示出GFP阳性细胞的数量。图2.E.例示了处于静止细胞状态的死后干细胞的存活力。通过FACS，确定在死后(pm)第O天或第4天来自Tg:Pax7-nGFP小鼠的休眠或受损TA肌肉中的卫星细胞的数量。图3. A.是例示了在来自小鼠尸体的骨骼肌样品中的两种卫星细胞关键基因(即Pax7和MyoD)表达水平的图解(在每个时间点η = 5)。通过实时定量PCR(Taqman)评价基因表达。在X-轴上示出死亡后的天数，且在y_轴上示出Pax7和MyoD的表达。2-ACT表明阈值，在该阈值之后则认为信号是具有显著性的，且使用普遍表达的基因(GAPDH:甘油醛3-磷酸脱氢酶)对信号进行标准化。图3.B.是例示在来自小鼠尸体的骨骼肌样品中肌源性细胞定型状态的标记物(即肌I丐蛋白(Troponin)、MyoD、肌细胞生成素(myogenin))的表达水平,及类干细胞状态标记物(即Pax7和⑶34)的表达水平的图解(对于每个基因，η = 5只小鼠)。通过实时定量PCR(Taqman)评价基因表达。在χ_轴上示出定量的标记物，且在y_轴上示出表达。2-Λ CT表明阈值，在该阈值之后则认为信号是具有显著性的，且使用普遍表达的基因(TBP tata结合蛋白)对信号进行标准化。图3.C.例示了在死后第O天、第4天和第8天，在FACS细胞分选且铺板在96孔平皿中后卫星细胞克隆形成(clonogenicity)(即形成克隆的细胞数量)的百分比。在χ-轴上示出死亡后的天数，且在y_轴上示出克隆形成百分比的表示。图3. D.例示了作为死亡后天数的函数，对实现第一次分裂所需要的时间培养。在Y-轴上示出了培养时间，且在X-轴上示出死亡后的天数。该图解示出在死后4天和8天仍然活着的细胞使得它们的第一次分裂晚于在死亡后立即收集的细胞。图3.E.例示了作为死亡后天数的函数，对从Tg:Pax7-nGFP转基因小鼠尸体获得的卫星细胞的激发状态(energizing state)的检测。在死后第O天、第4天和第8天之间进行对比。通过Mitotracker评价不同条件中的活性线粒体的数量。在y_轴上示出作为使用Mitotracker对活性线粒体进行染色的结果的相对荧光强度，且在χ-轴上示出死亡后第O天/第X天的比率。 图3.F.例示了作为死亡后天数的函数，在从Tg:Pax7-nGFP转基因小鼠尸体获得的卫星细胞中产生的ATP的量。通过使用荧光素酶活性作为示值读数的荧光确定ATP的量。在I—轴上示出生物发光，且在χ-轴上示出死亡后的天数。图4. A.例示了被致命辐照的小鼠中存活的百分比，该被致命辐照的小鼠已经移植有从死后O天、2天、3天和4天收集的一个单根股骨中提取的骨髓。在χ-轴上示出死亡的天数，且在I—轴上示出存活小鼠的百分比。图4. B.例示了在骨髓直接移植(黑色柱)之后和在骨髓连续移植(灰色柱)之后血液嵌合状态(chimerism)的百分比(循环血液中GFP+白细胞的百分比)。在x_轴上标示收获用于移植的骨髓时死亡后的天数，且在y-轴上示出存活小鼠的百分比。在使用尸体骨髓进行骨髓移植后的血液嵌合状态与死后第O天观察到的血液嵌合状态完全相同，且当使用来自死后第4天的骨髓时血液嵌合状态稍微降低。图4. C F.例示了通过流式细胞术进行评价，在连续骨髓移植后循环的GFP+细胞的免疫表型。图4. C.示出GFP+B细胞(表达B220细胞表面标记物的细胞)的百分比。图4. D.示出GFP+T细胞(表达⑶5细胞表面标记物的细胞)的百分比。图4.E.示出GFP+粒细胞(表达Grl细胞表面标记物的细胞)的百分比。
图4.F示出GFP+脊髓(myeloid)细胞(表达⑶Ilb细胞表面标记物的细胞)的百分比。这些实验证实尸体骨髓完全重构血液腔室(blood compartment)的能力。图5.例示了作为的天数的函数，与完全缺氧(灰色柱)相比在常氧条件中(黑色柱)在4°C仍然活着的细胞的数量。图6.A.例示了在4°C缺氧后多天后整个骨髓细胞缺失的百分比(黑色柱)。在缺氧中储存4天后95. 6%的细胞缺失，但骨髓在该时间点仍然是可以移植的(见图6B)。图6. B.例示了在骨髓直接移植(黑色柱)后和在骨髓连续移植(灰色柱)后血液嵌合状态的百分比(循环血液中的GFP+白细胞的％ )。使用在移植之前在缺氧条件下保持O小时、I天、2天、3天或4天的骨髓进行移植。在χ-轴上标示在移植之前骨髓保持在缺氧条件下的天数，且在y-轴上示出血液嵌合状态的百分比。注意η > 5，且在每个时间点100%的小鼠存活。图6. C F.例示了通过流式细胞术评价的在连续骨髓移植后循环GFP+细胞的免
疫表型。图6. C.示出GFP+B细胞(表达Β220细胞表面标记物的细胞)的百分比。图6. D.示出GFP+T细胞(表达⑶5细胞表面标记物的细胞)的百分比。图6. Ε.示出GFP+粒细胞(表达Grl细胞表面标记物的细胞)的百分比。图6. F.示出GFP+脊髓细胞(表达⑶IIb细胞表面标记物的细胞)的百分比。
具体实施例方式实施例1、材料和方法伦理根据由国家伦理委员会推荐的指导原则收集人样品。将所有小鼠饲养在二级生物安全的动物设施中，且自由采食食物和水。在操作之前，使用氯胺酮和甲苯噻嗪(在PBS中分别为25%和12. 5% )进行腹膜内注射来麻醉动物。根据当地和 EC 的动物养护(animal care)指导原则(JournalOfficiel des CommunautesEuropeennes, L358, dec ember 18,1986)进行本研究。小鼠品系C57BL/6小鼠(Iffa-Credo，拉尔布雷勒，法国)；Tg:Pax7_nGFP小鼠，其中可以通过卫星细胞的GFP表达而容易地看到该卫星细胞(Sambasivan R, DevCell. 2009Jun ；16(6) :810-21) ;Pax7nlaeZ/+小鼠，其中可以通过卫星细胞的LacZ表达而容易地看到该卫星细胞(Ramkumar Sambasivan and Shahragim TajbakhshunpubIished) ;Tg:Pax7_nGFP: :Tg:CAG:PLAP (Sambasivan 2009)，其中所有细胞组成性表达胎盘碱性磷酸酶和卫星细胞GFP ；TgiCAG-GFP小鼠(C57BL/6TgN[actEGFP]0sb Y01)，其中GFP转基因在非组织特异性启动子(鸡β肌动蛋白启动子)及巨细胞病毒增强子的控制下普遍表达为细胞质蛋白(0kabe，etal, FEBS Lett.1997May 5 ；407(3) :313-9)。组织制备依赖于使用的条件，在处死动物后，将组织立即快速冷冻在液氮冷却的异戊烷中以用于免疫组织化学和组织学分析，或使用缓冲的4%多聚甲醛固定，然后在4°C下低温储藏在30%的蔗糖中过夜(保持组织切片中GFP自发荧光的过程)。进行连续7μπι厚的冷冻切片以用于分析。使用Simple PCI (C-1maging, Compix Inc)软件在具有 Apotome (CarlZeissInc.,德国)和 Orca ER数码相机(Hamamatsu Photonics,日本)的 Zeiss Axiophot显微镜上捕获图像。免疫组织化学对于人的情况，使用小鼠抗人的CD56 (I 20稀释；NHK-l-RDl ;BeckmanCoulter)对来自尸体肌肉5 μ m的冷冻切片进行免疫染色，且使用过氧化物酶Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories)显不出来。对于小鼠组织,在没有抗原暴露(antigen unmasking)的情况下进行免疫染色。总是使用下面的方案在使用PBS对切片进行再水化(rehydration)之后，使用20%山羊血清封闭非特异性蛋白结合，且使用O. 5%的triton-ΧΙΟΟ (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)对细胞渗透20分钟。与一抗在4°C孵育过夜，且通过与二抗在37°C孵育I小时显示信号。使用Dako Diluent缓冲液(Dako,格洛斯楚普,丹麦)稀释抗体。使用下面的抗体作为一抗分别 抗人的胎盘碱性磷酸酶[8B6] (I 300, GenTex,欧文，加利福尼亚州)、M_ I丐粘附蛋白(1: 50,Alexis Biochemicals,劳森,瑞士)的小鼠单克隆抗体、肌细胞生成素(myogenin) (I 50, BD Pharmingen,圣何塞,加利福尼亚州)的小鼠单克隆抗体；抗人(或小鼠)结蛋白的兔多克隆抗体(I 50，Abcam，剑桥，英国)；分别抗小鼠的肌细胞生成素的兔多克隆抗体(1: 50, Santa Cruz biotechnologies,圣克鲁斯，加利福尼亚州)和层粘连蛋白(Laminin)-1的兔多克隆抗体(I 50, Sigma-Aldrich,圣路易斯，密苏里州)。使用的二抗是Cy3缀合的驴抗小鼠的二抗(I 400，JacksonImmunoresearchlab.,巴尔的摩，宾夕法尼亚州)；FITC缀合的山羊抗小鼠的二抗(1: 200, Jackson) ;Cy3缀合的驴抗兔的二抗(1: 200, Jackson);生物素酰化的马抗小鼠的二抗(1: 200, Vector laboratories,伯灵格姆,加利福尼亚州)；Cy5缀合的驴抗兔的二抗(I 200, Jackson) ;FITC 缀合的驴抗山羊的二抗(I 200, Jackson);及，DTAF 缀合的-链霉亲和素的二抗(1: 400, Immunotech Beckman,贝瑞阿,加利福尼亚州)。X-Gal (半乳糖苷)染色使用PBS使经细胞离心的细胞再水化，然后使用4%的PFA固定，随后在37°C与在PBS中的包含4mM亚铁氰化钾、4mM铁氰化钾、2mM MgCl和0. 02% NP40的溶液中的40mg/ml的X-Gal (在Dim6thylsulfoxide (Invitrogen,佩斯利,英国)中重构)孵育过夜。骨髓移植简单地,通过使用RPMI培养基(Invitrogen,佩斯利,英国)和0. 1%肝素(Choay5000UI/ml)冲洗捐赠小鼠的两根股骨(死后的不同时间)获得捐赠BM细胞。在死后晚期的尸体的情况中，使用50 μ g/ml DNAse I (Roche,曼海姆，德国)孵育BM细胞悬浮液以阻止细胞阻塞。清洗后，在9. 5Gy-辐照的4周龄B6小鼠(BM移植之前I天内经6tlCo Y射线福照)中，在0.1ml新鲜的小鼠血清和Hanks缓冲液(PAA Laboratories GmbH,帕兴,奥地利)(1:1)中进行细胞的球后静脉注射(retro-orbital injection)。移植后,小鼠接受10天的10mg/kg/天的环丙沙星以防止再生障碍阶段中的感染。流式细胞术分析为了确定植入的数量，移植后一个月使用Cyan 细胞计数器(DakoCytomation,格洛斯楚普，丹麦)通过流式细胞术分析移植小鼠的外周血单核细胞。使用“ACK”缓冲液(NH4Cl O. 15M, KHCO3ImM, Na2EDTA O.1mM)溶解红细胞，且使用大鼠抗小鼠的CD16/CD32 (小鼠BD Fe Block ) (BDBiosciences)在+4°C进行免疫染色30分钟，以阻止细胞活化和对塑料的粘附。在所有FC实验中，还使用碘化丙唳lmg/ml (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)标记细胞以从分析中排除死亡的细胞。选定(gate on)白细胞，且在异硫氰酸荧光素通道下检测GFP荧光。使用PE-Cy5-缀合的抗-Ly-6C(Grl) (eBioscience圣地亚哥，美国)、PE-缀合的抗-CDllb (eBioscience 圣地亚哥，美国)、PE-缀合的抗-CD5 (BD Biosciences)、PE-缀合的抗-B220(BD Biosciences)、Abs及它们各自的同种型进行特异性突光染色。使用来自DakoCytomation的Summit v4. 3软件进行所有的分析和定量。对于在通过FACS Mitotracker (invitrogen, M22246)分离细胞后立即进行活性线粒体的测定，在37°C使用500nM处的深红色30分钟。然后分析远红外染色(far redstaining)的强度。ATP水平检测为了检测ATP水平，通过在裂解缓冲液中直接进行FACS分离细胞，且将该细胞保持在 4°C。使用 biovision (目录 #K254-200，-1000)的 ApoSENSOR 试剂盒检测 ATP 水平，其中荧光素与ATP反应且发出与ATP含量成比例的信号。使用光度计(GL0MAX 20/20光度计，promega)检测发出的光。FACS细胞分选和分析使用MoFlo Legacy (Beckman Coulter,贝瑞阿,加利福尼亚州)进行细胞分选,且使用CyAn ADP进行细胞分析(Beckman Coulter)。由肌肉组织制备细胞悬浮液处死小鼠后，仔细解剖小鼠的肌肉，将肌肉切碎成小块，且在使用重构在含有
O.4%青霉素链霉素的DMEM中的链霉蛋白酶(来自灰色链霉菌的蛋白酶(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州))消化之前在PBS中进行清洗。收集所有的上清液，且通过加入20%胎牛血清立即阻断酶活性。连续进行该过程直至完全消化组织(在37°C，4 5个20分钟的消化循环)。然后，清洗细胞，且在使用抗生素/抗真菌剂混合剂处理10分钟之前使用40 μ m细胞过滤网(cell strainer)过滤该细胞。细胞培养除非另作说明，从GIBC0(Invitrogen,佩斯利，英国)获得培养基组分，且从TPP(TrasadingenJ^fi)获得培养塑料(culture plastics)。如之前所描述的(Chazaud等，2000)，从肌肉样品中培养人或小鼠的肌肉细胞。在标准条件下(体外自发的肌生成)，细胞生长在包含20% FCS(生长培养基)、1% UltroserG(PALL Life Sciences，圣日耳曼昂莱，法国)、0. 2%维生素、I %非必 需氨基酸100X、0. 4%青霉素链霉素10000U/ml的Ham’ s F12培养基中，而不需要撤除血清(serum withdrawal)。在分化条件下,在亚融合(subconfluence)时用包含5% FCS的Ham’s F12培养基(分化培养基)取代生长培养基。
对于没有氧气下的培养，使用GenBag (Biomerieux,卡彭,法国)装置。RNA 提取、RT 和 qPCR使用Quiagen RNAeasy Micro纯化试剂盒，从通过在裂解缓冲液中对GFP阳性细胞直接FACS分离的细胞中提取总RNA。400 600ng DNAse (Roche)处理的。使用Invitrogen的SuperScript II反转录酶方案加工RNA,用于随机引物的反转录。然后通过使用 Taqman universal Master Mix 和 ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer AppliedBiosystems)以及 StepOnePlus (Applied Biosystems),的实时定量 PCR 分析 cDNA。TBP 参考转录水平用于每一样品内各靶标的标准化(=ACT)。使用PrimerfPlus在线软件设计定制(custom)引物。统计分析在所有实验中，“η”值至少是5。t测试用于统计分析(GraphPad-1nStat 软件)。认为P < 0. 05为具有显 著性。实施例11、干细胞在死后存活延长的时间段为了确定肌肉细胞将在死亡的组织中存活多长时间，从“尸体捐赠中心-巴黎笛卡尔医学院(centre du don des corps-Facultede Medecine ParisDescartes) ” 获得人的尸体。死亡后，尸体在室温经几小时至24小时初始且不同的时间段后被储存在4°C。在所有案例中(η = 16)，患者年龄为57 95岁(y. ο.)(平均为84岁)。从死后6 17天进行三角肌肌肉活检(2克)。患者均没有瘤形成。肌肉组织学分析示出坏死外观和来自通常表现出渗漏的肌肉核(myonuclei)的染色质。标记人的卫星细胞(SC)(即肌肉干细胞)的CD56免疫染色示出少量阳性细胞没有坏死，但它们显示出致密的外观。使用标准方案(ChazaudB，等 Exp Cell Res. 2000 ；258 :237-44)从肌肉活检中提取单核细胞，然后将该单核细胞在涂有明胶的平皿且在由HamF12、20%胎牛血清、0.4%青霉素/链霉素、l%ultroserG 、0. 2%维生素、I %非必需氨基酸组成的“传统”培养基中培养两周。在所有案例中(包括死后晚期的时间点(17天))，在最多4天后观察到有很少的细胞贴附在平皿的底部。它们从小的集群缓慢生长，且当密度达到临界阈值时一些细胞对齐以融合。在铺板后两周，向培养物添加分化培养基(HamF12、5%正常马血清、0. 4%青霉素/链霉素、0. 2%维生素、I %非必需氨基酸)，且细胞融合形成很多肌管。免疫染色证实形成小集群的贴附细胞中超过90%表达肌原性标记物结蛋白(Desmin)。在稍后的阶段，当这些细胞融合且分化成肌管，表达结蛋白和分化转录因子肌细胞生成素时，情况也是如此。由于组织的大量分解，我们在死后17天后不能获得尸体。为了检测肌肉样品中SC的存活潜能，我们利用具有心跳的器官捐赠者，我们在该具有心跳的器官捐赠者中进行外科肌肉活检。这些捐赠者在年龄上较为年轻(η = 15 ;41 77岁，平均为57岁)。我们将肌肉样品保持在4°C密封容器中的缓冲培养基(DMEM、ImM HEPES、0.4(%青霉素/链霉素)中。记录了组织取样的时间(即在取样和培养之间的天数)(见下面的表I)。表I
权利要求
1.一种用于获得哺乳动物干细胞的方法，包括以下步骤a)从储存在1°C 6°C的哺乳动物尸体收获组织，在所述尸体的部分躯体上进行所述收获，在所述尸体的所述部分躯体中干细胞通常存在于活的对应部分中；以及b)从收获的所述组织中提取单核细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括在步骤b)后的额外的步骤b’)，所述步骤b’)由培养经提取的所述单核细胞组成。
3.一种用于获得表达感兴趣的转基因的哺乳动物干细胞的方法，包括以下步骤a)从储存在1°C 6°C的哺乳动物尸体收获组织，在所述尸体的部分躯体上进行所述收获，在所述尸体的所述部分躯体中干细胞通常存在于活的对应部分中；以及b)从收获的所述组织中提取单核细胞；b’ )可选择地培养步骤b)的经提取的所述单核细胞；以及c)使用载体、特别是使用表达载体转化或转染步骤b)或适当情况下的步骤b’)的所述单核细胞，或使用病毒载体转导步骤b)或适当情况下的步骤b’ )的所述单核细胞，所述载体包括至少一个感兴趣的多核苷酸序列。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物尸体在死亡后于1°C 6°C储存O分钟至48小时。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的方法，其中，在死亡后包括O分钟至30天的时间段后进行步骤a)。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物尸体是人的尸体。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中对松质骨或外周血进行步骤a)；所述收获的组织是骨髓或外周血；以及获得的所述干细胞是造血干细胞、外周造血干细胞或间充质干细胞。
8.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中对肌肉，特别是骨骼肌或平滑肌进行步骤a)的收获；收获的所述组织是肌肉样品，特别是骨骼肌样品或平滑肌样品；以及获得的所述干细胞是肌肉干细胞。
9.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中在死亡后至少24小时，对脑或脊髓进行步骤a)的收获；收获的所述组织是脑、脊髓或脑膜的样品；以及获得的所述干细胞是神经干细胞。
10.根据权利要求1 9中任一项所述的方法，进一步包括在步骤b)、适当情况下的步骤b’)或步骤c)后的最终步骤，所述最终步骤由将经提取或培养的所述单核细胞重悬在药学上可接受的载剂中组成。
11.一种用于获得干细胞的方法，包括以下步骤a)使通常包括干细胞的生物材料保持在氧气浓度等于或小于O.1% ;以及b)选择能存活的细胞，其中所述能存活的细胞是干细胞。
12.一种用于获得表达感兴趣的转基因的哺乳动物干细胞的方法，包括以下步骤a)使通常包括干细胞的生物材料保持在氧气浓度等于或小于O. 1% ;以及b)选择能存活的细胞，其中所述能存活的细胞是干细胞；c)使用载体、特别是使用表达载体转化或转染步骤b)的所述能存活的细胞，或使用病毒载体转导步骤b)的所述能存活的细胞，所述载体包括至少一个感兴趣的多核苷酸序列。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，从除了人胚胎或胎儿之外的活的捐赠者获得所述生物材料。
14.根据权利要求11 13中任一项所述的方法，其中，在12小时至60天的时间段中，使所述生物材料保持在1°C 37°C。
15.根据权利要求11 14中任一项所述的方法，其中，在缺氧条件下，使所述生物材料保持在1°C 37°C。
16.根据权利要求11 15中任一项所述的方法，其中，所述生物材料选自由骨髓和循环血或外周血所组成的组，且其中经选择的所述能存活的干细胞是造血干细胞、循环造血干细胞或外周造血干细胞或间充质干细胞。
17.根据权利要求11 15中任一项所述的方法，其中，所述生物材料是肌肉样品，特别是骨骼肌样品或平滑肌样品；且其中经选择的所述能存活的干细胞是肌肉干细胞。
18.根据权利要求11 15中任一项所述的方法，其中，所述生物材料选自由脑样品、脊髓样品或脑膜样品所组成的组，且其中经选择的所述能存活的干细胞是神经干细胞。
19.根据权利要求11 18中任一项所述的方法，其中，从死亡后在1°C 6°C储存O分钟至48小时的哺乳动物尸体获得所述生物材料。
20.根据权利要求11 19中任一项所述的方法，其中，从活的哺乳动物获得所述生物材料。
21.根据权利要求11 20中任一项所述的方法，进一步包括在步骤b)或适当情况下的步骤c)后的最终步骤，所述最终步骤由将经提取或培养的所述单核细胞重悬在药学上可接受的载剂中组成。
22.一种根据权利要求1 21中任一项所述的方法获得的干细胞，所述干细胞用于受损组织的再生。
23.—种缺氧细胞培养系统的应用，用于在氧气浓度等于或小于O. 1%时培养哺乳动物干细胞。
24.根据权利要求23所述的缺氧细胞培养系统的应用，其中，哺乳动物干细胞在1°C 37°C培养12小时至30天。
25.根据权利要求24所述的应用，其中，所述哺乳动物干细胞是造血干细胞或肌肉干细胞。
26.一种缺氧细胞培养系统的应用，用于通过将包括干细胞和非干细胞的生物样品保持在氧气浓度等于或小于O.1 %来选择干细胞。
27.一种分离的肌肉干细胞，其特征在于，所述分离的肌肉干细胞不表达肌细胞生成素基因(肌细胞生成素_)。
28.根据权利要求27所述的分离的肌肉干细胞，其特征在于，所述分离的肌肉干细胞是Pax7高和/或CD34+。
29.根据权利要求27或28所述的分离的肌肉干细胞，其特征在于，所述分离的肌肉干细胞具有低水平的线粒体活性。
30.根据权利要求27 29中任一项所述的分离的肌肉干细胞，用于受损组织的再生。
全文摘要
本发明涉及从哺乳动物尸体获得干细胞的方法，用于从可能包含非干细胞的样品获得或纯化干细胞的方法，受损组织再生的方法及治疗方法。
文档编号C12N5/0789GK103038337SQ201180034463
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月3日 优先权日2010年6月4日
发明者F·克雷蒂安, M·拉蒂尔, S·塔杰巴赫什 申请人:巴斯德研究院, 国家科学研究中心