专利名称：用于生产丁醇的酵母生产培养物的制作方法
技术领域：
本发明涉及工业微生物和丁醇生产的领域。具体地，已经开发出耐高浓度丁醇的酵母生物生产培养物。
背景技术：
丁醇是重要的工业化学品，其用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级萃取剂。每年由石油化学方法生产了 100至120亿磅的丁醇，并且对这种通用化学品的需求还很可能会增加。
丁醇可通过化学合成或通过发酵来制备。异丁醇在生物学上作为发酵的副产物生产。它是“杂醇油”的一种组分，杂醇油由于该真菌群组氨基酸的不完全代谢形成。异丁醇具体地是由L-缬氨酸的分解代谢生产的，并且其产量通常非常低。另外，已经描述了表达
1-丁醇生物合成途径(Donaldson等人，美国专利公开申请公布US20080182308A1)，2-丁醇生物合成途径(Donaldson等人，美国专利公布US 20070259410A1和US20070292927)和异丁醇生物合成途径(Maggio-Hall等人，美国专利公布US 20070092957)的重组微生物生产宿主。生物性生产丁醇一般会受丁醇对用于丁醇生产的发酵中的宿主微生物毒性的限制。酵母通常对培养基中的丁醇敏感。基因工程方法已经用于改变基因表达以提高酵母细胞对丁醇的耐受性。另一种用来改善生产的方法是改善发酵方法。美国专利4，765，992公开了在发酵前或发酵过程中加入微生物细胞壁以吸附导致酒精发酵过程中发酵停止的对酵母有毒的物质。美国专利4，414，329公开了使用含至少约60至160克/升细胞的高矿物盐培养基的方法来生产单细胞蛋白质。美国专利4，284，724公开了通过取出发酵液、过滤、以及将酵母细胞回收到发酵罐中来实现6%至约20% (细胞干重)密度的发酵。目前仍需要开发酵母生产丁醇培养物，其中降低了由于丁醇敏感性对酵母的影响，从而使丁醇产量提高。发明概述本发明提供了用于生产丁醇的培养物，其由于高密度酵母细胞的存在而提高了对丁醇的耐受性。本文提供了用于发酵生产丁醇的生产培养物，其包含:a)培养基，其包含适用于酵母代谢的碳底物山)生产丁醇的酵母细胞培养物，其具有至少约0.5克/克细胞干重/小时(g/gdcw/h)的葡萄糖利用速率；和c) 丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2% (重量/体积)。在本发明的在另一个实施方案中，提供了用于发酵生产丁醇的生产培养物，其包含:a)培养基，其包含适用于酵母代谢的碳底物；b)生产丁醇的酵母细胞培养物，其具有至少约2.4克细胞干重/升(gdcw/L)的细胞密度；和(3) 丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2% (重量/体积)。在本发明的另一个实施方案中，提供了用于生产丁醇的方法，其包括制备本发明的生产培养物，其中所述酵母包含选自异丁醇途径和1-丁醇途径的丁醇生物合成途径；以及在生产丁醇的条件下发酵所述酵母。本文提供了用于发酵生产丁醇的生产培养物，其包含:a)培养基，其包含适用于酵母代谢的碳底物山)生产丁醇的酵母细胞培养物，其具有至少约0.5克/克细胞干重/小时(g/gdcw/h)的葡萄糖利用速率；和c) 丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2% (重量/体积)。在一些实施方案中，所述细胞的密度为至少约2.4克细胞干重/升。在一些实施方案中，所述细胞的密度为至少7克细胞干重/升。在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞具有至少约I克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，该方法包括:a)诱变；和b)暴露于3%的异丁醇；和C)重复冻-融循环。在一些实施方案中，所述冻-融循环重复多于两次。在一些实施方案中，所述细胞是由包含至少5次冻-融循环的方法产生的。在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，该方法包括:a)生产丁醇的酵母细胞在含乙醇的培养基中生长；b)使细胞浓缩至密度在30gdcw/L的范围内；c)暴露于3%的异丁醇；和(1)重复冻-融循环。在一些实施方案中，所述冻-融循环重复多于两次。在一些实施方案中，所述细胞由包含至少5次冻-融循环的方法产生。在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，该方法包括:a)生产丁醇的酵母细胞在含乙醇的培养基中生长；b)依次地转移至包含0.1%至2.0%丁醇的培养基中，以用于生长至少10小时且最多72小时；c)在后续的过程中逐渐提高培养基中的丁醇浓度，以增加生产丁醇细胞的生长速率；和d)集合生长速率高的细胞，e)暴露于3%的异丁醇；和/或重复冻-融循环。在一些实施方案中，所述酵母是克拉布特里(crabtree)阳性的，并且在一些实施方案中，所述酵母是克拉布特里阴性的。在一些实施方案中，所述酵母是选自酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和毕赤酵母属(Pichia)。在一些实施方案中，所述酵母包含选自异丁醇途径和1- 丁醇途径的丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，所述培养物在以下条件下保持I小时至200小时:a)介于20°C和37°C之间的温度；b)保持在微氧条件至高于3%之间的溶解氧；c)由液化的生物质提供的过量碳底物； d)介于约3和7.5之间的pH ;和d)选自施加真空和液-液萃取丁醇移除。
在一些实施方案中，所述培养物具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，所述细胞的密度为至少约7克细胞干重/升。在一些实施方案中，所述丁醇浓度为至少约2.5 %，并且所述培养物具有至少约0.4克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，所述酵母包含选自异丁醇途径、1-丁醇途径和
2-丁醇途径的丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，所述培养物包含PNY0602或PNY0614。在一些实施方案中，所述培养物包含还包括丁醇生物合成途径的PNY0602或PNY0614。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径为异丁醇生物合成途径。附图简述和序列描述从下文的发明详述、附图和附带的序列描述中可较充分地理解本发明的多个实施方案，它们形成本专利申请的一部分。
图1显示了四种不同的2- 丁醇生物合成途径。图2显示了三种不同的异丁醇生物合成途径。图3显示了一种1- 丁醇生物合成途径。图4显示了在异丁醇的存在下在高细胞密度的酵母培养物中的葡萄糖利用率图。下面的生物保藏已根据用于专利程序的国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款进行: 保藏人鉴定nm保藏日期
参考文献保藏所
_名称_
啤酒糖酵母 i Saccharomyces cerevisiae、PNY0602 PTA-1 1918 20 丨丨年 6 月 I 日啤酒糖酵母PNY0614PTA-11919 20丨丨年6月I日本文所附的且以引用方式并入本文的下列序列和序列表符合37C.F.R.1.821-1.825 ( “对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求_序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25 (2009)和EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5 (a-bis规则)，以及行政指导的208节和附录C相一致。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§ 1.822所示的规则。表1:表汰编码区和蛋白质的SEQ ID号
权利要求
1.用于发酵生产丁醇的生产培养物，包含: (i)培养基，其包含可发酵碳底物； (ii)酵母细胞培养物，其具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率；和 (iii)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2% (w/v)
2.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约2.4克细胞干重/升。
3.根据权利要求2所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约7克细胞干重/升。
4.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述生产丁醇的酵母细胞具有至少约I克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
5.根据权利要求4所述的生产培养物，其中所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，所述方法包括: (i)诱变； (ii)暴露于3%的异丁醇；以及 (iii)重复冻-融循环。
6.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母是克拉布特里阳性的。
7.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母是选自下组的属的成员:酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issaichenkia)和毕赤酵母属(Pichia)。
8.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母包含异丁醇途径或1-丁醇途径。
9.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述培养物在以下条件下保持约I小时至约200小时: ⑴约20°C至约45°C的温度； (ii)保持在微氧条件至高于3%的溶解氧； (iii)由液化的生物质提供的过量碳底物； (iv)约3至约7.5的pH ;和 (v)选自真空应用和液-液萃取的丁醇移除。
10.用于生产丁醇的方法，包括: (i)制备根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母包含异丁醇途径或1-丁醇途径；以及 (ii)在生产丁醇的条件下发酵所述酵母。
11.用于发酵生产丁醇的生产培养物，包含: (i)培养基，其包含可发酵碳底物； (ii)酵母细胞培养物，其具有至少约2.4克细胞干重/升的细胞密度；和 (iii)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2% (w/v)
12.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述培养物具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
13.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述培养物具有至少约I克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
14.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约7克细胞干重/升。
15.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述丁醇浓度为至少约2.5%，并且所述培养物具有至少约0.4克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
16.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述酵母是选自下组的属的成员:酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
17.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述酵母包含异丁醇途径或1-丁醇途径。
18.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述培养物在以下条件下保持约I小时至约200小时: ⑴约20°C至约37°C的温度； (ii)保持在微氧条件至高于3%的溶解氧； (iii)由液化的生物质提供的过量碳底物； (iv)约3至约7.5的pH ;和 (v)选自真空应用和液-液萃取的丁醇移除。`
19.用于生产丁醇的方法，包括: a.制备根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述酵母包含选自异丁醇途径、1-丁醇途径和2- 丁醇途径的丁醇生物合成途径；以及 b.在生产丁醇的条件下发酵所述酵母。
20.用于提高生产培养物对于发酵生产丁醇的耐受性的方法，包括: (i)提供培养基，所述培养基包含可发酵碳底物； (ii)提供生产丁醇的酵母细胞培养物，所述酵母细胞培养物具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率；以及 (iii)使所述酵母培养物与所述可发酵碳底物接触，从而将所述葡萄糖利用速率保持一段适宜的时间并且从而生产丁醇。
21.用于发酵生产丁醇的生产培养物，包含: (i)培养基，其包含可发酵碳底物； (ii)酵母细胞培养物，其具有至少约2.4克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率；和 (iii)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约1% (w/v)。
22.根据权利要求21所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约2.7克细胞干重/升。
全文摘要
本发明发现酵母的高细胞密度培养物对于培养基中的丁醇具有更高的耐受性。与具有低细胞密度的培养物相比，所述高细胞密度酵母培养物具有更高的生存性和更高的葡萄糖利用速率。因此，使用酵母高细胞密度培养物生产丁醇对于提高丁醇产量是有利的。
文档编号C12R1/865GK103201376SQ201180029846
公开日2013年7月10日 申请日期2011年6月16日 优先权日2010年6月17日
发明者V.纳加拉彦, M.G.布拉穆奇 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司