受试物质的判定或评价方法

专利名称：受试物质的判定或评价方法
技术领域：
本发明涉及接种痘苗病毒的炎症组织提取物的新型判定或评价方法等，具体而言，涉及以作为受试物质的接种痘苗病毒的炎症组织提取物对培养细胞内的BDNF表达的作用或者对与BDNF产生相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质的作用为指标、对该受试物质进行判定或评价的方法。此外，本文中“处理”是指在所述物质的存在下培养细胞(下文也同样)。
背景技术：
脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor :BDNF)与神经生长因子(nerve growth factor :NGF)和神经营养素 _3 (neurotrophin_3 :NT_3)同属于神经营养素家族(神经营养因子家族)，是由各种细胞如神经细胞(神经元)、神经胶质细胞(小胶质细胞、星状细胞、少突胶质细胞等)等产生的分泌蛋白。已经获知=BDNF以海马为中心在中枢神经系统中呈不均匀分布,在神经系统中表现出各种生理活性,如神经细胞的生存和维持、神经突起的形态调节、突触的功能调节、神经可逆性的控制等。已知BDNF在生物体内的表达是介由称为MAP激酶(mitogen-activated proteinkinase :MAPK,丝裂原活化蛋白激酶)/CREB (cAMP-response-element-binding protein,cAMP应答元件结合蛋白)通路的胞内信号转导通路，最终受控于CREB的活化(磷酸化)，其中，MAP激酶/CREB通路通过BDNF高亲和力受体TrkB (tropomyosin receptorkinase B，原肌球蛋白受体激酶B)的活化而启动。S卩，BDNF —旦结合到细胞表面的TrkB上，就使TrkB活化，从而经由介导Ras活化的MEK (MAPK kinase :MAP激酶激酶)/ERK(extracellular-signal-regulated kinase,胞外信号调控激酶)通路而引发CREB的活化，以及经由PI3K (phosphoinositide3_kinase,磷酸肌醇3激酶)/Akt通路而引发CREB的活化(在本申请中，两条通路一并称为MAP激酶/CREB通路)。对于MEK/ERK通路而言，自Trk受体的活化开始，依次引发Grb2/Sos、Ras、Raf、MEKI/2,ERKI/2,Rsk等各种蛋白质的活化，最终使CREB活化(磷酸化)，使BDNF等表达。此外，对于PI3K/Akt通路而言，通过Trk受体的活化，依次引发PI3K、Akt、P38MAPK等蛋白质的活化，同样引发CREB的磷酸化。本发明人发现，接种痘苗病毒的炎症组织提取物对培养细胞中的BDNF等神经营养因子的表达有作用。并在当时阐明了所述提取物对于与BDNF等表达相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质的作用，以及这些作用受到Trk受体、ΡΙ3Κ、Ρ38ΜΑΡΚ、ΜΕΚ1/2等的各自的抑制剂的抑制。本发明的判定或评价方法是基于这样的研究成果。已知本发明的判定或评价方法的受试对象、即接种痘苗病毒的炎症组织提取物具有镇痛作用、镇静作用、抗应激作用、抗过敏作用(参见专利文献I)、免疫增强作用、抗癌作用、肝硬化抑制作用(参见专利文献2)、对特发性血小板减少性紫癜的治疗效果(参见专利文献3)、对带状疱疹后神经痛、脑水肿、痴呆、脊髓小脑变性症等的治疗效果(参见专利文献4)、对雷诺氏综合症、糖尿病性神经障碍、亚急性脊髓视神经障碍(SM0N后遗症)等的治疗效果(参见专利文献5)、血管舒缓素产生抑制作用、末梢循环障碍改善作用(参见专利文献6)、骨萎缩改善作用(参见专利文献7)、对治疗败血症、内毒素性休克有效的一氧化氮产生抑制作用(参见专利文献8)、对骨质疏松症的治疗效果(参见专利文献9)、基于Nef用抑制作用和趋化因子产生抑制作用的对艾滋病的治疗效果(参见专利文献10、11)、对脑梗塞等缺血性疾病的治疗效果(参见专利文献12)、对纤维肌痛综合症的治疗效果(参见专利文献13)、对感染的治疗效果(参见专利文献14)、对抗癌剂所致的末梢神经障碍的预防或减轻作用(参见专利文献15)等。但是，首次明确了接种痘苗病毒的炎症组织提取物的BDNF表达促进及其调节作用，以促进BDNF表达及促进与其相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质的活化等为指标对所述提取物进行判定或评价的方法迄今为止尚属未知。现有技术文献
专利文献
专利文献I :日本特开昭53-101515号公报
专利文献2 :日本特开昭55-87724号公报
专利文献3 :日本特开平1-265028号公报
专利文献4 :日本特开平1-319422号公报
专利文献5 :日本特开平2-28119号公报
专利文献6 :日本特开平7-97336号公报
专利文献7 :日本特开平8-291077号公报
专利文献8 :日本特开平10-194978号公报
专利文献9 :日本特开平11-80005号公报
专利文献10 :日本特开平11-139977号公报
专利文献11 :日本特开2000-336034号公报
专利文献12 :日本特开2000-16942号公报
专利文献13 :国际公开W02004/039383号公报
专利文献14 :日本特开2004-300146号公报
专利文献15 :国际公开W02009/028605号公报发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，所述方
法以其对于培养细胞中的、与BDNF等神经营养因子的表达相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质的作用为指标。用于解决问题的方案本发明人等通过深入研究接种痘苗病毒的炎症组织提取物的药理作用，结果发现上述提取物作用于培养细胞中的BDNF等神经营养因子的表达，并且作用于与BDNF等的表达相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质，完成了本发明的、以此为指标的接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法。发明的效果已经阐明，接种痘苗病毒的炎症组织提取物对于培养细胞中的BDNF等神经营养
4因子的表达及与其相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质具有作用。可以使用简单的方法测定上述对于BDNF等的表达及与其相关的蛋白质的作用。接种痘苗病毒的炎症组织提取物是由极大数量的组分组成的多组分物质，因此，用一种或多种所含组分的含量等判定或评价其作用、确保药效等是非常困难的。考虑到这一点，通过本发明的判定或评价方法，可以简单的判定或评价接种痘苗病毒的炎症组织提取物的作用，进而可以用于确保所述提取物的药效等，是非常有用的。其中，本申请中的“判定或评价”包括了通过试验、检查等对对象物进行调查、准确认定的全部概念。


图I是电泳图，显示了用受试物质(用实施例I的方法制备的接种了痘苗病毒的家兔的炎症皮肤提取物。与用于本申请的药理试验中的“受试物质”相同)或维甲酸处理SH-SY5Y细胞时BDNF的表达(mRNA水平)的经时调查结果。图2是电泳图，显示了用受试物质处理SH-SY5Y细胞时各种神经营养因子的表达(mRNA水平)的调查结果。图3是显示用受试物质处理SH-SY5Y细胞时BDNF的表达(mRNA水平)的调查结果的图。图4是显示用受试物质处理SH-SY5Y细胞时细胞内的BDNF的表达(蛋白质水平)的调查结果的图。图5是电泳图，显示了用受试物质处理SH-SY5Y细胞时C-Fos的表达(mRNA水平)的调查结果。图6是电泳图，显示了用受试物质或人重组BDNF处理SH-SY5Y细胞时、CREB通路中的细胞内信号转导分子的表达(蛋白质水平)的调查结果。图7是电泳图，显示了用受试物质处理SH-SY5Y细胞时、CREB通路的细胞内信号转导分子的抑制剂对BDNF表达(mRNA水平)的影响的调查结果。图8是显示用受试物质或磷酸胆碱处理SH-SY5Y细胞时、细胞内环AMP (cAMP)含量的调查结果的图。图9是电泳图，显示了用受试物质处理SH-SY5Y细胞时、抗TrkB抗体或酪氨酸激酶抑制剂等对BDNF等的表达(mRNA水平)的影响的调查结果。图10是显示用受试物质处理SH-SY5Y细胞时、细胞表面的TrkA/B量的调查结果的图。
具体实施例方式本发明涉及如下方法用接种痘苗病毒的炎症组织提取物处理培养细胞，通过测定BDNF等的表达或与其相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质的活化等，从而对作为受试物质的接种痘苗病毒的炎症组织提取物进行判定或评价。作为本发明中能够使用的细胞，最简单的是市售的培养细胞。作为其中最优选的例子之一，可列举表达BDNF等及其高亲和力受体TrkB的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞。但是，本发明中不限于SH-SY5Y细胞，也可以适当使用PC12细胞(大鼠肾上腺髓质源嗜铬细胞瘤)、施旺细胞(新生大鼠坐骨神经)这些其他的细胞。
本发明的判定或评价方法的受试物质是将痘苗病毒接种到动物中而产生的炎症组织中所产生的生理活性物质(接种痘苗病毒的炎症组织提取物)，如上所述，关于从病变组织中提取所述物质的方法及其药理活性等已经有各种报道(参照上述专利文献I至15
-rf* ) O此外，作为可用作本发明受试物质的市售制剂，包括接种痘苗病毒的家兔炎症皮肤提取液制剂。如日本的医疗用医药品集(2010年版，财团法人日本医药情报中心编辑、发行)的第2978至2980页记载那样，该制剂含有从接种了痘苗病毒的家兔的炎症皮肤组织中提取分离的非蛋白质类活性物质。确认适用于腰痛症、颈肩臂综合症、症状性神经痛、肩周炎、骨关节炎、伴随皮肤疾病(湿疹、皮肤炎、荨麻疹)的瘙痒、过敏性鼻炎、SMON后遗症的冷感/感觉异常/疼痛、带状疱疹后神经痛等，批准作为皮下、肌肉注射、静脉注射用的注射剂和片剂型医疗用药物进行销售。以下说明作为本发明受试物质的接种痘苗病毒的炎症组织提取物的制造方法等。作为本发明受试物质的接种痘苗病毒的炎症组织提取物可以如下获得将接种了痘苗病毒的出痘的炎症组织破碎，加入提取溶剂，去除组织碎片后，进行去除蛋白质的处理，用吸附剂进行吸附，之后洗脱有效成分，从而获得。例如，可以用以下工序制备接种痘苗病毒的炎症组织提取物。(a)采集接种了痘苗病毒而出痘的兔、小鼠等的皮肤组织等，破碎出痘组织，加入水、苯酚水、生理盐水，或加入了苯酚的甘油水等提取溶剂，然后通过过滤或离心分离获得提取液(滤液或上清)。(b)将上述提取液的pH调整为酸性，加热，进行去除蛋白质的处理。然后，将去除了蛋白质的溶液调整为碱性并加热，然后过滤或离心分离。(C)使获得的滤液或上清呈酸性，用活性炭、高岭土等吸附剂进行吸附。(d)向所述吸附剂中加入水等提取溶剂，调整为碱性pH，将吸附成分洗脱，从而可以获得接种痘苗病毒的炎症组织提取物。然后，可以根据所需适当地将洗脱液在减压下蒸发干燥或冻干，制成干固物。对上述各工序进一步详细说明如下。关于(a):作为用于获得接种了痘苗病毒的炎症组织的动物，可以使用感染了痘苗病毒的兔、牛、马、绵羊、山羊、猿、大鼠、小鼠等各种动物，炎症组织优选是兔的出痘的皮肤组织。采集这些炎症组织，破碎，加入其I至5倍量的提取溶剂，形成乳化悬浊液。提取溶剂可以使用蒸馏水、生理盐水、弱酸性或弱碱性的缓冲液等，还可以适当添加甘油等稳定剂、苯酚等杀菌防腐剂、氯化钠、氯化钙、氯化镁等盐类等。此时，也可以通过冻融、超声波、细胞膜溶解酶或表面活性剂等处理破碎细胞组织，简单地进行提取。关于(b):通过进行过滤或离心分离等，对所获得的乳状提取液去除组织碎片后，进行去除蛋白质的处理。可以通过常用的公知方法实施去除蛋白质的操作，可使用加热处理，通过蛋白质变性剂如酸、碱、尿素、胍、丙酮等有机溶剂等进行处理、等电点沉淀、盐析等方法。然后，使用去除不溶性物质的常规方法，例如使用(纤维素、硝酸纤维素等)滤纸、玻璃滤器、硅藻土、尺寸排阻过滤片等的过滤、超滤、离心分离等，将析出的不溶性蛋白质除去。
关于(c):使用盐酸、硫酸、氢溴酸等酸，将如上获得的含有有效成分的提取液调整为酸性，优选调整为PH3. 5至5. 5，进行吸附剂的吸附操作。作为可以使用的吸附剂，可列举活性炭、高岭土等，可以向提取液中加入吸附剂并搅拌或者使提取液通过填充了吸附剂的柱子，使有效成分吸附在所述吸附剂上。在向提取液中添加吸附剂的情况下，可以通过过滤、离心分离等去除溶液而获得吸附了有效成分的吸附剂。关于(d):从吸附剂洗脱(分离)有效成分可以如下实现向上述吸附剂加入洗脱溶剂，在室温或适当的加热下进行搅拌而洗脱，用过滤、离心分离等常规方法去除吸附剂。作为所使用的洗脱溶剂，可使用碱性溶剂，例如调整为碱性PH的水、甲醇、乙醇、丙醇等或它们的适当的混合溶液，可以优选使用调整为PH9至12的水。可以将如此获得的提取物(洗脱液)适当制备为制剂原料或医药制剂的优选形态。例如，可以将溶液的PH调整为中性附近，作为制剂原料，此外，也可以通过浓缩、稀释调整为预期的浓度。进一步地，作为注射用制剂，可以添加氯化钠制备成与生理盐水等渗的溶液。此外，通过将这些溶液浓缩干燥或冻干，也可以制备成可作为片剂等的原料的固体物的形态。作为对患者的投与方法，除经口投与外，还可列举皮下、肌肉内、静脉内投与等，可以根据接种痘苗病毒的炎症组织提取物的种类，适当设定投与量。根据上述日本医疗用医药品集(第2978页)所示，已经允许销售的制剂的投与量基本上是如果内服，I天投与16NU，若作为注射剂，则I天投与3. 6至7. 2NU，但可根据疾病的种类、严重程度、患者的个体差异、投与方法、投与时间等适当地增减(NU :神经妥乐平单位。神经妥乐平单位如下规定使用作为疼痛阈值低于正常动物的慢性应激动物的SART应激小鼠，按改良的Randall-Selitto方法进行试验，以镇痛效力的ED5tl值进行规定。INU表示神经妥乐平制剂中的镇痛活性成分Img的活性，且在神经妥乐平的ED5tl值为100mg/kg时。)。以下示出接种痘苗病毒的炎症组织提取物的制备方法的具体例子、以及与该提取物促进BDNF表达相关的药理试验结果，但本发明不受这些实施例的记载的任何限定。实施例实施例I在健康的成熟家兔的皮肤上接种痘苗病毒，剥离起痘的皮肤，将其破碎后加入苯酚水。然后，将其加压过滤，用盐酸将所获得的滤液调节为PH5后，在90-100°C加热处理30分钟。过滤去除蛋白质之后，用氢氧化钠调节为PH9，再在90-10(TC加热处理15分钟后过滤。滤液用盐酸调节为约PH4. 5，加入2%活性炭，搅拌2小时后离心分离。向收集的活性炭中加入水，用氢氧化钠调节为pHIO，在60°C搅拌I. 5小时后，离心分离过滤获得上清。再次向收集的活性炭中加入水，用氢氧化钠调节为PH11，在60°C搅拌I. 5小时后，离心分离获得上清。合并两次的上清，用盐酸中和，获得接种痘苗病毒的家兔炎症皮肤提取物。实施例2在健康的成熟家兔的皮肤上接种痘苗病毒使其感染后，无菌剥离起痘的皮肤，将其切碎后添加加入了苯酚的甘油水，用匀浆器磨碎为乳状。然后，将其过滤，用盐酸将所获得的滤液调节为弱酸性(PH4. 5至5. 5)后，在100°C加热处理，过滤。用氢氧化钠调节滤液为弱碱性(PH8. 5至10. 0)，再在100°C加热处理后过滤。滤液用盐酸调节为约pH4. 5，加入约I. 5%活性炭，搅拌I至5小时后过滤。向滤取的活性炭中加入水，用氢氧化钠调节为pH9. 4至10，搅拌3至5小时后过滤，用盐酸中和滤液。实施例3在健康的成熟家兔的皮肤上接种痘苗病毒，使其活化后，无菌剥离活化的皮肤，将其切碎后加入水，用匀浆器磨碎为乳状。然后，将其加压过滤，用盐酸将所获得的滤液调节为pH5. O后，在蒸汽流通下在100°C进行加热处理。过滤去除蛋白质之后，用氢氧化钠调节为pH9. 1，再在100°C加热处理后过滤。滤液用盐酸调节为pH4. 1，加入2%活性炭，搅拌2小时后过滤。再次向滤液中加入5. 5%活性炭，搅拌2小时后过滤。向最初滤取的活性炭中加水，用氢氧化钠调节为PH9. 9，在60°C搅拌I. 5小时后过滤。向最初的活性炭和之后的活性炭中加水，用氢氧化钠调节为PH 10. 9，在60°C搅拌I. 5小时后过滤。合并滤液，用盐酸中和后，使用分子量100的膜，用电渗析方法进行脱盐处理，减压干燥。下面示出以上述实施例I中获得的本发明的接种痘苗病毒的炎症组织提取物作为受试物质、在其存在下培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞时的药理试验结果的一个例子。需要说明的是，SH-SY5Y细胞使用的是根据Hamano等人的方法(Molecular BrainResearch，第137卷，第70-76页，2005年)，在添加了 10%胎牛血清(FC S)、ImL丙酮酸、O. 37%葡萄糖和25mIU/mL青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(GibcoDMEM ；Invitrogen公司)中，在37°C、5%C02的加湿培养箱中预培养的SH-SY5Y细胞。此外，通过48小时内的形态学变化、台盼蓝色素排除试验(Trypan Blue pigment exclusion test),确定用受试物质处理后的各培养细胞没有可见的细胞存活率降低。此外，在试验结束后，通过Student-T检验(SAS System 8. 2版,SAS Institute Japan公司)对所有数据进行统计分析，以O. 05 (5%)和O. 01 (1%)为显著水平进行差异显著性检验。药理试验I =BDNF随时间的表达用受试物质(30mNU/mL )或作为阳性对照的维甲酸(I μ M)处理SH-SY5Y细胞(5Χ IO5 细胞)，在无血清 DMEM(Dulbecco’smo dified Eagle’s medium)培养基中培养 O、I、
3、6、12、18、24小时。去除培养上清后，通过Trizol试剂(Invitrogen公司)分离总RNA，用260nm和280nm的紫外吸收(GeneQuant Pro, GE Healthcare公司)测定回收率和纯度。使用随机引物，通过Super Script III First Strand DNA合成试剂盒(Invitrogen公司)将RNA等量地逆转录为单链DNA，然后通过Taq DNA聚合酶(Invitrogen公司)进行半定量PCR(聚合酶链式反应)。需要说明的是，根据Yamamoto等人的方法(NeurochemicalResearch,第21卷，第8期，第929-938页，1996年)，设计用于BDNF和亲环蛋白A (内参基因)的PCR引物(Invitrogen公司)。通过3%琼脂糖凝胶(NuSieve 3:1琼脂糖，TAKARA BI0INC.)电泳分离PCR产物，用溴化乙锭(O. I μ g/mL)染色BDNF和亲环蛋白A的条带，目测检测。另行确定了 PCR中的模板和产物的量的线性关系。图I显示了上述试验结果的一个例子。药理试验2 :神经营养因子的剂量依赖件表汰用受试物质(0、2、10、50、250mNU/mL)处理SH-SY5Y细胞(大约5X105细胞)，在无血清DMEM培养基中培养24小时。然后，与上述药理试验I相同地，对提取的总RNA进行半定量PCR，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，目测检测NGF、BDNF, NT_3、TrkA,TrkB和GAPDH (甘油醒_3_磷酸脱氢酶)的条带。需要说明的是，根据Yamamoto等人的方法(Neurochemical Research,第21卷，第8期，第929-938页，1996年)，设计用于NGF、BDNF和NT-3的各个PCR引物，用于TrkA (原肌球蛋白相关激酶A)、TrkB (原肌球蛋白相关激酶B)和GAPDH的各个PCR引物(Sigma Genosys公司)为自行设计的以下序列〔TrkA(178bp) 5' -tggacaaccctttcgagttc-3',5' -cgtccacatttgttgagcac-3'；
TrkB (188bp) 5' -ccgagattggagcctaacag-3' ,5' -tgcaggttgctgtttttcag-3'；
GAPDH 5' -atcactgccacccagaagac-3' ,5' _tttctagacggcaggtcagg_3，〕。此外，对于提取的总RNA，使用已知浓度的目标产物的模板cDNA，通过实时PCR系统(Prism 7900HT, Applied Bio systems 公司)，定量 BDNF 的 mRNA。需要说明的是，用于 BDNF 和 GAPDH 的 PCR 引物是下列核苷酸序列(BDNF :5’ -gctgcaaacatgtccatgag-3’，5’ -atgggattgcacttggtctc-3' ；GAPDH :5’ -atcactgccacccagaagac-3',5’ -tttctagacggcaggtcagg-3’〕。结果方面，以对照(生理盐水处理)为I. O,测定8次相对 于GAPDH的BDNF转录拷贝数的比例，将其平均值以相对于对照的值的形式示出。图2中显示了上述试验的半定量PCR结果的一个例子，图3显示了定量PCR结果的一个例子。药理试骀3 :细胞内BDNF的表达将SH-SY5Y细胞(I X IO6细胞)在受试物质(0、2、10、50mNU/mL)存在下培养24小时。然后，从平板上刮取SH-SY5Y细胞(I X IO6细胞)，用冰冷的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤，用含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma公司)的裂解缓冲液(20mM HEPE S :4-(2-羟乙基)-1-喊嚷乙横酸；pH7. 2, l%Nonidet P-40,10%甘油，50mM NaF, ImM苯甲基横酸氣，ImMNaVO4)处理细胞沉淀(cell pellet)。去除细胞碎片后,在进行ELISA (enzyme-inkedimmuno-solvent assay,酶免疫测定方法)之前将细胞裂解物保存在_80°C。需要说明的是，用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)测定细胞裂解物的蛋白质含量。然后，使用市售的ELISA试剂盒(Emax ELISA kits、Promega公司)，按我们的标准规程对所保存的细胞裂解物中的BDNF进行定量。即，将用于捕获BDNF的对应抗体结合在96孔聚苯乙烯平板(lumulon 4HBX, Thermo Fisher Scientific公司)的表面,然后，使缀合的BDNF结合二抗,通过辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase HRP)标记的物种特异性抗体进行检测。在去除了未结合的标记抗体后，用酶标仪(Benchmarkmicroplate reader,BioRad公司)测定450nm处的显色底物,计算结合的酶的活性。使用这些试剂盒，在3. 9 500pg/mL的范围内定量胞内BDNF。需要说明的是，与其他的神经营养因子蛋白的交叉反应不足2%。结果显示了 n=3的平均值和标准差。图4显示了上述试验结果的一个例子。药理试验4 :C-Fos的表达将SH-SY5Y细胞(5X105细胞)在受试物质(0、2、10、50mNU/mL)中培养24小时。然后，与上述药理试验I相同地，对分离的RNA进行半定量RT-PCR，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，目测检测C-Fos的条带。需要说明的是，用于C-Fos的PCR引物(Sigma Genosys公司)为自行设计的以下序列〔c_Fos (178bp)5' -gcttcccttgatctgactgg-3' , 5' -atgatgctgggaacaggaag-3'〕。图 5 显不了上述试验结果的一个例子。药理试验5 :对于CREB通路的效果使用针对CREB (MAB5432 ;Millipore 公司)、磷酸化 CREB (P-CREB Clone 10E9 ；Millipore 公司)、P42/44MAP 激酶(ERK1/2 ；Cell Signaling Technology 公司)、憐酸化P42/44MAP 激酶(P-MAPK Tyr202/Tyr204 ；Cell SignalingTechnology 公司)和 c_Fos(Gene Tex公司)产生的各种特异性抗体，通过免疫印迹方法检测胞内信号转导分子。即，首先在无血清DMEM培养基中培养SH-SY5Y细胞(I X IO6细胞)6小时，用人重组BDNF (50pg/mL ；Peprotech公司)或受试物质(0、2、10、50mNU/mL)处理10分钟或30分钟。然后，用细胞刮刀(BD Biosciences公司)刮取该细胞，立即用冰冷的PB S洗涤，之后根据Mutoh等人的方法(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United Statesof America，第92卷，第5087-5091页，1995年)裂解细胞。对细胞裂解物进行4-20%凝胶(ePAGEL ；Atto Chmicals公司)的SDS-PAGE电泳，并印迹到PVDF (聚偏二氟乙烯)膜上。将该膜在含有3%脱脂奶和O. l%Tween20(TBS-T)的Tris缓冲生理盐水(TBS ；20mM Tris-HCl,pH 7. 5,0. 15M NaCl)中封闭I小时后，在TBS-T中、室温下与一抗和HRP标记的二抗反应I小时。通过电化学发光检测系统(ECL ；GE Healthcare公司)，目测检测CREB、磷酸化CREB、P42/44MAP激酶、磷酸化P42/44MAP激酶和c-Fos的免疫反应条带。图6显示了上述试验结 果的一个例子。药理试验6 :胞内信号转导抑制剂对BDNF表达的影响在受试物质(10mNU/mL)存在下，将SH-SY5Y细胞(5 X IO5细胞)在无血清DMEM培养基中培养24小时。在结束培养前30分钟，向培养物中加入溶解于培养基的TO98059 (MEK抑制剂，10 μ M)、LY294002 (PI-3K 抑制剂，15 μ Μ)或 SB203580 (ρ38ΜΑΡΚ 抑制剂，O. 5 μ Μ)。然后，与上述药理试验I相同地，对提取的总RNA进行半定量RT-PCR，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，目测检测BDNF和亲环蛋白A的条带。图7显示了上述试验结果的一个例子。药理试验7 :细胞内的cAMP含量按3. 75 X IO5细胞/孔，将SH-SY5Y细胞接种在24孔培养板中，在无血清DMEM培养基中，用受试物质(2、10、50mNU/mL)或作为阳性对照的毛喉素(10 μ M ;Sigma公司)处理30分钟。去除培养上清后，立即用300 μ L/孔的O. IM盐酸在4°C下裂解细胞。通过EIA(酶学免疫测定)试剂盒(Cayman Chemicals公司),按照生产商的使用说明书直接测定细胞裂解物的胞内cAMP含量。此外，按照使用B SA标准液(Thermo FisherScientific公司)的BCA规程(Thermo Fisher Scientific公司)测定蛋白质浓度。结果显不为4次测定的平均值和标准差。图8显示了上述试验结果的一个例子。药理试验8 :抑制TrkB的影响在受试物质(lOmNU/mL)存在下，将SH-SY5Y细胞(5X IO5细胞)在无血清DMEM培养基中培养24小时。在结束培养前30分钟，向培养物中加入K252a (酪氨酸激酶抑制剂，500nM)或作为人TrkB特异性抗体的兔IgG ( a TrkB，20 μ g/mL)。然后，与上述药理试验I相同地，对提取的总RNA进行半定量PCR，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，目测检测BDNF和亲环蛋白A的条带。图9显示了上述试验结果的一个例子。药理试验9 =TrkB的内化作用通过部分改良的Serres 和 Carney 的方法(Brain Research,第 1101 卷，第 36-42页，2006年)，测定细胞表面的TrkB分子密度。即，首先，按I X 105/mL接种SH-SY5Y细胞并培养，在含有1%FC S的DMEM培养基中用受试物质(2，10, 50mU/mL)处理。为了防止受体内化，用加入了 0. ImM氯化钙和ImM氯化镁的冰冷的PB S洗涤细胞3次。然后，将细胞表面上的分子用溶解在PB S中的250 μ g/mL EZ-LinksuIfo-LC-LC-NHS-biotiη(Thermo Fisher Scientific公司)在4°C下生物素化30分钟。为了抑制未反应的生物素化试剂，用含有IOmM甘氨酸的冰冷PBS洗涤2次后，用含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma公司)的最少量细胞裂解缓冲液(PBS中含有l%Nonidet P-40、
O.5%脱氧胆酸钠、O. 1%SDS)裂解细胞。用细胞裂解缓冲液将蛋白质浓度调节为50 μ g/mL,将其作为样品。在固定有链霉亲和素的平板上,将5 μ g样品(IOOyL)在室温下孵育2小时。用含
O.2%Tween20 的 PBS 洗涤 3 次后，加入 I: I, 000 稀释的兔抗 Trk 抗体(100 μ L ；Clone C-14，Santa CruzBiotechinology公司),静置I小时。洗漆后，加入用HRP标记的抗兔IgG (I 1000,100 μ L ；AP132P, Chemicon International 公司)，静置 I 小时，之后，与 TMB One Sub strate (100 μ L ;Promega公司)进行酶促反应。加入0. IN盐酸(50 μ L)终止反应,通过测定450nm处的吸光值(Benchmark micloplate reader),定量结合的特异性抗体。结果显示为n=3的平均值和标准差，表示为相对于对照的百分比。图10显示了上述试验结果的一个例子。药理试骀结果(I)受试物质促进SH-SY5Y细胞中的BDNF表达根据药理试验I的结果(图1)，可以确认通过用受试物质处理SH-SY5Y细胞，BDNF的表达在mRNA水平随时间而升高。此外，在培养24小时后，受试物质对BDNF的诱导强度与作为阳性对照的维甲酸相同。根据药理试验2的结果(图2和图3)，可以确认通过用受试物质处理SH-SY5Y细胞，BDNF和BDNF以外的神经营养因子(NGF、NT_3)的表达在mRNA水平升高。但是，作为神经营养因子高亲和性受体的TrkA或TrkB的表达未升高。此外，在这些试验中，可认为受试物质的BDNF表达促进效果存在最适浓度(10mNU/mL)。进一步的,根据药理试验3的结果(图4),可以确认通过用lOmNU/mL以上浓度的受试物质处理，细胞内的BDNF量(蛋白质水平)显著升高。另一方面，为了测定分泌到胞外的游离BDNF的量，测定了培养上清中的BDNF的量，但并未检测到(检测下限3. 9pg/mL)。这与之前的Balkowiec等人报告的内容相同(The Journal of Neuroscience,第20卷,第7417-7423页，2000年)，认为是由于游离BDNF被TrkB即时的摄入到细胞内。(2)受试物质促进BDNF等表达的机制已知BDNF等的表达受位于Trk受体下游的Ras-MAP激酶级联反应、CREB磷酸化等细胞内信号转导级联反应控制(Current Opinion in Neurobiology,第11卷,第272-280页，2001年)。与BDNF的表达同样地，原癌基因c-Fos的表达也由于CREB的活化而增加，根据药理试验4的结果(图5)，可以确认通过用受试物质处理SH-SY5Y细胞，促进了 c-Fos的表达。此外，根据药理试验5的结果(图6)，可以确认通过用受试物质处理SH-SY5Y细胞，在10分钟以内CREB的第133位丝氨酸残基的磷酸化及其上游调节因子p42/44MAP激酶(ERK1/2)的磷酸化得到促进。此外，在使用PC12细胞、施旺细胞的试验体系中，发现受试物质促进ERK1/2的磷酸化。自细胞外投与BDNF，也同样促进上述CREB和42/44MAP激酶的磷酸化，如图I所示，受试物质对BDNF的表达促进作用花费相对较长的时间，这可能是因为胞外释放得到促进的BDNF并非间接地引发所述受试物质的作用。此外，与该结果相符的是，虽然PI3K、MEK1/2、P 38MAPK中的任一个都是始于TrkB受体的CREB活化通路的调节因子(居中的蛋白质)，根据药理试验6的结果(图7)可以确认，这些调节因子的抑制剂抑制了受试物质对BDNF的表达促进作用。因此，Akt的磷酸化、ERK1/2的磷酸化和CREB的磷酸化分别被PI3K抑制剂(LY294002)、MEKl/2抑制剂(PD98059)和p38MAPK抑制剂(SB203580)抑制。由此可见，受试物质的作用靶是上游信号转导级联反 应，例如PI3K/MAP激酶通路、Ras-MAP激酶级联反应。另一方面，根据药理试验7的结果(图8)可以确认，受试物质不增加cAMP的胞内水平，特别是浓度为50mNU/mL的受试物质还显著抑制cAMP的胞内水平，其中，cAMP是不同于CREB活化中的上述通路的通路的调节因子。根据这一结果，受试物质活化MAP激酶通路而非cAMP依赖性蛋白激酶通路，促进与CREB相关的转录，从而促进BDNF和c-Fos的表达。(3) TrkB对受试物质作用的参与已知MAP激酶/CREB通路中的神经作用是通过TrkB活化而协同调节的，根据上述药理试验，可知TrkB参与了受试物质的作用。具体而言，通过药理试验8的结果(图9)，确认在酪氨酸激酶抑制剂K252a或TrkB的特异性抗体的存在下，受试物质所促进的BDNF表达几乎被完全抑制。由此可见，受试物质活化的是直接以TrkB为靶的内源性酪氨酸激酶，通过活化MAP激酶/CREB通路促进BDNF的表达。此外，通过药理试验9的结果(图10)，确认用受试物质处理48小时时，细胞表面的TrkB表达显著减少,可认为发生了 TrkB向细胞内的摄入。由此可见，本发明可以导出以下内容。但是，以下内容仅作为示例，本发明不限于此。(I) 一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其以对细胞内的神经营养因子的表达的作用为指标。(2)根据(I)所述的判断或评价方法，其中，作用是促进表达的作用。(3)根据⑴或⑵所述的判断或评价方法，其中，神经营养因子是BDNF。(4)根据(I)或⑵所述的判断或评价方法，其中，神经营养因子是NGF或NT-3。(5) 一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其以对细胞内的CREB的作用为指标。(6)根据(5)所述的判断或评价方法，其中，作用是促进CREB磷酸化的作用。(7)根据(6)所述的判断或评价方法，其中，促进CREB磷酸化的作用以测定c-Fos的产生为指标。(8) 一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其以对活化细胞内的位于MAP激酶/CREB通路中的蛋白质的作用为指标。(9)根据(8)所述的判断或评价方法，其中，作用是促进蛋白质磷酸化的作用。(10)根据(9)所述的判断或评价方法，其中，位于MAP激酶/CREB通路中的蛋白质是MEK/ERK通路中的蛋白质。(11)根据(10)所述的判断或评价方法，其中，MEK/ERK通路中的蛋白质是Grb2、Sos、Ras, Raf、MEK1/2、ERKI/2 或 Rsk。
(12)根据(11)所述的判断或评价方法，其中，位于MAP激酶/CREB通路中的蛋白质是PI3K/Akt通路中的蛋白质。(13)根据(12)所述的判断或评价方法，其中，PI3K/Akt通路中的蛋白质是PI3K、Akt 或 P38MAPK。(14)根据⑴至(13)中任一项所述的判断或评价方法，其中，细胞是培养细胞。(15)根据(14)所述的判断或评价方法，其中，细胞是SH-SY5Y细胞。(16)根据(I)至(15)中任一项所述的判断或评价方法，其中，炎症组织是皮肤组织。(17)根据(I)至(15)中任一项所述的判断或评价方法，其中，炎症组织是兔的炎症皮肤组织。 (18) 一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物，其通过(I)至(17)中任一项所述的判定或评价方法确保了质量标准。(19) 一种确保接种痘苗病毒的炎症组织提取物的质量标准的方法，其通过进行
(I)至(17)中任一项所述的判定或评价方法，确保质量标准。产业h的可利用件根据以接种痘苗病毒的炎症组织提取物为受试物质的上述药理试验的结果可知，通过用所述提取物处理培养细胞，从而通过活化TrkB使MAP激酶/CREB通路活化，提高BDNF和c-Fos等的表达。因此，可以通过测定BDNF等的表达或与其相关的蛋白质活化，对接种痘苗病毒的炎症组织提取物进行判断或评价、或用于确保所述提取物的药效等。换言之，市售的接种痘苗病毒的家兔炎症皮肤提取液制剂用于治疗慢性疼痛相关疾病时效果优秀和安全性高，因此是长年广泛使用的药剂。接种痘苗病毒的家兔炎症皮肤提取液的有效成分不明，因此使用作为疼痛阈值低于正常动物的慢性应激动物的SART应激小鼠这类非常费事的方法来确保质量。与此相对，本发明的判断或评价方法可以在使用培养细胞的体外试验中实施，与使用特殊的疾病模型动物的判断方法相比，是用于确保接种痘苗病毒的炎症组织提取物的质量的简单快速的判断或评价方法，非常实用。
权利要求
1.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其以对细胞内的神经营养因子的表达的作用为指标。
2.根据权利要求I所述的判定或评价方法，其中，作用是促进表达的作用。
3.根据权利要求I或2所述的判定或评价方法，其中，神经营养因子是BDNF。
4.根据权利要求I或2所述的判定或评价方法，其中，神经营养因子是NGF或NT-3。
5.—种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其以对细胞内的CREB的作用为指标。
6.根据权利要求5所述的判定或评价方法，其中，作用是促进CREB的磷酸化的作用。
7.根据权利要求6所述的判定或评价方法，其中，促进CREB的磷酸化的作用以测定C-Fos的产生为指标。
8.—种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其以对活化细胞内的位于MAP激酶/CREB通路中的蛋白质的作用为指标。
9.根据权利要求8所述的判定或评价方法，其中，作用是促进蛋白质的磷酸化的作用。
10.根据权利要求9所述的判定或评价方法，其中，位于MAP激酶/CREB通路中的蛋白质是MEK/ERK通路中的蛋白质。
11.根据权利要求10所述的判定或评价方法，其中，MEK/ERK通路中的蛋白质是Grb2、Sos、Ras、Raf、MEKl/2、ERKl/2 或 Rsk。
12.根据权利要求11所述的判定或评价方法，其中，位于MAP激酶/CREB通路中的蛋白质是PI3K/Akt通路中的蛋白质。
13.根据权利要求12所述的判定或评价方法，其中，PI3K/Akt通路中的蛋白质是PI3K、Akt 或 P38MAPK。
14.根据权利要求I至13中任一项所述的判定或评价方法，其中，细胞是培养细胞。
15.根据权利要求14所述的判定或评价方法，其中，细胞是SH-SY5Y细胞。
16.根据权利要求I至15中任一项所述的判定或评价方法，其中，炎症组织是皮肤组织。
17.根据权利要求I至15中任一项所述的判定或评价方法，其中，炎症组织是兔的炎症皮肤组织。
18.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物，其通过权利要求I至17中任一项所述的判定或评价方法确保了质量标准。
19.一种确保接种痘苗病毒的炎症组织提取物的质量标准的方法，其通过进行权利要求I至17中任一项所述的判定或评价方法，确保质量标准。
全文摘要
本发明的目的是提供接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其以促进培养细胞内的BDNF等神经营养因子的产生、及促进与其相关的蛋白质的活化为指标。本发明涉及接种痘苗病毒的炎症组织提取物的新型判定或评价方法，所述方法以促进培养细胞内的BDNF等神经营养因子的产生、或促进与BDNF等产生相关的细胞内信号转导通路中的各种蛋白质的活化为指标，对所述提取物进行判定或评价。本发明为简单迅速的判定或评价的方法，用于确保可用作药物的所述提取物的质量，非常有效。
文档编号C12Q1/00GK102959400SQ20118003156
公开日2013年3月6日 申请日期2011年6月23日 优先权日2010年6月25日
发明者武藤多津郎, 福田有 申请人:日本脏器制药株式会社