动物模型及治疗分子的制作方法

专利名称：动物模型及治疗分子的制作方法
动物模型及治疗分子
背景技术：
本发明涉及非人动物和细胞，它们被工程化而含有外源DNA，如人免疫球蛋白基因DNA，本发明还涉及它们在医学和疾病研究中的应用，产生非人动物和细胞的方法，以及由这种动物产生的抗体和抗体链及其衍生物。为了解决人源化抗体的问题，许多公司着手产生具有人免疫系统的小鼠。使用的策略是敲除ES细胞中的重链和轻链基因座并且用设计为表达人重链和轻链基因的转基因互补这些遗传损害。尽管可以产生完全人抗体，但是这些模型具有一些主要限制:(i)重链和轻链基因座的大小(均几Mb)使得在这些模型中不能导入完整基因座。结果获得的转基因品系具有非常有限的V区组成部分，丧失了大多数恒定区并且重要的远端增强子区未包含在转基因中。(ii)产生大插入物转基因品系的极低效率以及将这些杂交进重链和轻链敲除品系以及使它们再次纯合的复杂性和所需要的时间，限制了可以被分析而优化表达的转基因
品系数量。(iii)个体抗体亲和性很少会达到从完整动物(非转基因)中可获得的程度。W02007117410揭示了表达嵌合抗体的嵌合构建体。W02010039900揭示了具有编码嵌合抗体的基因组的敲入(knock in)细胞和哺乳动物。本发明提供了在非人类哺乳动物中产生包含人类Ig可变区的抗体的方法，本发明进一步提供了产生这种抗体的非人动物模型。发明概述一方面，本发明涉及非人类哺乳动物，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区及一或多个人类J区；(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链K V区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合抗体轻链或重链的所有组成成分(repertoire)。一方面，本发明涉及非人类哺乳动物，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链K V区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；及(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区；其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合轻链或重 链的所有组成成分。
一方面，本发明涉及非人类哺乳动物细胞，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，及(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链K V区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区。一方面，本发明涉及非人类哺乳动物细胞，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链K V区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；及(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区。另一方面，本发明涉及产生非人类细胞或哺乳动物的方法，包括在非人类哺乳动物细胞基因组例如ES细胞基因组中插入:(a)多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区在宿主非人类哺乳动物恒定区上游 '及(b)任选地，一或多个人类Ig轻链K V区和一或多个人类Ig轻链K J区在宿主非人类哺乳动物K恒定区上游和/或一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λJ区在宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游；所述插入是使得所 述非人类细胞或哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体的所有组成成分，其中步骤(a)和(b)可以任意顺序进行并且(a)和(b)步骤的每一步可以逐步或单步进行。插入可以通过同源重组实现。另一方面，本发明涉及产生特异于希望抗原的抗体或抗体链的方法，所述方法包括用希望抗原免疫本文揭示的转基因非人类哺乳动物及回收所述抗体或抗体链。另一方面，本发明涉及产生完全人源化抗体的方法，包括用希望抗原免疫本文揭示的转基因非人类哺乳动物，回收所述抗体或产生所述抗体的细胞，然后例如通过蛋白质或DNA工程用人类恒定区置换非人类哺乳动物恒定区。另一方面，本发明涉及根据本发明产生的人源化抗体和抗体链，所述抗体和抗体链均是嵌合的(例如小鼠-人类)及完全人源化形式，以及所述抗体和抗体链的片段和衍生物，以及涉及所述抗体、抗体链和片段在医学包括诊断中的应用。另一方面，本发明涉及本文揭示的非人类哺乳动物作为模型检测药物和疫苗的应用。附图简述

图1-8示出在小鼠Ig基因座中插入一系列人类BAC的重复过程。图9-18更详细示出针对IgH和κ基因座的图1_8的过程。图19和20示出在嵌合小鼠中的抗体产生原理。图21示出在小鼠染色体中人类DNA的可能插入位点。图22-26示出在小鼠Ig基因座中插入一系列人类BAC的另一重复过程。
图27-29示出宿主VDJ区倒位的机制。图30示出使用RMCE方法插入质粒的原理证据。图31示出在着陆区(Landing Pad)中相继的RMCE-整合。图32示出证实成功插入着陆区中。图33示出3’末端消除(End Curing)的PCR证实。图34示出BAC#1插入和PCR诊断。图35示出JH和JK使用。图36示出DH使用。图37示出在来自嵌合小鼠的人类VDJCy转录物中⑶R-H3长度分布。图38示出在IGH-VDI或IGK-VJ连接中缺失和插入核苷酸数的分布。图39示出每个VH内JH使用的分布。图40示出每个VH内DH使用的分布。图41示出在V J连接点核苷酸获得或丧失产生IGK变体。图42示出J区内的超变产生IGK变体。图43示出连接多样性产生功能性⑶S。SEQ ID No:1是大鼠转换序列。SEQ ID No: 2是着陆区祀向载体的序列(长版本)。SEQ ID No: 3是着陆区靶向载体的序列(较短版本)。SEQ ID No:4是小鼠品系129转换序列。SEQ ID No: 5是小鼠品系C57转换序列。SEQ ID No:6是着陆区的5’同源臂。SEQ ID No:7 是寡核苷酸 HV2-5SEQ ID No:8 是寡核苷酸 HV4-4SEQ ID No: 9 是寡核苷酸 HV1-3SEQ ID No: 10 是寡核苷酸 HV1-2SEQ ID No: 11 是寡核苷酸 HV6-1SEQ ID No: 12 是寡核苷酸 CμSEQ ID No: 13 是寡核苷酸 KV1-9SEQ ID No: 14 是寡核苷酸 KV1-8SEQ ID No: 15 是寡核苷酸 KV1-6SEQ ID Νο:16 是寡核苷酸 KV1-5SEQ ID No: 17 是寡核苷酸 C κ。一般描述除非特别指出，小鼠的所有核苷酸坐标是相应于小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37的那些，例如 April2007ENSEMBL Release55.37h,如 NCBI37July2007(NCBI build37)(如 UCSC version mm9, 见 www.genome, ucsc.edu 和 http://genome, ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.himl)。除非特别指出，人核苷酸坐标是相应于GRCh37(如UCSC versionhgl9, http://genome, ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)、Feb2009ENSEMBL Release55.37的那些或者是相应于NCBI36，Ensemble release54的那些。除非特别指出，大鼠核苷酸是相应于 RGSC3.4Dec2004ENSEMBL release55.34w 或者 Baylor College of Medicine HGSCv3.4Nov2004 的那些(例如 UCSC rn4,见 www.genome, ucsc.edu 和 http: //genome, ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)。在本发明中，我们揭示了在非人类哺乳动物如小鼠中构建嵌合人类重链和轻链基因座的方法。在小鼠中进行的研究只是为了例证，除非特别指出，在小鼠中进行的研究可以包括所有非人类哺乳动物，优选小鼠作为非人类哺乳动物。—方面，本发明涉及非人类哺乳动物，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，及(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或抗体链的所有组成成分。另一方面，本发明涉及非人类哺乳动物，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物κ恒定区上游的多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区，及(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类 J区；其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体的所有组成成分。任选地，所述非人类哺乳动物基因组被修饰为阻止完全宿主物种特异性抗体的表达。一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类重链可变(V)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类V基因。一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类重链多样性(D)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类D基因。一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类重链连接(J)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类J基因。一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类轻链可变(V)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类轻链V基因。一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类轻链连接(J)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类轻链J基因。插入的人类基因可衍生自相同或不同个体，或者是合成的或者代表人类共有序列。一方面，尽管V、D和J区的数目在人类个体之间是可变的，但是据认为在重链上有51个人类V基因、27个D基因和6个J基因，在κ轻链上有40个人类V基因和5个J基因以及在λ轻链上有29个人类V基因和4个J基因(Janeway andTravers, Immunobiology, Third edition)。一方面，插入所述非人类哺乳动物中的人类重链基因座含有人类V、D和J区的所有组成成分，在基因组中其与非人类哺乳动物恒定区功能性排列，由此在人类可变区与非人类哺乳动物恒定区之间可以产生功能性嵌合抗体。全部插入的人类重链遗传物质在本文称作人类IgH VDJ区，包含来自人类基因组的DNA，其编码编码人类V、D和J部分的所有外显子及适当地也包含相关内含子。相似地，本文提及人类Ig轻链κ V和J区是指包含编码人类基因组的V和J区的所有外显子及适当地也包含相关内含子。本文提及人类Ig轻链λ V和J区是指包含人类基因组的编码V和J区的所有外显子及适当地也包含相关内含子的人类DNA。人类可变区适当地插入在非人类哺乳动物恒定区上游，后者包含编码全部恒定区或者所述恒定区足够部分所需的所有DNA，以形成能特异性识别抗原的有效的嵌合抗体。一方面，所述嵌合抗体或抗体链具有一部分宿主恒定区，足以提供在宿主哺乳动物中天然发生的抗体中可见的一或多种效应物功能，例如其能与Fe受体相互作用和/或结合补体。本文提及具有宿主非人类哺乳动物恒定区的嵌合抗体或抗体链因此不限于完整恒定区，也包括具有所有宿主恒定区或者其足以提供一或多种效应物功能的一部分的嵌合抗体或抗体链。这也适用于本发明的非人类哺乳动物和细胞及方法，其中人类可变区DNA可插入宿主基因组中，由此形成具有全部或部分宿主恒定区的嵌合抗体链。一方面，全部的宿主恒定区与人类可变区DNA可操纵地连接。本文所述宿主非人类哺乳动物恒定区优选是内源宿主野生型恒定区，位于合适的重链或轻链的野生型基因座。例如，人类重链DNA适当地插入在小鼠染色体12上，适当地与小鼠重链恒定区相邻。 一方面，人类DNA如人类VDJ区的插入靶向于在小鼠基因组IgH基因座中J4外显子与C μ基因座之间的区域，及一方面插入在坐标114，667，090与114,665，190之间，或者在坐标114，667，091，在114，667，090之后。一方面，人类DNA如人类轻链κ VJ的插入靶向于小鼠染色体6中坐标70，673，899与70，675，515之间，适当地在位置70，674，734，或者在染色体16上λ小鼠基因座等价位置。—方面，形成嵌合抗体的宿主非人类哺乳动物恒定区可以在不同的(非内源)染色体基因座。在这种情况中，插入的人类DNA如人类可变VDJ或VJ区然后可被插入非人类基因组中，位于与天然发生的重链或轻链恒定区不同的位置。所述天然恒定区可以在与天然位置不同的染色体基因座插入基因组中或者在基因组中复制，由此其与人类可变区功能性排列，由此仍可产生本发明的嵌合抗体。一方面，所述人类DNA插入在内源宿主野生型恒定区，位于宿主恒定区与宿主VDJ区之间的野生型基因座。提及位于非人类哺乳动物恒定区上游的可变区的位置是指存在两个抗体部分可变区与恒定区的合适的相对位置，以使得所述可变区与恒定区在哺乳动物体内形成嵌合抗体或抗体链。因此，插入的人类DNA和宿主恒定区是彼此功能性排列的以产生抗体或抗体链。一方面，插入的人类DNA通过同种型转换而能与不同的宿主恒定区一起表达。一方面，同种型转换不需要或包含反式转换。人类可变区DNA插入在与相关宿主恒定区相同染色体上意味着不需要反式转换以产生同种型转换。如上所述，用于现有技术模型的转基因基因座是人源的，因此即使在所述转基因能互补小鼠基因座以便小鼠产生产生完全人类抗体的B细胞的情况中，各个抗体亲和性也很少达到可得自完整(非转基因)动物的那些亲和性水平。主要原因是(除了上述所有组成成分和表达水平之外)所述基因座的控制元件是人类的事实。因此，例如激活高亲和性抗体超变和选择的信号传导成分被损害。相反，在本发明中，宿主非人类哺乳动物恒定区得以保持，且优选至少一个非人类哺乳动物增强子或其他控制序列如转换区保持与非人类哺乳动物恒定区功能性排列，由此如在宿主哺乳动物中所见的所述增强子或其他控制序列的作用在转基因动物中得以全部或部分发挥。这种方法被设计为允许取样的人类基因座的完全多样性、允许与非人类哺乳动物控制序列如增强子达到相同高的表达水平，及由此在B细胞中的信号传导例如使用转换重组位点的同种型转换将仍使用非人类哺乳动物序列。具有这种基因组的哺乳动物将产生具有人类可变区与非人类哺乳动物恒定区的嵌合抗体，但是这些抗体可易于例如在一个克隆步骤中人源化。此外，这些嵌合抗体的体内效力可以在这些相同动物中评估。一方面，插入的人类IgH VDJ区在种系构型中包含来自于人类的所有V、D和J区及插入序列。一方面，将800_1000kb的人类IgH VDJ区插入非人类哺乳动物IgH基因座，及一方面，插入940、950或960kb片段。适当地，这包括来自人类染色体14的碱基105，400，051-106，368，585。一方面，插入的IgH人类片段由来自染色体14的碱基105，400，051-106，368，5 85组成。一方面，插入的人类重链DNA如由来自染色体14的碱基105，400，051-106，368，585组成的DNA插入在小鼠染色体12中小鼠J4区末端与E μ区之间，适当地在坐标114，667, 090与114，665，190之间，或者在坐标114，667，091，在114，667，090之后。一方面，所述插入在坐标114，667，089与114，667，090之间(坐标参照小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37)，或者在另一非人类哺乳动物基因组的等价位置。一方面，插入的人类KVJ区在种系构型中包含来自人类的所有V和J区及插入序列。合适地，这包括来自人类染色体2的碱基88，940，356-89，857，000，适当地为大约917kb。另一方面，所述轻链VJ插入物可包含仅V节段和J节段的近端簇(proximalcluster)。这种插入物为大约473kb。一方面,人类轻链κ DNA如来自人类染色体2的碱基88，940, 356-89，857，000的人类IgK片段被适当地插入小鼠染色体6中坐标70，673，899与70，675，515之间，适当地在位置70，674，734。这些坐标对于人类基因组是指NCBI36，ENSEMBL Release54，对于小鼠基因组是指与小鼠品系C57BL/6J相关的NCBM37。—方面，所述人类λ VJ区在种系构型中包含来自人类的所有V和J区及插入序列。适当地，这包括来自人类染色体2的针对κ片段选择的那些碱基的类似碱基。在一个实施方案中，本发明的细胞或非人类哺乳动物包含在小鼠染色体12坐标114，666，183 与 114，666，725 之间如在 114，666，283 与 114，666，625 之间、任选地在坐标 114，666，335 与 114，666，536 之间、任选地在 114，666，385 与 114，666，486 之间或者在 114，666,425 与 114，666，446 之间或者在 114，666,435 与 114，666，436 之间或者在不同小鼠品系的小鼠染色体12的等价位置或者在另一非人类脊椎动物如大鼠基因组中等价位置插入人类重链可变区DNA，所述小鼠染色体12参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBM37。在与小鼠品系C57BL/6J相关的坐标114, 666,435与114，666，436之间的插入与参照geneBank登记号NT114985.2的129/Sv J基因组序列的染色体2上坐标1207826与1207827之间的插入等价。可以在另一基因组如另一小鼠基因组中等价位置插入。在这个实施方案的实例中，本发明的细胞或哺乳动物包含人类IgH VDJ区，其包含或由参照GRCH37/hgl9序列数据库的人类染色体14的106，328，851-107, 268，544位核苷酸如 106，328，901-107, 268，494 位核苷酸如 106，328，941-107，268，454 位核苷酸、如106，328，951-107，268，444位核苷酸组成，或者插入来自不同人类序列或数据库的染色体14的等价核苷酸。所述人类插入可以在上述区域之间进行。在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含人类K VJ区的插入，其在种系构型中适当地包含或由来自人类的所有V和J区及插入序列组成，人类DNA的插入在小鼠染色体6的坐标70，673，918-70，675，517之间如在坐标70,674,418与70,675,017之间、如在坐标 70，674，655-70，674，856 之间、如在坐标 70，674，705-70，674，906 之间、如在坐标 70，674，745-70，674，766 之间、如在坐标 70，674，755 与 70，674，756 之间，编号参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBIM37，或者包含在另一基因组如另一小鼠基因组的等价位置的插入。在这个实施方案的一个实例中，本发明的细胞或哺乳动物包含插入参照GRCH37/hgl9序列数据库的人类染色体2的89，159，079-89，630，437和/或89，941，714-90，266，976位核苷酸(或者来自不同的人类序列或数据库的染色体2的等价核苷酸)，如插入没有插入序列的这两个分离的片段，或者插入完整的89，159，079-90，266，976 区域。所述插入物可包含或由如下核苷酸组成:⑴任选地除了下述片段(ii)之外，核苷酸89，158，979-89，630，537，如89，159，029-89，630，487，如 `89，159，069-89，630，447，如 89，159，079-89，630，437，(ii)任选地除了片段⑴之夕卜，核苷酸89，941，614-90，267，076，如89，941，664-90，267，026，如 89，941，704-90，266，986，如 89，941，714-90，266，976，(iii)核苷酸 89，158，979-90，267，076，如核苷酸 89，159，079-90，266，976。人类插入物可以在上述区域之间。在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含插入人类λ区，其包含至少一个人类J λ区(例如种系区)和至少一个人类C λ区(例如种系区)，任选地CA6和/或CJ0例如，所述细胞或哺乳动物包含多个人类JX区，任选地夂1、夂2、夂6和JA7中的两或更多个，任选地所有Ja 1、Ja2> ^6和Ja7。在一个实例中，所述细胞或哺乳动物包含至少一个人类Ja_Ca簇，任选地至少Ja7-Ca7。一方面，所述人类JC簇插入在最后的内源J λ区的3’或者插入在最后的内源J κ区的3’，适当地紧邻这些序列的3’，或者基本上紧邻这些序列的3’。一方面，插入小鼠λ基因座中是在内源Cl基因节段的下游，例如在存在3’ JlCl簇的情况中，适当地紧邻Cl节段的3’，或者基本上紧邻该节段的3’。
一方面(如细胞或非人类哺乳动物)，人类JC簇插入在κ基因座中，任何所得细胞或动物在该基因座是杂合的，由此所述细胞具有其中在κ基因座插入人类λ DNA的一条染色体，及在内源κ基因座具有人类κ DNA的另一条染色体。在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含人类E λ增强子。本发明的细胞或哺乳动物包含插入的人类XVJ区，适当地在种系构型中包含或由来自人类的所有V和J区以及插入序列组成，插入的区域包含或由来自参照GRCH37/hgl9序列数据库的人类染色体22的核苷酸22，375，509-23，327，984如核苷酸 22，375，559-23，327，934、如核苷酸 22，375，599-23，327，894、如核苷酸22，375，609-23，327，884组成，或者来自另一人类序列或数据库的等价DNA。在小鼠基因组中的插入可以在小鼠染色体16的坐标19,027，763与19，061，845之间，如在坐标19,037, 763与19，051，845之间，如在坐标19,047,451与19，047，652之间，如在坐标19,047,491与19，047，602之间，如在坐标19,047, 541与19,047, 562之间，如在坐标19，047，551与19，047，552之间(参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBIM37,等价于序列文件NT_039630.4中129SvJ基因组序列的坐标1，293，646-1，293，647)，或者可以插入在其它基因组如另一小鼠基因组中的等价位置。人类λ核酸插入在小鼠基因组中或者可以在小鼠染色体6的坐标70，673，918与70，675，517之间，如在坐标70，674，418与70,675,017之间，如在坐标70, 674, 655与70，674，856之间，如在坐标70, 674, 705与70，674，806之间，如在坐标70，674，745与70，674，766之间，如在坐标70，674，755与70，674，756之间(参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBM37)或者另一基因组的等价位置。人类插入物可以在上述区域之间。上述所有人类特异性片段的长度可以变化，可例如比上述更长或更短，如500碱基，IKB, 2Κ，3Κ，4Κ，5ΚΒ, 10ΚΒ, 20KB, 30KB, 40ΚΒ或50ΚΒ或更多，适当地包含全部或部分人类V(D) J区域，同时适当地优选保持最后插入的需求以包含编码完整重链区和轻链区的人类遗传材料。一方面，上述人类插入物的5’末端的长度增加。在所述插入物是以逐步方式产生的情况中，所述长度增加通常是关于上游(5，)克隆。一方面，最后插入的人类基因、通常是要插入的最后的人类J基因的3’末端距人类-小鼠连接区少于2kb，优选少于1KB。一方面，所述非人类哺乳动物包含本文所述一些或全部人类轻链κ VJ区，但是无人类轻链λ VJ区。一方面，所述细胞或非人类哺乳动物包含完全的人类λ基因座(来自人类的λ VJC区)，嵌合的K基因座(与宿主K恒定区可操纵地连接的人类K VJ区)及嵌合的重链基因座，其具有与宿主重链恒定区可操纵地连接的人类VDJ区。另一方面，所述基因组包含在重链基因座和一个轻链基因座或者在重链基因座和两个轻链基因座插入本文所述的V、D (只是重链)和J基因。优选所述基因组在一个、两个或所有三个基因座是纯合的。另一方面，所述基因座在一或多个基因座可以是杂合的，如对于编码嵌合抗体链和天然(宿主细胞)抗体链的DNA是杂合的。一方面， 所述基因组对于能编码本发明两个不同抗体链例如包含2个不同的嵌合重链或2个不同的嵌合轻链的DNA可以是杂合的。
一方面，本发明涉及本文所述的非人类哺乳动物或细胞，以及产生所述哺乳动物或细胞的方法，其中插入的人类DNA如人类IgH VDJ区和/或轻链V、J区仅在所述哺乳动物或细胞的一个等位基因而不是两个等位基因上发现。在此方面，哺乳动物或细胞具有表达内源宿主抗体重链或轻链及嵌合重链或轻链的潜力。 另一方面，所述人类VDJ区或轻链VJ区不作为整体使用，而是可以使用来自其它物种的等价人类VDJ或VJ区的部分如外显子，如来自其它物种的一或多个V、D或J外显子或者来自其它物种的调节序列。一方面，代替人类序列使用的序列不是人类或小鼠序列。一方面，使用的序列可以来自啮齿类动物或者灵长类动物如黑猩猩。例如，来自除了人类之外的灵长类动物的1、2、3、4或更多个或全部J区可用于置换本发明细胞和动物的VDJ/VJ区中的1、2、3、4或更多个或全部人类J外显子。另一方面，插入的人类DNA如人类IgH VDJ区和/或轻链VJ区可以如此插入，由此其在基因组中与来自非人类非小鼠物种如啮齿类动物或灵长类动物序列如大鼠序列的mu恒定区可操纵地连接。在本发明中从中可以使用的DNA元件的其它非人类非小鼠物种包括兔、lamas、单峰骆驼、羊驼、骆驼和鲨鱼。一方面，插入的人类DNA如人类VDJ或VJ区与内源宿主mu序列不是可操纵地连接，而是与非宿主mu序列可操纵地连接。可操纵地连接适当地允许产生包含所述人类可变区的抗体重链或轻链。一方面，插入的人类DNA如人类IgH VDJ区(和/或轻链VJ区)可以与mu恒定区核酸一起插入宿主染色体中，所述mu恒定区核酸不是宿主mu恒定区核酸，优选是来自非小鼠非人类物种的的mu恒定区。适当地，插入的人类DNA如人类VDJ区(和/或轻链VJ区)与非人类非小鼠mu序列可操纵地连接，且能形成嵌合抗体重链或轻链。在另一方面，非小鼠非人类mu可以插入宿主染色 体中与人类可变区分开的遗传元件上，或者在基因组中不同的位置，适当地与可变区可操纵地连接，由此可以形成嵌合抗体重链或轻链。另一方面，本发明涉及非人类哺乳动物或细胞，其基因组包含多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，位于宿主非人类哺乳动物轻链恒定区上游，排列成所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。本发明还涉及非人类哺乳动物或细胞，其基因组另外或或者包含多个人类Ig轻链V区和一或多个人类J区，位于宿主非人类哺乳动物重链恒定区上游，由此所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。所述细胞或哺乳动物可以能表达具有重链和轻链包括如上述至少一个嵌合抗体链的抗体。插入的人类重链可变区可以是本文所述任一个，可以插入在上述位置以插入入和κ恒定区的5’。同样，插入的人类轻链可变区可以是上述那些，可以插入在上述位置以插入重链恒定区的5’。例如，本发明的基因组或细胞或非人类哺乳动物可编码抗体，所述抗体包含具有位于小鼠轻链恒定区上游的人类重链可变区的抗体链，或者包含具有位于小鼠重链恒定区上游的人类轻链可变区的抗体链，组合如下一个链:完全的人类抗体轻链；完全的人类抗体重链；非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠)抗体轻链；
非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠)抗体重链；嵌合的非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠)_人类抗体链；具有位于非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠)轻链恒定区上游的人类重链可变区的抗体链；具有位于非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠)重链恒定区上游的人类轻链可变区的抗体链。本发明还涉及转基因，其编码位于宿主非人类哺乳动物轻链恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，任选地包含于载体内。本发明还涉及转基因，其编码位于宿主非人类哺乳动物重链恒定区上游的多个人类Ig轻链V区和一或多个人类轻链J区，任选地包含于载体内。一方面，本发明涉及细胞或非人类哺乳动物，其基因组包含:位于全部或部分人类κ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区。另一方面，本发明涉及细胞或非人类哺乳动物，其基因组包含:位于全部或部分人类λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区。适当地，所述轻链V J和C区能形成在体内可与抗原特异性反应的抗体链。一方面，本发明涉及在插入的轻链区中没有非人类编码序列。在此方面，如本文所述，人类κ和/或λ区插入基因组中，组合插入重链VDJ区或其一部分，位于宿主重链恒定区上游。本发明的细胞或非人类哺乳动物可包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区；及(b)位于全部或部分非人类κ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区，其中所述非人类哺乳动物能产生具有包含非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的抗体链的抗体的所有组成成分。本发明的细胞或非人类哺乳动物可包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区；及位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；其中所述非人类哺乳动物能产生具有包含非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的抗体链的抗体的所有组成成分。适当地，如上述插入人类VJC轻链DNA或其一部分是在等价的小鼠基因座进行的。一方面，所述人类轻链KVJC DNA或其一部分插入在小鼠κ VJC区的紧邻上游或下游。一方面，所述人类轻链λ VJC区或其一部分插入在小鼠λ VJC区的紧邻上游或下游。一方面，仅插入人类κ VJC基因座而不是人类λ VJC基因座。一方面，仅插入人类λ VJC基因座而不是人类κ VJC基因座。可以使用本文所述的技术进行插入，及适当地不从基因组中除去宿主序列。一方面，所述非人类哺乳动物宿主VJC序列可以是一些方式失活的，通过突变或倒位、或者通过插入人类可变区DNA或者通过任何其它方式。一方面，本发明的细胞或非人类哺乳动物可包含插入完整的Vjc人类区域。所述人类κ可变区DNA可插入在基因组中，与λ恒定区功能性排列，例如插入在λ恒定区上游。或者，人类λ区可变DNA可与κ恒定区功能性排列插入，例如插入在κ恒定区上游。一方面，一或多个非人类哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人类哺乳动物Mu恒定区上游，适当地就其与所述恒定区的距离而言是在其天然位置。一方面，一或多个非人类哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人类哺乳动物Mu恒定区下游，适当地就其与所述恒定区的距离而言是在其天然位置。一方面，非人类哺乳动物转换序列、适当地为内源转换序列保持在非人类哺乳动物Mu恒定区上游，适当地就其与所述恒定区的距离而言是在其天然位置。在这种位置中，所述宿主增强子或转换序列在体内与宿主恒定区序列是可操纵的。一方面，转换序列既不是人类序列，也不是非人类哺乳动物中天然的，例如一方面，非人类哺乳动物转换序列不是小鼠或人类转换序列。所述转换序列可以是例如啮齿类动物或灵长类动物序列，或者是·合成的序列。特别地，所述转换序列可以是大鼠序列，其中所述非人类哺乳动物是小鼠。例如，小鼠或人类恒定区mu序列可以置于来自大鼠或黑猩猩的转换序列或者其它转换序列的控制下，适当地能允许在体内发生同种型转换。一方面，本发明的转换序列是这样的转换序列，其包含重复序列GGGCT的3、4、5、6或更多次连续重复，如大鼠转换序列。“大鼠转换序列”在本文是指所述转换序列是相应于来自大鼠基因组的转换序列的野生型转换序列或者衍生自这种转换序列的序列。一方面，本发明的转换序列是包含如下重复的大鼠转换序列:GAGCT(296次重复)，GGGGT (50次重复)和GGGCT (83次重复)。在一个实例中，所述大鼠转换序列包含或者由SEQ ID No:l所示序列组成。在这些实施方案中，及其中所述非人类哺乳动物是小鼠或者所述细胞是小鼠细胞的情况中，转换序列任选地是如本文所述大鼠转换序列。或者，本发明细胞或哺乳动物中存在的转换序列是小鼠转换序列，例如来自小鼠如小鼠129品系或小鼠C57品系，或者来自衍生于其的品系，任选地包含或由SEQ ID No:4或5所示序列组成。“小鼠转换序列”在本文是指所述转换序列是相应于来自小鼠基因组的转换序列的野生型转换序列或衍生自这种转换序列的序列。在这个实施方案中，及其中所述非人类哺乳动物是小鼠或者所述细胞是小鼠细胞的情况中，所述小鼠转换序列任选地是内源转换序列或者是来自另一小鼠品系的小鼠转换序列。本发明的细胞或哺乳动物可因此包含人类或非人类哺乳动物转换序列及一或多个人类或非人类哺乳动物增强子区域。其可以在人类或非人类哺乳动物恒定区上游。优选地，所述控制序列能指导包含与其相关的恒定区的抗体表达或者另外控制抗体的产生。一种可以想见的组合是在小鼠细胞中大鼠转换序列与小鼠增强子序列及小鼠恒定区。一方面，本发明涉及细胞优选非人类细胞或非人类哺乳动物，其包含具有来自3或更多个物种的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，所述细胞或动物可包含宿主细胞恒定区DNA，一或多个人类V、D或J编码序列及一或多个非人类非宿主DNA区，其能控制免疫球蛋白基因座区域，如能控制Ig DNA的体内表达或同种型转换的转换序列、启动子或增强子。一方面，所述细胞或动物是小鼠，及另外包含来自人类Ig基因座的人类DNA以及另外包含非小鼠DNA序列，如能调节小鼠或人类DNA的大鼠DNA序列。另一方面，本发明涉及细胞优选非人类细胞或非人类哺乳动物，其包含具有来自2或更多个不同人类基因组的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，其在重链或轻链内可以包含来自一个以上人类基因组的重链V(D)J序列，或者来自一个基因组的重链VDJDNA及来自不同基因组的轻链VJ序列。一方面，本发明涉及DNA片段或细胞或非人类哺乳动物，其包含免疫球蛋白重链或轻链基因座或者其一部分，具有来自2或更多个物种的DNA，其中一个物种提供非编码区如调节区，其它物种提供编码区如V、D、J或恒定区。一方面，与不同的人类V、D或J区相关的人类启动子和/或其它控制元件在将人类VDJ插入小鼠基因组中之后保留。另一方面，优化人类区域如人类V区的一或多个启动子元件或者其它控制元件以与非人类哺乳动物的转录机制相互作用。适当地，人类编码序列可以置于合适的非人类哺乳动物启动子的控制下，其使得人类DNA在合适的非人动物细胞中有效转录。一方面，所述人类区域是人类V区编码序列，人类V区置于非人类哺乳动物启动子控制下。人类启动子或其它控制区由非人类哺乳动物启动子或控制区的功能性置换可以通过使用重组工程或者其它重组DNA技术进行，以将一部分人类Ig区(如人类V区)插入含有非人类Ig区的载体(如BAC)中。所述重组工程/重组技术适当地用人类Ig区置换一部分非人类(如小鼠)DNA，因此将人类Ig区置于非人类哺乳动物启动子或其它控制区的控制下。适当地， 人类V区的人类编码区置换小鼠V区编码序列。适当地，人类D区的人类编码区置换小鼠D区编码序列。适当地，人类J区的人类编码区置换小鼠J区编码序列。以此方式，人类V、D或J区可以置于非人类哺乳动物启动子如小鼠启动子的控制下。一方面，插入非人类哺乳动物细胞或动物中的唯一人类DNA是V、D或J编码区，这些区域被置于宿主调节序列或其它(非人类非宿主)序列控制下，一方面，提及人类编码区包括人类内含子和外显子，或者在另一方面仅是外显子而无内含子，其可以是cDNA形式。也可以使用重组工程或者其它重组DNA技术，将非人类哺乳动物(如小鼠)启动子或其它控制区如V区启动子插入含有人类Ig区的BAC中。然后重组步骤将一部分人类DNA置于小鼠启动子或其它控制区的控制下。本文所述方法也可以用于将来自人类重链的一些或全部V、D和J区插入轻链恒定区上游而不是重链恒定区上游。同样，一些或全部人类轻链V和J区可以插入在重链恒定区上游。插入可以在内源恒定区基因座，例如在内源恒定区与J区之间，可以只是一些或全部V、D或J基因，无启动子或增强子序列，或者可以是一些或全部V、D或J基因，具有一或多个或全部各自的启动子或增强子序列。一方面，种系构型中V、D或J片段的所有组成成分可以插入在宿主恒定区上游并与其功能性排列。因此，本发明允许来自人类或任何物种的V和/或D和/或J区插入来自不同物种的细胞的包含恒定区的染色体中，使得嵌合抗体链被表达。一方面，本发明仅需要一些人类可变区DNA插入非人类哺乳动物的基因组中，与在内源重链恒定区基因座区域的一些或全部人类重链恒定区可操纵地排列，由此可以产生抗体链。在本发明的这个方面及在另外插入人类轻链DNA的情况中，轻链DNA插入可以是完全人类构建体形式，具有人类可变DNA和人类恒定区DNA，或者具有人类可变区DNA和来自非人类非宿主物种的恒定区DNA。其它变化也是可能的，如插入轻链人类可变区和宿主基因组恒定区。此外，所述轻链转基因的插入不需要在等价内源基因座，可以在基因组中的任何位置。在这种方案中，所述细胞或哺乳动物可以产生嵌合重链(包含人类可变区DNA和小鼠恒定区DNA)及包含人类可变区和人类恒定区DNA的轻链。因此，在本发明的一方面，所述λ和/或κ人类可变区DNA可以插入在内源基因座上游或下游，或者实际在与内源基因座的不同染色体上，与或不与恒定区DNA —起插入。鉴于 人类轻链DNA插入在宿主非人类哺乳动物恒定区上游，本发明另一方面还涉及将一或两个轻链人类可变区插入在等价内源基因座恒定区下游或者基因组中其它位置。通常，优选在受体基因组中的等价内源基因座或者与其邻近处插入人类可变区DNA，例如在宿主免疫球蛋白基因座边界(上游或下游)1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOkb内插入。因此，一方面，本发明可涉及细胞或非人类哺乳动物，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区及一或多个人类J区；及(b) 一或多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区,和/或一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合轻链或重链的所有组成成分。在一个特殊方面，所述细胞或非人类哺乳动物的基因组包含:位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，位于宿主非人类哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区，及位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区，任选地其中所述人类λ可变区可以插入在内源宿主λ基因座的上游或下游，与人类λ恒定区可操纵地连接，由此所述非人类哺乳动物或细胞可产生完全人类抗体轻链和嵌合重链。在本发明另一不同方面，使用本发明的方法可以通过相继插入以逐步方式构建基因座，及因此使得可以在非人类宿主细胞的基因座中的任何合适位置插入人类可变DNA及人类或非人类恒定区DNA。例如，本发明的方法可用于将人类免疫球蛋白可变区DNA及来自宿主基因组的恒定区DNA插入非人类宿主细胞基因组中任何位置，使得从在内源重链区之外的位置产生嵌合抗体链。上述任何人类重链或轻链DNA构建体可以插入非人类宿主细胞基因组中任何希望的位置，使用本文描述的技术进行。本发明因此还涉及具有包含这种插入的基因组的细胞和哺乳动物。本发明还涉及载体，如BAC，其包含与非人类哺乳动物启动子或其它控制序列功能性排列的人类V、D或J区，由此人类V、D或J区在非人类哺乳动物细胞如ES细胞中的表达在非人类哺乳动物启动子的控制下，特别是在一旦插入该细胞的基因组的情况中。本发明还涉及细胞和含有所述细胞的非人类哺乳动物，所述细胞或哺乳动物具有人类V、D或J区，与非人类哺乳动物启动子或其它控制序列功能性排列，由此人类V、D或J区在所述细胞或哺乳动物中的表达在所述非人类哺乳动物启动子的控制下。通常，本发明一方面涉及非人类哺乳动物宿主细胞，其能在宿主启动子或控制区的控制下表达人类V、D或J编码序列，所述表达能产生具有人类可变结构域和非人类哺乳动物恒定区的人源化抗体。一方面，本发明涉及细胞，如非人类哺乳动物细胞，如ES细胞，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，及(b)任选地存在的位于宿主非人类哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区。另一方面，本发明涉及细胞，如非人类哺乳动物细胞，如ES细胞，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物κ恒定区上游的多个人类Ig轻链κ V区和一或多个人类Ig轻链κ J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区，及(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区。一方面，所 述细胞是ES细胞，其能发育成能产生是嵌合的抗体的所有组成成分的非人类哺乳动物，所述嵌合抗体具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区。任选地，所述细胞的基因组被修饰为阻止完全宿主物种特异性抗体的表达。一方面，所述细胞是诱导的多能干细胞(iPS细胞)。一方面，所述细胞是分离的非人类哺乳动物细胞。一方面，本文揭示的细胞优选是非人类哺乳动物细胞。一方面，所述细胞是来自选自 C57BL/6、M129 如 129/SV、BALB/c 以及C57BL/6、M129如129/SV或者BALB/c的任何杂种的小鼠品系的细胞。本发明还涉及从本文所述细胞中生长或另外衍生的细胞系，包括永生化细胞系。所述细胞系可包含如本文所述插入的人类V、D或J基因，在种系构型中或在体内成熟重排之后。所述细胞可以通过与肿瘤细胞融合而永生化，以提供产生抗体的细胞和细胞系，或者通过直接细胞永生化产生。本发明还涉及用于本发明的载体。一方面，这种载体是BAC(细菌人工染色体)。应意识到在本发明中可以使用其它克隆载体，及因此在本文提及BAC时可以一般是指任何合适载体。一方面，修剪用于产生待插入的人类DNA如VDJ或VJ区的BAC，由此当与原始人类基因组序列相比时在所述非人类哺乳动物中在最终的人类VDJ或VJ区或其一部分中没有序列复制或丢失。一方面，本发明涉及包含插入物的载体，优选包含来自一些人类VDJ或VJ基因座的人类DNA的区域，侧翼是不是来自该基因座的DNA。侧翼DNA可包含一或多个可选择标记或者一或多个位点特异性重组位点。一方面，所述载体包含2或更多个如3个异种特异性和不相容的位点特异性重组位点。一方面,所述位点特异性重组位点可以是1xP位点或其变体，或者FRT位点或其变体。一方面,所述载体包含一或多个转座子ITR(末端反向重复)序列。一方面，本发明的非人动物适当地不产生任何完全人源化抗体。一方面，这是因为没有插入的DNA来自人类恒定区。或者，在基因组中没有能与插入的人类可变区DNA成分联合形成抗体的人类恒定区DNA，例如由于任何人类恒定区DNA内的突变或者与任何恒定区人类DNA和人类可变区DNA的距离所致。一方面，人类轻链恒定区DNA可以包含在细胞基因组中，由此可以产生完全人类λ或κ人类抗体链，但是这仅能与嵌合重链形成抗体，而不能产生具有人类可变区和恒定区的完全人类抗体。一方面，所述非人类哺乳动物基因组被修饰为阻止完全宿主物种特异性抗体的表达。完全宿主物种特异性抗体是具有来自宿主生物体的可变区和恒定区的抗体。在这种情况中，术语“特异性”不是描述由本发明的细胞或动物产生的抗体的结合，而是描述编码这些抗体的DNA的来源。

一方面，所述非人类哺乳动物基因组被修饰为阻止天然(完全宿主物种特异性)抗体在哺乳动物中的表达，通过失活全部或部分宿主非人类哺乳动物Ig基因座进行。一方面，这通过全部或部分非人类哺乳动物VDJ区或VJ区的倒位、任选地通过在所述基因组中插入一或多个位点特异性重组酶位点及然后在重组酶介导的切割或全部或部分非人类哺乳动物Ig基因座的倒位中使用这些位点实现。一方面，可以应用双重倒位，第一次是从内源基因座中移除V(D)J,然后更局部的倒位将其以正确方向放置。一方面，使用单一 1xP位点以将非人类哺乳动物VDJ区倒位为着丝粒基因座或端粒基因座。一方面，其中插入人类DNA的非人类哺乳动物包含内源V、(D)和J区，而且内源序列未缺失。本发明包含一种方法，该方法是将多个DNA片段插入DNA靶中，适当地形成连续插入，其中插入的片段无插入序列而直接连接在一起。所述方法尤其可用于将大DNA片段插入宿主染色体中，可以以逐步方式进行。一方面，所述方法包括将第一 DNA序列插入靶中，所述序列具有DNA载体部分和感兴趣的第一序列(Xl);将第二 DNA序列插入第一序列的载体部分，第二 DNA序列具有感兴趣的第二序列(Χ2)和第二载体部分；然后切割任何载体序列DNA分离Xl与Χ2以在所述靶内提供连续的Χ1Χ2或Χ2Χ1序列。任选地在先前的DNA序列的载体部分中插入进一步的一或多个DNA序列，每个DNA序列具有进一步的感兴趣序列(Χ3，...)和进一步的载体部分，以在所述靶中构建连续DNA片段。插入第一 DNA序列的DNA靶可以是特定细胞基因组中的特异性位点或任何位点。本文描述的是涉及插入人类VDJ区元件的一般方法，但是可用于插入来自任何生物体的任何DNA区，及特别插入>100kB的大DNA片段，如100_250kb或者甚至更大，如TCR或HLA。本文描述的关于VDJ插入的特点和方法可同样用于揭示的任何方法。一方面，插入的DNA是人类DNA，如人类VDJ或VJ区，在细胞如ES细胞的基因组中以逐步方式建立，对于每个重链或轻链区使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多次单独插入。片段适当地相继插入在相同或基本上相同的细胞基因座，如ES细胞基因座，形成完整的VDJ或VJ区或其一部分。本发明还涉及包含中间产物的细胞和非人动物，在加工中其基因组可仅包含部分VDJ区，如仅人类可变区DNA。另一方面，产生转基因非人类哺乳动物的方法包括将人类VDJ或VJ区插入在宿主非人类哺乳动物恒定区上游，通过同源重组逐步插入多个片段，优选使用重复过程。适当地，插入来自人类VDJ和VJ基因座的大约100KB的片段，适当地在最终重复插入过程之后形成部分或完整的VDJ或VJ区，如本文所述。一方面，所述插入过程在其中起始盒(initiation cassette)已经插入细胞如ES细胞的基因组中的位置开始，提供独特的靶向区。一方面，所述起始盒插入非人类哺乳动物重链基因座中，用于插入人类重链DNA。相似地，起始盒可以插入非人类哺乳动物轻链基因座中，用于插入人类轻链VJ DNA。所述起始盒适当地包含载体主链序列，可以将其与在同一主链序列中具有人类DNA片段的载体重组以将人类DNA插入细胞(如ES)基因组中，及所述起始盒适当地包含选择标记如阴性选择标记。适当地，所述载体主链序列是BAC文库序列，使得BAC可用于构建ES细胞和哺乳动物。然而所述载体主链序列可以是作为靶位点的任何序列，其中可插入同源序列，例如通过同源重组进行，如RMCE，且优选不是编码任何VDJ或恒定区的DNA。一方面，将第一 DNA片段插入起始盒之后将第二 DNA片段插入第一 DNA片段的一部分中，适当地插入第二 DNA片段的一部分载体主链。一方面，插入的DNA片段包含一部分人类VDJ区，侧翼是不是来自人类VDJ区的5’和/或3’序列。一方面，所述5’和/或3’侧翼序列可均含有一或多个选择标记，或者在插入基因组中时能产生可选择系统。一方面，一或两个侧翼序列可以在插入后在体外或体内从基因组中除去。一方面，所述方法包括插入DNA片段，随后选择在人类VDJ DNA侧翼的插入片段的5’和3’末端。一方面，重复插入是通过在先前插入片段的5’末端插入DNA片段进行，在这方面可以在体内缺失分离插入的人类DNA序列的载体DNA，提供连续人类DNA序列。一方面，将人类VDJ DNA插入基因组中可以不用在基因组中留下任何侧翼DNA而实现，例如通过转座酶介导DNA切割进行。一种合适的转座酶是Piggybac转座酶。一方面，第一人类可变区片段通过同源重组插入在起始盒主链序列，随后通过重组酶靶序列之间的重组除去任何阴性选择标记和起始盒的DNA，在这个实例中使用FRT，FLPase表达。通常，重复进行在(如BAC)主链起始序列的重复靶向插入及随后通过重组酶靶序列之间的重排除去以构建位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的全部人类VDJ区。一方面，在所述方法中可以使用选择标记或系统。所述标记可以在将DNA片段插入基因组中时产生，例如形成与基因组中已经存在的DNA元件联合的选择标记。一方面，所述细胞(如ES)基因组在加工期间不同时含有2个相同的选择标记。可见插入与选择的重复过程可以仅使用2个不同的选择标记进行，如在本文实施例中揭示，及例如第三选择标记可以与第一标记相同，等到插入第三载体片段时，第一载体片段和第一标记已经除去。一方面，正确的插入事件是在进行任何多步骤克隆过程的下一步骤之前证实的，例如通过使用高密度基因组 阵列筛选ES细胞以鉴别具有完整BAC插入的那些细胞、测序及PCR确认证实BAC结构。
起始盒(也称作“着陆区”)本发明还涉及多核苷酸“着陆区”序列，所述多核苷酸包含与靶染色体区域同源的核酸区以使得可以通过同源重组插入靶染色体中，及包含允许重组酶驱动的将核酸插入着陆区的核酸位点。本发明还涉及载体、细胞和哺乳动物，其包含如本文揭示的插入细胞基因组中的着陆区。所述着陆区任选地包含非内源S-mu，如大鼠S_mu转换序列。所述着陆区任选地包含(5，至3’方向)小鼠Εμ序列、非人类非小鼠(如大鼠)转换μ序列及至少一部分小鼠Cy或完整小鼠Cy。大鼠转换序列任选地包含或者由SEQ ID NO:1组成。所述着陆区任选地包含SEQ ID NO:6的5’同源臂。所述着陆区任选地具有SEQ ID:2或SEQ ID N0:3所示序列。本发明的方法包括其中所述着陆区序列包含如本文所述任何构型或序列的方法。本发明的另一方法包括通过在小鼠J1-4与小鼠C mu序列之间的同源重组将着陆区插入小鼠染色体中的步骤。本发明另一方法包括通过在小鼠J1-4与E mu之间的同源重组将着陆区插入小鼠染色体12中的步骤。一方面，所述方法 使用位点特异性重组将一或多个载体插入细胞如ES细胞的基因组中。位点特异性重组酶系统为本领域熟知，可包括Cre-1ox和FLP/FRT或其组合，其中重组发生在具有序列同源性的2个位点之间。除了本文所述任何特定的Cre/Lox或FLP/FRT系统之外，可用于本发明中的其它重组酶和位点包括Dre重组酶、rox位点及PhiC31重组酶。合适的BAC 可得自 Sanger 中心，见 “A genome-wide, end-sequencedl29Sv BAClibrary resource for targeting vector construction，，Adams DJ,Quail MA, CoxT, van der Weyden L, Gorick BD,Su Q, Chan Wl, Davies R, Bonfield JK, Law F, HumphrayS, Plumb B, Liu P, Rogers J, Bradley A.Genomics.2005Dec;86(6):753-8.Epub20050ct27.The Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire CB101SA，UKo 含有人类DNA的BAC也可得自例如Invitrogen。合适的文库在Osoegawa K ef al, GenomeResearch2001.11:483-496 中描述。一方面，本发明的方法特别包括:(I)将第一 DNA片段插入非人类ES细胞中，所述片段含有人类VDJ或VJ区DNA的第一部分及含有第一选择标记的第一载体部分；(2)任选地缺失一部分第一载体部分；(3)将第二 DNA片段插入含有第一 DNA片段的非人类ES细胞中，所述插入发生在第一载体部分内，第二 DNA片段含有人类VDJ或VJ区的第二部分及含有第二选择标记的第二载体部分；(4)缺失第一选择标记和第一载体部分，优选通过重组酶作用实现；(5)将第三DNA片段插入含有第二 DNA片段的非人类ES细胞中，所述插入发生在第二载体部分，第三DNA片段含有人类VDJ或VJ区的第三部分及含有第三选择标记的第三载体部分；
(6)缺失第二选择标记和第二载体部分；及(7)如果需要，重复插入和缺失第四及更进一步的人类VDJ或VJ区的片段的步骤，以产生具有如本文所述插入的一部分或全部人类VDJ或VJ区的ES细胞，及适当地除去ES细胞基因组内的所有载体部分。另一方面，本发明包括:1.在细胞基因组中插入形成起始盒的DNA ；2.将第一 DNA片段插入起始盒中，第一 DNA片段包含人类DNA的第一部分及含有第一选择标记或者在插入时产生选择标记的第一载体部分；3.任选地除去部分载体DNA ；4.将第二 DNA片段插入第一 DNA片段的载体部分中，第二 DNA片段含有人类DNA的第二部分及第二载体部分，第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记；5.任选地除去任何载体DNA以使得第一和第二人类DNA片段形成连续序列 '及6.如果需要，重复插入人类VDJ DNA及除去载体DNA的步骤，以产生具有全部或部分人类VDJ或VJ区的细胞，其足以能与宿主恒定区联合产生嵌合抗体；其中插入一或多个或全部DNA片段使用位点特异性重组进行。一方面，所述非 人类哺乳动物能产生至少I X IO6个不同的功能性嵌合免疫球蛋白序列组合的多样性。一方面，所述靶向在衍生自C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv小鼠品系的ES细胞中进行。一方面，非人动物如小鼠在RAG-1或RAG-2缺陷背景下或者在阻止成熟宿主B和T淋巴细胞产生的其它合适遗传背景下产生。一方面，所述非人类哺乳动物是啮齿类动物，适当地是小鼠，本发明的细胞是啮齿类动物细胞或ES细胞，适当地是小鼠ES细胞。本发明的ES细胞可用于通过使用本领域熟知的技术产生动物，包括将ES细胞注射进胚泡中，随后将嵌合的胚泡移植入雌性动物以产生具有所需插入的可以针对纯合重组体进行繁殖和选择的后代。一方面，本发明涉及包含ES细胞衍生组织和宿主胚胎衍生组织的嵌合动物。一方面，本发明涉及遗传改变的后代动物世代，其包括具有VDJ和/或VJ区纯合重组体的动物。另一方面，本发明涉及产生特异于希望抗原的抗体的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫上述转基因非人类哺乳动物并回收所述抗体(见例如Harlow, E.&Lane, D.1998, 5th edition, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Lab.Press, Plainview, NY;和 Pasqualini and Arap,Proceedings of theNational Academy of Sciences (2004) 101:257-259)。适当地,给予免疫原性量的抗原。本发明还涉及检测靶抗原的方法，包括用识别如上述产生的抗体的一部分的二级检测剂检测抗体。另一方面，本发明涉及产生完全人源化抗体的方法，包括用希望的抗原免疫上述转基因非人类哺乳动物，回收所述抗体或表达所述抗体的细胞，然后用人类恒定区置换非人类哺乳动物恒定区。这可以通过标准克隆技术在DNA水平进行以用合适的人类恒定区DNA序列置换非人类哺乳动物恒定区-见例如Sambrook，J and Russell, D.(2001，3’d edition)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring HarborLab.Press, Plainview, NY)。另一方面，本发明涉及根据本发明产生的人源化抗体和抗体链，其均是嵌合及完全人源化形式，本发明还涉及所述抗体在医药学中的应用。本发明还涉及包含这种抗体及药物可接受载体或其它赋形剂的药物组合物。含有人类序列的抗体链如嵌合人类-非人类抗体链由于存在人类蛋白质编码区而在本文被认为是人源化的。完全人源化抗体可以通过使用标准技术从编码本发明嵌合抗体链的DNA产生。产生单克隆和多克隆抗体的方法为本领域熟知，本发明涉及在本发明非人类哺乳动物中应答抗原攻击时产生的嵌合或完全人源化抗体的多克隆和单克隆抗体。再一方面，可以对本发明产生的嵌合抗体或抗体链进行操纵，适当地在DNA水平操纵，以产生具有抗体样性质或结构的分子，如来自重链或轻链的人类可变区不存在恒定区，例如结构域抗体；或者人类可变区具有来自相同或不同物种的重链或轻链的任何恒定区；或者人类可变区具有非天然发生的恒定区；或者人类可变区具有任何其它融合配偶体。本发明涉及衍生自根据本发明鉴别的嵌合抗体的所有这样的嵌合抗体衍生物。再一方面，本发明涉及使用本发明的动物在准-人类抗体所有组成成分的情况中分析药物和疫苗的可能作用。

本发明还涉及鉴别或确认药物或疫苗的方法,所述方法包括将所述疫苗或药物输送给本发明的哺乳动物并监测如下一或多项:免疫应答，安全性谱，对疾病的作用。本发明还涉及包含如本文所述抗体或抗体衍生物以及使用这种抗体的说明书或者合适的实验室试剂如缓冲液、抗体检测试剂的试剂盒。本发明还涉及产生抗体或其一部分的方法，所述方法包括提供:(i)编码根据本发明获得的抗体或其一部分的核酸；或者(ii)序列信息，从中编码根据本发明获得的抗体或其一部分的核酸可以被表达以使得抗体产生。本发明还涉及嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C ga_a*C mu),其中所述抗体由相应于细胞(任选地B细胞、ES细胞或杂交瘤)的嵌合重链基因座的核苷酸序列的核苷酸序列编码，所述基因座包含非人类脊椎动物恒定区核苷酸序列和通过人类V区、人类D区和人类J区的体内重排产生的重排VDJ核苷酸序列，所述V区选自V1-3区、V2-5区、V4-4区、V1-2区或V6-1区之一，任选地是V1-3或V6-1节段。任选地，所述J区是任何JHl、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6任一，及一方面是JH4或JH6。一方面，所述D区是任何D3-9、D3-10、D6-13或D6-19。在一个实例中，重排VDJ核苷酸序列通过人类V1-3和JH4(任选地与D3-9、D3-10、D6-13或D-19)、或者 V1-3 和 JH6(任选地与 D3-9、D3-10、D6-13 或 D-19)、或者 V6-1 和 JH4(任选地与 D3-9、D3-10、D6-13 或 D-19)、或者 V6-1 和 JH6 (任选地与 D3-9、D3-10、D6-13 或 D-19)的体内重排产生。在一个实例中，重排VDJ核苷酸序列通过人类V6-1DH3-10、V1-3DH3-10、V1-3DH6-19、Vl-3Dh3-9或V6-1DH6-19的体内重排产生。一方面，所述抗体包含在本文实施例和图表中举例的任何组合。任选地，所述体内重排是在衍生自与恒定区序列(例如小鼠B细胞或ES细胞)相同的非人类脊椎动物物种的细胞中(例如B细胞或ES细胞)。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合重链基因座。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合重链基因座。本发明还涉及具有编码嵌合抗体的基因组的非人类脊椎动物或哺乳动物，所述嵌合抗体包含人类可变区和非人类脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C gamma或C mu),所述哺乳动物:表达比V2-5、V4-4、V1-2或V6-1抗体更多的V1-3抗体；和/或表达比任意单独的V1-3JH1、V1-3JH2、V1-3JH3或V1-3JH5抗体更多的V1-3JH4或V1-3JH6抗体；和/或表达比任意单独 的V6-1JH1、V6-1JH2、V6-1JH3或V6-1JH5抗体更多的V6-1JH4或V6-1JH6抗体；和/或表达比具有任何其它D区的V1-3抗体更多的V1-3DH3-10抗体。抗体的表达可以通过为本领域技术人类员易于获得的及本领域常规的方法评估。例如，表达可以在mRNA水平评估，如下文实施例所示。本发明还涉及嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地轻链恒定区)，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，其基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人类κ V1-8和种系人类κ Jl序列，及其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中V1-8和Jl序列的体内重组获得，及其中所述抗体具有可变区序列，其与由种系人类kV1-8和种系人类Kjl序列编码的序列不同。因此，在本发明的这个方面，人类种系序列能经历生产性重排(productiverearrangement)以形成编码序列，所述编码序列与非人类恒定区序列联合可以被表达为具有至少完整的人类可变区和非人类恒定区的嵌合抗体链。这与种系人类kV1-8与种系人类κ Jl序列自身组合相反(如下文实施例所示)，其不提供抗体编码序列(由于包含终止密码子)。一方面，嵌合抗体的重排序列是体细胞超变的结果。一方面，所述抗体是κ抗体，另一方面，所述抗体包含非人类重链恒定区(例如大鼠或小鼠C gamma或C mu)。所述抗体序列任选地包含X1X2T F G Q，其中X1X2=PR、RT或PW，任选地X1X2T F G Q G T K VEIKRAD A基序。这种基序在种系序列的等价位直未发现，如实施例所不。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含如这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明还涉及嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地轻链恒定区)，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，其基因组包含包含种系人类KV1-6和种系人类Kjl序列的抗体链基因座，其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中V1-6和Jl序列的体内重组获得，及其中所述抗体具有可变区序列，其与由种系人类kV1-6和种系人类κ Jl序列编码的序列不同。因此，在本发明的这个方面，人类种系序列能经历生产性重排以形成编码序列，所述编码序列与非人类恒定区序列联合可以被表达为具有至少完整人类可变区和非人类恒定区的嵌合抗体链。这与种系人类κ V1-6和种系人类κ Jl序列自身的组合相反(如下文实施例所示)，其不提供抗体编码序列(由于包含终止密码子)。一方面，嵌合抗体的重排序列是体细胞超变的结果。一方面，所述抗体是K抗体；另一方面，所述抗体包含非人类重链恒定区(例如大鼠或小鼠C gamma或C mu)。所述抗体序列任选地包含X3X4T F G Q，其中X3X4=PR或PW，任选地X3X4T FGQGTKVEIKRAD A基序。这种基序在种系序列中等价位置未发现，如实施例所示。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明还涉及嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C ga_a*C mu或Ck )，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，其基因组包含包含种系人类KV1-5和种系人类K Jl序列的抗体链基因座，及其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中V1-5和Jl序列的体内重组获得。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含如这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明还涉及嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C ga_a*C mu或Ck )，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，其基因组包含包含种系人类KV1-5和种系人类K J4序列的抗体链基因座，及其中所述抗体可以通过在所述哺乳动物中V1-5和J4序列的 体内重组获得。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含如在这个段落上述的嵌合抗体链基因座。本发明的抗体可以是分离的，一方面分离自抗体在其中表达的细胞或生物体。在某些方面，本发明涉及:非人类哺乳动物，其基因组包含:(a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的人类IgH VDJ区；及(b)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的人类Ig轻链K V和J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的人类Ig轻链λ V和J区；其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体的所有组成成分，及任选地其中所述非人类哺乳动物基因组被修饰为阻止完全宿主物种特异性抗体的表达。非人类哺乳动物ES细胞，其基因组包含:(a)位于非人类哺乳动物恒定区上游的人类IgH V、D和J区；及(b)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的人类Ig基因座轻链K V和J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的人类Ig基因座轻链λ V和J区；其中所述ES细胞能发育成非人类哺乳动物，能产生嵌合的具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的抗体的所有组成成分。产生转基因非人类哺乳动物的方法，所述哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体的所有组成成分，所述方法包括通过同源重组将如下区域插入非人类哺乳动物ES细胞基因组中:(a)人类IgH VDJ区，位于宿主非人类哺乳动物重链恒定区上游，及(b)针对λ或K链的人类IgL VJ区，分别位于宿主非人类哺乳动物λ或Κ链恒定区上游，由此所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体的所有组成成分，其中步骤(a)和(b)可以任意顺序进行，步骤(a)和(b)每步可以逐步或作为单一步骤进行。一方面，人类VDJ或VJ区插入在宿主非人类哺乳动物恒定区上游是通过同源重组逐步插入多个片段实现的。一方面，所述逐步插入是在起始盒已经插入ES细胞基因组(提供独特的由BAC主链序列和阴性选择标记组成的靶向区)中的位点开始。一方面，第一人类可变区片段通过同源重组插入起始盒BAC主链序列，所述阴性选择标记和起始盒随后通过在重组酶靶序列之间的重组除去。一方面，重复进行在BAC主链起始序列的重复靶向插入及随后通过重组酶靶序列之间的重排除去所述主链以构建位于宿主非哺乳动物恒定区上游的完整人类VDJ区。其它方面包括:产生特异于希望抗原的抗体的方法，所述方法包括用希望抗原免疫如本文所述非人类哺乳动物并回收所述抗体或产生所述抗体的细胞。产生完全人源化抗体的方法，包括免疫本文所述非人类哺乳动物，然后适当地通过编码所述抗体的核酸的工程化用人类恒定区置换与所述抗原特异性反应的抗体的非人类哺乳动物恒定区。本文揭示的方法、细胞或哺乳动物，其中人类编码区DNA序列与非人类哺乳动物控制序列功能性排列，由此该DNA的转录由所述非人类哺乳动物控制序列控制。一方面，所述人类编码区V、D或J区与小鼠启动子序列功能性排列。本发明还涉及根据本文揭示的任何方法产生的人源化抗体及如此产生的人源化抗体在医药学中的应用。应理解本文所述特殊的实施方案是举例说明而非限制本发明。本发明的主要特点在不偏离本发明范围的前提下可以用于不同的实施方案。本领域技术人员使用不超过常规研究将意识到或者能确定本 文描述的特定程序的众多等价物。这种等价物被认为在本发明范围内且为权利要求书所覆盖。本说明书中提及的所有出版物和专利申请代表本发明所述领域中技术人员技术水平。本文提及的所有出版物和专利申请均援引加入本文参考，就如同每个单独的出版物或专利申请被特异个别表示援引加入。在权利要求书和/或说明书中，单词“一个”当与术语“包含”联合使用可以是指“一个”，但是也可以是指“一或多个”、“至少一个”及“一或一个以上”。除非明确指出是唯一选项或选项是互斥的，权利要求书中术语“或”的使用是指“和/或”，尽管本文支持描述唯一选项及“和/或”的定义。在本申请书中，术语“大约”用于描述这样的数值，其包括设备、用于确定该数值的方法的固有误差变量，或者研究对象中存在的变量。如本说明书和权利要求书所用，单词“包含”(及任何形式)、“具有(及任何形式)”、“包括”(及任何形式)或“含有”(及任何形式)是包括或开放式的，不排除另外的未列举的元件或方法步骤。如本文所用，术语“或其组合”是指该术语之前列举项目的所有排列与组合。例如，“A、B、C或其组合”是指包括至少如下之一:A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且如果顺序在特定场合中是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个实例，显然包括含有一或多个项目或术语的重复组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB等等。本领域技术人员将理解，除非根据上下文很明显，则典型地对于任何组合中项目或术语的数目无限制。除非根据上下文很明显，本文的任何部分均可以组合本文的任何其它部分。根据本发明揭示可以不用过度实验而产生和实施本文揭示和请求保护的所有组合物和/或方法。虽然本发明的组合物和方法已经在优选的实施方案中描述，但本领域技术人员应意识到在不偏离本发明观点、精神和范围的前提下可以对所述组合物和/或方法及所述方法的步骤或步骤顺序加以改变。为本领域技术人员已知的所有这些相似的替代和修饰被认为在所附权利要求书要求的本发明的精神、范围和观点内。本发明在如下非限制性实施例中得以更详细描述。实施例3揭示了已经获得的实验数据，支持本发明某些方面的观点的证据，而实施例1和2为本领域技术人员提供了实施本发明的详细指导。实施例1总体策略本发明的小鼠模型可 以通过在小鼠恒定区上游插入含有所有V、D和J区的 960kb人类重链基因座和在小鼠恒定区上游插入473kb人类K区而获得。或者或相继地，将人类λ区插入在小鼠恒定区上游。这种插入通过使用本领域熟知的技术在ES细胞中基因靶向而实现。在每个基因座中以其天然(野生型)构型高保真插入完整V-D-J区适当地通过在该基因座中插入人类细菌人工染色体(BAC)而实现。适当地，对BAC进行修剪，由此在最终基因座中与原始相比没有序列复制或者丢失。这种修剪可以通过重组工程进行。覆盖这些基因座的合适修剪的相关人类BAC的大小平均为90kb。在一种方法中，人类D和J元件的完全互补物以及七或八个人类V区由在下述实验性插入方案中插入的第一 BAC覆盖。在IgH和IgK基因座中插入的第一 BAC可含有如下V 区。IgH:V6-1, VI1-1-1, Vl-2, VII1-2-1, Vl-3, V4-4, V2-5 以及 IgK:V4-1, V5-2, V7-3,V2-4, Vl-5, Vl-6, V3-7, V1-8。适当地，每个基因座的性能在第一次BAC插入后评估，使用嵌合小鼠进行，以及在每次随后的加入BAC之后进行。见下文关于这个性能测试的详细描述。IgH基因座需要9个额外的BAC插入，IgK需要5个，以提供分别覆盖所有0.96Mb和0.473Mb的IgH和IgK基因座的人类V区的完全互补物。当插入ES细胞基因组中时，不是所有的BAC均保持其野生型构型。因此我们利用高密度基因组阵列筛选ES细胞以鉴别具有完整BAC插入的那些细胞(Barrett，Μ.Τ.，Schefferj A.，Ben-Dorj A.，Sampasj N.，Lipsonj D.，Kincaid, R.，Tsangj P.，Curry, B.,Baird, K., Meltzerj P.S., ef al.(2004).Comparative genomic hybridization usingoligonucleotide microarrays and total genomic DNA.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of AmericalOlj 17765-17770)。这种筛选也能使技术人员可鉴别并选择其中ES细胞基因组被损害(compromised)并因此不能繁殖为(populate)嵌合动物种系的ES克隆。便于这种评估的其它合适的基因组工具包括测序和PCR证实。因此，一方面，正确的BAC结构在进行下一步骤之前被证实。从上文描述中可以看出为了对具有90kb BAC的基因座进行完全工程化，对于IgH需要进行最少10个靶向步骤，对于IgK需要5个步骤。具有IgL基因座的小鼠可以与IgK基因座相似方式产生。需要另外的步骤以除去支持基因靶向的选择标记。由于这些操纵是在ES细胞中逐步进行的，因此一方面，在这个过程中保持种系传递能力(germlinetransmission capacity)。通过多轮操纵保持ES细胞克隆的性能而不需要在每个步骤检测ES细胞系的种系潜力对于本发明是重要的。目前用于KOMP和EUCOMM整体敲除方案的细胞系在其用于这个方案之前已经被修饰两次，其种系传递速度与亲代细胞相比不改变(这些细胞系可公开获得，见WWW.komp.0rg和www.eucomm.0rg)。称作JM8的这个细胞系在公开的培养条件下可以产生100%ES细胞衍生的小鼠(Pettitt, S.J.，Liang, Q.，Rairdan, X.Y., Moran, J.L., Prosser, Η.Μ., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarnes, ff.C.(2009).Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.Nature Methods.)。这些细胞具有已经证实的使用标准小鼠ES细胞培养条件可再现地有助于嵌合动物的体细胞和种系组织的能力。这种能力可用在标准饲养细胞系(SNL)培养的细胞及甚至无饲养细胞的仅在明胶包被组织培养平板上生长的细胞发现。一种特殊的亚系JM8A3保持了在几次系列亚克隆循环之后繁殖为嵌合体的种系的能力。通过例如同源重组进行的广泛遗传操纵-如在本发明的情况中-不能损害细胞的多能性。产生具有这种高百分比ES细胞衍生组织的嵌合体的能力具有其它优势。首先，高水平嵌合性与种系传递潜力相关并对种系传递提供了替代分析，仅需5-6周。其次，由于这些小鼠是10096ES细胞衍生的，因此工程化的基因座可以直接被检测，除去由于育种导致的延迟。在嵌合体中检测新的Ig基因座的完整性是可能的，因为宿主胚胎衍生自RAG-1基因突变的动物，如下文所述。可以使用的另一细胞系是HPRT-ve细胞系，如AB2.1，如“Chromosome engineering in mice,Ramirez-Solis R,Liu P and BradleyA, Nature 1995; 378; 6558; 720-4” 所示。RAG-1 互补虽然许多克隆将产生IOOffiS衍生小鼠，但是一些不能。因此，在每一步骤，小鼠在RAG-1缺陷背景中产生。这提供了具有1009ffiS-衍生B-和T-细胞的小鼠，其可直接用于免疫和抗体产生。可以使用具有RAG-2缺陷背景或者组合的RAG-1/RAG-2缺陷背景的细胞，或者其中小鼠仅产生ES细胞衍生B细胞和/或T细胞的等价突变。为了在这些小鼠中仅人类-小鼠IgH或IgK基因座是有活性的，可以将人类-小鼠IgH和IgK基因座在其中IgH或IgK基因座的一个等位基因已经被失活的细胞系中工程化。或者，宿主Ig基因座如IgH或IgK基因座的失活可以在插入后进行。

具有RAG-1基因突变的小鼠品系是免疫缺陷的，因为其不具有成熟的B-或T-淋巴细胞(US5，859，307)。如果正确的V (D) J重组发生，T-和B-淋巴细胞仅分化。由于RAG-1是这个重组的关键酶，因此没有RAG-1的小鼠是免疫缺陷的。如果宿主胚胎是遗传RAG-1纯合突变体，如果动物的淋巴组织衍生自宿主胚胎，则通过注射这种胚胎产生的嵌合体将不能产生抗体。然而，JM8细胞和AB2.1细胞例如通常提供超过80%的嵌合动物的体细胞组织并因此通常居于淋巴组织。JM8细胞具有野生型RAG-1活性及因此在嵌合动物中产生的抗体将仅由工程化的JM8ES细胞基因组编码。因此，嵌合动物可以通过免疫接种用抗原攻击，随后产生该抗原的抗体。这样使得本领域技术人员可以检测工程化的人类/小鼠IgH和IgK基因座的性能，如在本发明中所述。见图19和20。本领域技术人员使用所述嵌合动物以确定抗体多样性的程度(见例如Harlow, E.&Lane, D.1998, 5th edition, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Lab.Press, Plainview, NY)。例如，嵌合动物血清中某些抗体表位的存在可以通过与特异性抗独特型抗血清结合而确定，例如在ELISA测定中。本领域技术人员也可以对衍生自嵌合动物的B细胞克隆的基因组进行测序并将所述序列与野生型序列对比以确定超变水平，这种超变表示正常抗体成熟。本领域技术人员也使用所述嵌合动物检验抗体功能，其中所述抗体从工程化的Ig基因座编码(见例如 Harlow, E.&Lane, D.1998，5th edition, Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Lab.Press, Plainview, NY)。例如，可以检测抗血清与抗原的结合，所述抗原用于免疫嵌合动物。这种测量可以通过ELISA测定进行。或者，本领域技术人员可以检测抗原的中和，通过加入从适当免疫的嵌合动物收集的抗血清进行。本领域技术人员熟知任何这些检测的阳性结果证实工程化的Ig基因座编码具有人类可变区和小鼠恒定区的抗体的能力，这是本发明的主题，所述抗体能以野生型抗体的形式起作用。实验技术产生载体以用于在ES细胞中同源重组的重组工程在例如W09929837和W00104288中揭示，该技术为本领域熟知。一方面，人类DNA的重组工程使用BAC作为所述人类DNA的来源进行。使用Qiagen BAC纯化试剂盒分离人类BAC DNA。使用重组工程将每个人类BAC的主链修饰为与已插入小鼠IgH区中的BAC精确相同或相似的构型。使用重组工程修剪每个人类BAC的基因组插入物，以便一旦插入BAC，则在小鼠IgH或IgK基因座将形成人类V(D)J基因组区的无缝连续部分。根据标准方案通过电穿孔和基因分型进行 BAC DNA 转染(Prosser, H.M., Rzadzinska, A.K., Steel, K.P., and Bradley, A.(2008).Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for myosin Vila inactin dynamics of stereocilia.Molecular and Cellular Biology28, 1702-1712;Ramirez-Solis, R., Davis, A.C., and Bradley,A.(1993).Gene targeting in embryonicstem cells.Methods in Enzymology225, 855-878.)。 使用由 Pentao Liu and DonCourt’s实验室揭示的方法和试剂进行重组工程(Chan, ff., Costantino, N., Li, R., Lee, S.C., Su, Q., Melvin, D., Court, D.L., and Liu, P.(2007).A recombineering based approachfor high-throughput conditional knockout targeting vector construction.NucleicAcids Research3 5, e64)。关于BAC衍生染色体片段的基因靶向及重组进非人类哺乳动物如小鼠基因组中的这些及其它技术在例如 http://www.eucomm.0rg/information/targeting/ 和 http://www.eucomm.0rg/information/publications 中揭不。根据标准技术进行C57BL/6N-衍生细胞系如JM8雄性ES细胞的细胞培养。所述JM8ES细胞已经示出有能力广泛有助于体细胞组织和种系,及在Sanger Institute如EUCOMM 和 KOMP 用于大的小鼠诱变程序(Pettitt, S.J.，Liang, Q.，Rairdan, X.Y.，Moran, J.L., Prosser, Η.Μ., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarnes, ff.C.(2009).Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.NatureMethods.)。对 JM8ES 细胞(1.0XlO7)进行电穿孔(500 μ F，230V ;BioRad)，使用 10 μ g1-Scel线性化的人类BAC DNA。用嘌呤霉素(3 μ g/ml)或G418 (150 μ g/ml)选择转染物。所述选择在电穿孔后24小时(用G418)或48小时(用嘌呤霉素)开始,进行5天。IOyg线性化人类BAC DNA可以产生直至500个嘌呤霉素或G418抗性ES细胞集落。挑取抗生素抗性ES细胞集落置于96孔细胞培养平板中进行基因分型以鉴别被靶向的克隆。一旦鉴别了被靶向的小鼠ES细胞克隆，通过阵列比较基因组杂交(CGH)分析其总体基因组完整性(Chung, Y.J., Jonkers, J., Kitson, H., Fiegler, H., Humphray, S., Scott, C, Hunt, S., Yu, Y., Nishijima, 1., Velds, A., ef al.(2004).A whole-genome mouseBAC microarray withl-Mb resolution for analysis of DNA copy number changesby array comparative genomic hybridization.Genome researchl4,188-196.和Liang,Q., Conte, N., Skarnes, ff.C, and Bradley,A.(2008).Extensive genomic copynumber variation in embryonic stem cells.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of Americal05, 17453-17456.)。具有异常基因组的 ES细胞不有效有助于嵌合小鼠的种系。BAC完整性通过PCR扩增BAC中每个已知功能性V基因而检验。例如，在一种方法中，针对IgH基因座选择的第一个人类BAC具有6个功能性V基因。为证实这个BAC存在这6个IGH V基因的完整性，设计至少14对PCR引物并用于进行PCR扩增来自被靶向的ES细胞的基因组DNA。这些片段的人类野生型大小和序列将保证插入的BAC未重排。更详细的CGH也证实插入的`BAC的完整性。例如，本领域技术人员可使用寡核苷酸aCGH平台，这是由Agilent Technologies公司开发的。这个平台不仅使得技术人员能在高分辨度研究基因组型DNA拷贝数改变(Barrett, Μ.Τ.，Scheffer, A.，Ben-Dor, A.,Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., efal.(2004).Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarraysand total genomic DNA.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of AmericalOl, 17765-17770.),而且允许使用用户设计的阵列检测特异性基因组区域。与依赖于cDNA探针或完整BAC探针的传统aCGH技术相比，所述60-聚体寡核苷酸探针可以保证需要的特异性杂交及高敏感性和精确性以检测我们制备的工程化染色体改变。例如，设计为在沿着插入的BAC全长以规律间隔杂交的寡核苷酸将检测甚至非常短的缺失、插入或其它重排。这个平台也提供了定制微阵列设计的最大灵活性。被靶向的ES细胞基因组DNA和正常人类个体基因组DNA分别用染料标记并与阵列杂交。使用Aglient Technologies DNA微阵列扫描仪扫描阵列玻片。每个重链图像上染料Cy5和染料Cy3的交互(Reciprocal)突光强度及log2比率值通过使用Bluefuse软件(Bluegnome)获得。在标准化所有log2比率值之前，排除具有不一致荧光模式的斑点(〃置信度"〈0.29或者〃质量〃=0)。在实验中，来自任何寡核苷酸探针的信号的在-0.29与+0.29之间的Log2比率被认为无拷贝数改变。“复制”的log2比率阈值通常>0.29999，对于缺失是〈0.29999。一旦第一个人类BAC插入小鼠IgH基因座中并证实是其完整的天然构型，FRT-侧翼BAC主链将通过使用Flp位点特异性重组酶切除。如果规律的Flp-催化的FRT重组不足够高，可以使用Flo，这是改良形式的Flpo重组酶，其在某些实验中在ES细胞中比原始Flp更有效3-4倍。在切除BAC主链之后，ES细胞变得对嘌呤霉素(或G418)敏感，及对FIAU有抗性(因为丧失TK盒)。所述切除事件通过PCR扩增连接片段而进一步鉴定，使用人类基因组DNA引物进行。这些无FRT-侧翼BAC主链的ES细胞用于下一轮人类BAC插入及胚泡注射。靶向ES细胞的基因组以产生转基因小鼠可以通过使用附图1-18解释的方案进行。图1说明了三种基本主链载体,分别为起始盒及2个大插入载体I和2。所述起始盒包含与插入小鼠基因组中希望位点同源的序列，这些位点侧翼是进行基于PCR基因分型的选择标记和填充引物序列，以证实BAC的正确插入。填充引物序列提供了对每个BAC添加步骤进行基因分型的基础。这个序列被认为提供PCR引物的经有力确认的序列模板，可以位于IScel位点，理想地与BAC插入物相距 lkb。大插入载体包含质粒上的人类DNA，所述质粒具有选择标记和独特的限制位点以线性化所述质粒，以帮助同源重组进ES细胞的基因组中。图2说明了通过在小鼠J4与C alpha外显子之间的同源重组将起始盒插入小鼠基因组中。嘌呤霉素选择使得可以鉴别具有所述盒插入的ES细胞。pu(Delta) tk是在嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puro)与截短形式 的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(DeltaTk)之间的一种双功能融合蛋白。用PU (Delta) tk转染的鼠胚胎干(ES)细胞变得对嘌呤霉素抗性及对1-(-2-脱氧-2-氟-1-β-D-阿糖呋喃基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)敏感。与其它HSVltk转基因不同，puDeltatk易于通过雄性种系传递。因此，pu (Delta) tk是常规阳性/阴性选择标记，其可广泛用于许多ES细胞应用中。图3说明了大插入载体I靶向小鼠ES细胞基因组。所述载体的线性化在与填充引物序列相同位置进行，这使得可以进行本领域熟知的缺口修复基因分型策略，见Zheng etal NAR1999, Vol27, 11，2354-2360所述。本质上，在基因组中随机插入靶向载体不“修复”缺口，而同源重组事件将修复所述缺口。合适的PCR引物序列的并置使得集落被单独筛选表示正确插入的阳性PCR片段。使用G418的阳性选择使得可以鉴别含有neo选择标记的小鼠ES细胞。可以对所有关键V、D和J区进行PCR确认。阵列比较基因组杂交可用于确认BAC结构。图4说明了在FIAU中使用Flpe和选择来缺失puro-delta_tk盒和BAC质粒主链。由于Flpe在小鼠ES细胞中无效(5%缺失瞬时Flpe表达)，期望在大多数情况中，在BAC主链侧翼的两个FRT位点之间发生重组。也可以检测Flpo以发现相距IOkb的两个FRT位点之间的重组效力。鉴于FRT缺失步骤是可选择的，因此可以集合FIAU抗性克隆及立即进入与克隆分析平行的下一步骤。或者，通过短程PCR可以令人满意地示出人类序列目前与所示小鼠那些序列相邻(Hu-引物I和Mo-引物)。在此阶段，将插入200kb人类基因座。图5说明了第二个大插入载体靶向于ES细胞染色体中。将人类BAC靶向于小鼠IgH基因座，使用相同起始盒插入、随后进行IScel BAC线性化，BAC靶向于起始盒以及缺口修复基因分型策略。如前述进行BAC插入确认。图6说明了通过Flpo缺失大插入载体2的FRTY侧翼BAC主链及neo标记。注意，这不是可选择的，因此在此点必须进行克隆分析。这样使得可以证实人类2插入物与人类I插入物的并置及其它确认结果。在此阶段，将插入 200kb人类基因座。图7说明了靶向小鼠IgH基因座的下一个大插入载体。然后除去pu-delta TK盒，如图4所示。可以重复这个程序以掺入其它BAC。图8说明了最终预测的EA细胞构建体。图9-18提供了这种方法的进一步详细描述。实施例2在本发明的进一步方法中，也可以使用位点特异性重组。位点特异性重组(SSR)在最近20年已经广泛用于将转基因整合进指定染色体基因座中。SSR涉及同源DNA序列之间的重组。基于SSR的染色体靶向的第一代涉及(i)转染的质粒中单一重组靶位点(RT)如1xP或FRT与(ii)由前一整 合提供的染色体RT位点之间的重组。这种方法的主要问题是插入事件是罕见的，因为切除总是比插入更有效。引入称作RMCE(重组酶介导的盒交换)的 SSR第二代，如 Schlake and Bode 在 1994 (Schlake, Τ.; J.Bode (1994)."Use of mutatedFLP-recognition-target-(FRT_)sites for the exchange of expression cassettes atdefined chromosomal loci〃.Biochemistry33:12746-12751)所述。其方法基于在转染的质粒中使用两个异种特异性和不相容RT，其可以与染色体上相容RT位点重组，导致一部分DNA置换为另一部分-或者盒交换。这种方法已经成功用于多种有效的染色体靶向中，包括大于 50kb 的 BAC 插入物的整合(Wallace, H.A.C.et al.(2007)."Manipulating themouse genome to engineering precise functional syntenic replacements with humansequence".Cell128:197-209;Prosser, H.M.et al.(2008)."Mosaic complementationdemonstrates a regulatory role for myosin Vila in actin dynamics ofStereocilia".Mol.Cell.Biol.28:1702-12)。BAC的最大插入物大小是大约300-kb，及因此这是RMCE的盒大小的上限。在本发明中，我们利用称作顺序RMCE(sequential RMCE, SRMCE)的新的基于SSR的技术，其使得可以在相同基因座中连续插入BAC插入物。所述方法包括如下步骤:1.将形成起始盒(在本文也称作着陆区)的DNA插入细胞基因组中；2.将第一 DNA片段插入所述插入位点，所述第一 DNA片段包含人类DNA的第一部分和第一载体部分，所述载体部分含有第一选择标记或在插入时产生选择标记；3.除去载体DNA的一部分；4.将第二 DNA片段插入第一 DNA片段的载体部分中，所述第二 DNA片段含有人类DNA的第二部分和第二载体部分，所述载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记；5.除去任何载体DNA，以使得第一和第二人类DNA片段形成连续序列；以及6.如果需要，重复插入一部分人类V (D) J DNA和除去载体DNA的步骤，以产生具有足以能与宿主恒定区联合产生嵌合抗体的全部或部分人类VDJ或VJ区的细胞，其中至少一个DNA片段的插入使用位点特异性重组。在一具体方面，所述方法利用三个异种特异性和不相容1xP位点。所述方法包括如下步骤，并在图22-26中说明:1.将着陆区靶向于指定基因座中。将含有侧翼为反向PiggyBac(PB) ITR的HPRT小基因的进入载体靶向指定区域(例如=IGHJ与Ey或者IGKJ与E K或者IGLCl与E λ 3_1之间的区域)以作为BAC靶向的着陆区。所述HPRT小基因包含两个合成外显子和相关内含子。所述5’HPRT外显子侧翼是两个异种特异性和不相容1xP位点(一个是野生型位点，另一个是突变的位点1οΧ5171)，彼此是相反方向(图22)。这两个1xP位点提供了通过RMCE进行BAC插入的重组位点。2.将第一个修饰的BAC插入靶向的着陆区中。所述第一个BAC具有一段DNA，其插入侧翼被工程化修饰的基·因组中。所述5’修饰(loxP-neo基因_lox2272_PGK启动子-PB5’LTR)和 3’ 修饰(PB3’LTR-puroATK 基因-1οχ5171)在图 23 中与 1x 位点和 PBLTR的相对方向一起示出。通过从共电穿孔的载体中瞬时CRE表达，所述DNA序列通过RMCE被插入指定基因座中。其中已经发生正确插入的细胞如下选择:(i)嘌呤霉素抗性(所述pirn) Λ TK基因具有从着陆区中获得的启动子-PGK)，(ii)6TG-抗性(所述HPRT小基因被破坏)及(iii)G418-抗性(通过5’区PGK-neo排列针对任何插入选择)。可以使用这些选择方案的任何组合。在5’末端针对正确事件进行G418-和6TG-抗性选择，而在3’末端上针对正确事件进行嘌呤霉素抗性选择。3.去除(除去)第一次插入的3’修饰。正确插入的第一个BAC导致3’末端具有PUiO Λ TK基因，侧翼是反向PB LTR(图24)-本质上正确的转座子结构。这个转座子然后可以通过PiggyBac转座酶的瞬时表达而除去(从电穿孔的载体中)。具有正确切除事件的细胞可以通过FIAU抗性选择-即从pirn) Λ TK基因无胸苷激酶活性。这完全除去了 3’修饰，无剩余痕量核苷酸。4.在第一次插入的5’末端插入第二个修饰的BAC。第二个BAC具有被插入基因组中的一段DNA序列(通常与用第一个BAC插入的DNA是连续的)，侧翼是工程化修饰。所述5，修饰(1xP - HPRT小基因5’部分_lox5171 - PGK启动子-ΡΒ5，LTR)和3，修饰(ΡΒ3’ LTR-puro Δ TK-lox2272)在图25中与1x位点和PB LTR的相对方向一起描述。通过从共电穿孔的载体中瞬时CRE表达，通过RMCE所述DNA序列将被插入指定基因座。可以如下选择其中已经发生正确插入的细胞:(i)HAT-抗性(HPRT小基因通过正确的插入事件重构，即5’和3’外显子结构在一起)，及(ii)嘌呤霉素抗性(puro Λ TK具有从着陆区中获得的启动子-PGK)。5.去除(除去)第二次插入的3’修饰。正确插入的第二个BAC导致3’末端具有PUIO Λ TK基因，侧翼是反向PB LTR (图26)-本质上正确的转座子结构，与成功的第一次BAC插入的结果精确相似。因此这个转座子同样可通过PiggyBac转座酶的瞬时表达而除去(从电穿孔载体中)。可以通过FIAU抗性选择具有正确切除事件的细胞，即从puro Λ TK基因中无胸苷激酶活性。这完全去除了 3’修饰，无剩余痕量核苷酸。6.在除去第二次BAC插入的3’修饰之后，所述着陆区变得与原始相同。可以重复多次这个全部过程，即步骤2-5，以在基因组中进行大的插入。当完成时，除了希望的插入之外没有剩余的残余核苷酸。通过将奇数BAC插入Ig基因座中，内源VDJ或VJ序列可以通过如下所述染色体工程的倒位而失活(见图27-29):1.将“ 翻转(flip-over)”盒靶向与内源VDJ或VJ相距10-40兆碱基的5’区域虫。所述翻转载体(PB3’ LTR - PGK启动子-HPRT小基因5’部分-loxP-puro Λ TK - CAGGS启动子-ΡΒ3’ LTR)在图27中与1x位点和PB LTR的相对方向一起描述。2.瞬时CRE表达将导致“翻转”盒中1xP位点与5’修饰中1xP位点之间的重组。这个5’修饰如上述步骤2和3所述-在已经除去3’修饰后，实质上所述修饰得自奇数BAC的插入。所述1xP位点相互反向，因此所述重组事件导致倒位,如图28所述。具有正确倒位的细胞是HAT-抗性的，因为HPRT小基因通过正确倒位重构。3.正确倒位也使得在“翻转”盒和5’修饰的侧翼剩余两个转座子结构。二者均可以通过瞬时PiggyBAC转座酶表达而切除，无任一修饰剩余(图29)。具有正确切除的细胞可以如下选择:(i)6TG-抗性(HPRT小基因缺失)及(ii)FIAU-抗性(puro Λ TK基因缺失)。如在Ig基因座中所述倒位将分别从Ey或Ek增强子区域除去内源IGH-VDJ或IGK-VJ区，导致内源IGH-VDJ或IGK-VJ区失活。本发明的插入方法适当地提供如下一或多个结果:在插入的DNA片段的5’和3’末端的选择；有效去除3’修饰，优选通过转座酶介导的DNA切除进行；通过倒位使内源IGH或IGK活性失活；以及切除修饰，在染色体中无核苷酸痕量剩余。实施例3所述方法概念的证实在图30中揭示。在图30中，如图22所示的着陆区通过同源重组插入小鼠基因组中，随后通过ere-介导的位点特异性重组将R21质粒插入该着陆区中。所述插入事件产生许多一般插入事件，360个G418抗性集落，其中通过HRPT小基因座的破坏而证实 220个插入希望的基因座中。R21载体在5’和3’末端模拟第一次BAC插入载体，包括所有选择元件和重组酶靶向位点。代替BAC序列，有一个小“填充”序列。这个载体既测试本发明设计的所有重要因素，也允许容易测试结果，即跨填充序列的PCR是可行的并且因此使得插入的两端易于被检测。R21与ere-表达载体共电穿孔进在IGH基因座携带着陆区的ES细胞中。平行转染四组转化细胞，然后置于不同的选择方案下，如图30所示。G418选择(neo基因表达)由于不需要特异性着陆区整合而产生最大数目的集落。任何R21整合进基因组中将提供导致G418-抗性的neo表达。Puro选择产生与Puro+6TG或G418+6TG相似的集落数,提示Puro选择的严格性是由于Puro Δ TK缺失载体中的启动子所致。Puio表达仅在整合发生在启动子元件附近时才获得，在此设计中最大可能特异性在着陆区中。这些结论由在图31中示出的连接PCR(junction PCR)的结果支持。
本发明下一步骤是“去除”整合的BAC载体的3’末端，在插入与侧翼基因组之间实现无缝转换。我们通过扩增上述个体克隆(R21插入着陆区中)及在这个克隆中通过转染表达质粒而表达PiggyBac重组酶证实了这种去除。用FIAU选择其中切除3’修饰的集落，即通过在PiggyBac末端重复之间丧失PGK-puro Δ TK元件而切除。从IO6个细胞的转染中获得50个这样的克隆，检测其中6个克隆的期望的基因组结构。成功去除导致在引物组之间的阳性PCR，图32中标记为“3”。在这6个克隆中，4个具有正确切除，I个克隆保持原始构型，及另I个具有缺失。这些数据证实使用上述方法，在指定基因组基因座，DNA重复插入着陆区中。实施例4实施例3证实本发明的设计能将检测载体插入基因组中指定位置，在这种情况中是将R21载体插入小鼠IGH基因座中。合适的选择培养基的使用及ere-重组酶的表达导致具有预期结构的基因组改变。将本发明描述的相同设计元件加入到BAC插入物的5’和3’末端。所述插入物包含来自IGH基因座的人类序列，大约166-kb。将这个工程化的BAC与ere-表达质粒DNA —起电穿孔进在小鼠IGH基因座携带着陆区的小鼠ES细胞中。转染的细胞群在含有puro的培养基中生长以选择适当的插入事件。分离7个获得的克隆并进一步分析。预期的重组事件和所得结构在图33中示出。基于来自实施例3所述的R21实验的数据，当转染的群体在含有puro的培养基中选择时，预期严格选择出正确的克隆。这是因为puro-编码区需要启动子元件，且这优先由重组后的着陆区提供。因此，如诊断性PCR确定，这7个分离的克隆的大多数已经正确插入基因组中着陆区。诊断正确插入 的引物在图33中示出。如果在引物“A”与“X”之间扩增610-bp片段并且在引物“Y”和“B”之间扩增478-bp片段，则在基因组中存在正确连接(图33和34)。注意在“A”与“I”引物及“2”与“B”引物之间有扩增的片段表示存在亲代基因组(即只有着陆区)。来自亲代细胞的这些结果内部存在于puro选择下的细胞集落中，其由于集落的几何形状而逃避选择。在将所述集落通过含有PU1X)的培养基传代后，这些亲代连接片段消失表示所述亲代细胞从该群中除去。此外，正如预期，如果HPRT基因通过正确插入事件失活，所有克隆均示出是6-TG抗性的。这些数据表明本发明揭示的将大部分人类IG基因座插入小鼠基因组中指定位置的策略使得可以构建具有位于小鼠恒定区上游的多个人类IG区的可变区的小鼠。实施例5产生细菌人工染色体(BAC)，其中BAC具有人类Ig基因节段(人类V、D和/或J基因节段)的插入物。使用本文所述方法，在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中构建嵌合Ig基因座的方法中使用着陆区，由此提供嵌合IgH和IgK基因座，其中人类基因节段功能性插入在内源恒定区上游。为了检测衍生自人类BAC插入的ES细胞克隆的嵌合小鼠中人类IgH-VDJ或IgK-VJ基因节段是否适当重排和表达，我们对来自这些小鼠的白细胞的RNA样品进行了 RT-PCR，使用的是人类可变(V)区和小鼠恒定(C)区的引物对。寡核苷酸序列如下所示。每个V寡核苷酸与C寡核苷酸配对(HV与C μ，KV与C K
权利要求
1.非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一个或多个人类D区及一个或多个人类J区；以及 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区及人类可变区的嵌合抗体或者嵌合重链的所有组成成分， 其中人类DNA插入在非人类哺乳动物恒定区与最后的3’非人类哺乳动物J区之间，以及 其中所述哺乳动物包含完整VJC人类轻链区的插入。
2.非人类哺乳动物细胞，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区及一或多个人类J区，以及 其中人类DNA插入在非人类哺乳动物恒定区与最后的3’非人类哺乳动物J区之间，以及 其中所述哺乳动物包含完整VJC人类轻链区的插入。
3.非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgHV区、一或多个人类D区及一或多个人类J区，以及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区及一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区及一或多个人类Ig轻链λ J区； 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合轻链或重链的所有组成成分， 其中插入的人类IgH VDJ区包含在种系构型中来自人类的所有V、D和J区及插入序列。
4.非人类哺乳动物细胞，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgHV区、一或多个人类D区及一或多个人类J区，以及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区， 其中插入的人类IgH VDJ区包含在种系构型中来自人类的所有V、D和J区及插入序列。
5.非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgHV区、一或多个人类D区及一或多个人类J区，以及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区， 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合轻链或重链的所有组成成分； 或者非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；以及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区； 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合轻链或重链的所有组成成分， 其中插入DNA的所述非人类哺乳动物基因组包含未被缺失的内源V(D) J区，以及 其中人类重链DNA插入在所述非人类哺乳动物恒定区与最后的3’非人类哺乳动物J区之间。
6.非人类哺乳动物细胞，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，以及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区， 或者非人类哺乳动物细胞，其 基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区，及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区及一或多个人类J区， 其中插入DNA的所述非人类哺乳动物基因组包含未被缺失的内源V(D) J区，以及 其中人类重链DNA插入在非人类哺乳动物恒定区与最后的3’非人类哺乳动物J区之间。
7.非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgHV区、一或多个人类D区及一或多个人类J区，以及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区； 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合轻链或重链的所有组成成分； 或者非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链K V区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区；以及(b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区； 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合轻链或重链的所有组成成分， 其中所述非人类哺乳动物基因组通过所有或部分非人类哺乳动物VDJ区或VJ区的倒位而被修饰为阻止天然(完全宿主物种特异性)抗体的表达。
8.非人类哺乳动物细胞，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，以及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区； 或者非人类哺乳动物细胞，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区和/或位于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游的多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区，及 (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J 区， 其中所述非人类哺乳动物基因组通过所有或部分非人类哺乳动物VDJ区或VJ区的倒位被修饰为阻止天然(完全宿主物种特异性)抗体的表达。
9.非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区，一或多个人类D区和一或多个人类J区， 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合重链的所有组成成分， 其中所述哺乳动物是小鼠，并且人类重链DNA插入在小鼠基因组中小鼠染色体12的坐标114，667，090与114，665，190之间(坐标参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBIM37)或者在另一非人类哺乳动物基因组的等价位置。
10.非人类哺乳动物细胞，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区， 其中所述哺乳动物是小鼠，并且人类重链DNA插入在小鼠基因组中小鼠染色体12的坐标114，667, 090与114，665，190 (坐标参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBIM37)之间或者在另一非人类哺乳动物基因组的等价位置。
11.非人类哺乳动物，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区， 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合重链的所有组成成分，其中所述人类IgH VDJ区包含来自人类染色体14的105，400，051-106，368，585位核苷酸(坐标参照人类基因组NCB136，ENSEMBL Release54)或者来自另一人类的等价人类区域。
12.非人类哺乳动物细胞，其基因组包含: (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区， 其中所述人类IgH VDJ区包含来自人类染色体14的105，400，051-106，368，585位核苷酸(坐标参照人类基因组NCB136，ENSEMBL Release54)或者来自另一人类的等价人类区域。
13.权利要求3-4、7-8或11-12的细胞或哺乳动物，其中人类DNA插入在非人类哺乳动物恒定区与最后的3’非人类哺乳动物J区之间。
14.权利要求1-8或11-13任一项的细胞或非人类哺乳动物，其中所述哺乳动物是小鼠或者所述细胞是小鼠细胞，其中人类重链DNA插入在小鼠基因组中小鼠染色体12的坐标.114，667，090 与 114，665，1 90 之间，例如在坐标 114，667，089 与 114，667，090 之间(坐标参照与小鼠品系C57BL /6J相关的NCBI m37)或者在另一非人类哺乳动物基因组中的等价位置。
15.权利要求1-8、11-13的细胞或非人类哺乳动物，其中人类重链DNA插入在位置.114，667，090 与 114，667，091 之间。
16.权利要求1-14的细胞或非人类哺乳动物，其中参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBM37，人类重链DNA插入在小鼠染色体12的坐标114，666，183与114，666，725之间，如在坐标114，666，335与114，666，536之间，任选地在坐标114，666，385与.114，666，486之间，任选地在坐标114，666，425与114，666，446之间，如在坐标14，666，435与114，666，436之间，或者在来自不同小鼠品系的小鼠染色体12的等价位置或者另一非人类脊椎动物基因组的等价位置。
17.前述任何权利要求的细胞或哺乳动物，其中人类IgHVDJ区包含来自人类染色体.14的105，400, 051-106, 368，585位核苷酸，坐标参照人类基因组NCBI36，或者包含来自不同人类序列或数据库的染色体14的等价核苷酸。
18.权利要求1-16的细胞或哺乳动物，其中参照GRCH37/hgl9序列数据库，人类IgH VDJ区包含或由人类染色体14的106，328，851-107, 268，544位核苷酸如 106，328，901-107, 268，494 位核苷酸、如 106，328，941-107，268，454 位核苷酸、如106，328，951-107，268，444位核苷酸或者来自不同人类序列或数据库的染色体14的等价核苷酸组成。
19.前述任何权利要求的细胞或哺乳动物，其包含插入的人类KVJ区，所述人类KVJ区包含在种系构型中的来自人类的所有V和J区及插入序列。
20.权利要求19的细胞或哺乳动物，其中人类KDNA插入在小鼠染色体6的坐标 70，673，918-70，675，517 之间，如在坐标 70，674，655-70，674，856 之间，如在坐标 70，674，705-70，674，906 之间，如在坐标 70，674，745-70，674，766 之间，如在坐标.70，674，755-70, 674，756之间(参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBM37)，或者在另一基因组的等价位置。
21.权利要求19或20的细胞或哺乳动物，其中插入的KDNA包含或者由人类染色体2的片段组成，编号参照GRCH37/hgl9序列数据库，或者来自不同的人类序列或数据库的染色体2的等价核苷酸，所述片段选自如下一或多项: (i)89,158，979-89，630，537 位核苷酸，如 89，159，029-89，630，487 位核苷酸，如89，159，069-89，630，447位核苷酸，如89，159，079-89，630，437位核苷酸，任选地加上片段(ii)， (ii)89，941，614-90，267,076位核苷酸，如 89, 941, 664-90, 267,026 位核苷酸，如89，941，704-90，266，986位核苷酸，如89，941，714-90，266，976位核苷酸，任选地加上片段(i)， (iii)89,158，979-90，267，076 位核苷酸，如 89，159，079-90，266，976 位核苷酸。
22.权利要求3-21任一项的细胞或哺乳动物，其包含插入的人类λ区，所述人类λ区包含至少一个人类J λ区和至少一个人类C λ区，任选地(^6和/或(^7。
23.权利要求3-22任一项 的细胞或哺乳动物，其包含多个人类JX区，任选地Ja1、^2、^6和Ja7中的两或更多个，任选地所有夂1、夂2、夂6和Ja7。
24.权利要求3-23任一项的细胞或哺乳动物，其包含至少一个人类Ja-Ca簇，任选地至少 Ja7_Ca7。
25.前述任何权利要求的细胞或哺乳动物，其包含人类Eλ增强子。
26.权利要求3-25任一项的细胞或哺乳动物，其包含插入的人类λVJ区，所述人类λ VJ区包含在种系构型中的来自人类的所有V和J区及插入序列。
27.权利要求26的细胞或哺乳动物，其中所述区域包含或由来自参照GRCH37/hgl9序列数据库的人类染色体22的22，375，509-23，327，984位核苷酸如22，375，559-23，327，934位核苷酸、如22，375，599-23，327，894位核苷酸、如22，375，609-23, 327，884位核苷酸或者来自不同人类序列或数据库的人类染色体22的等价核苷酸组成。
28.权利要求26或27的细胞或哺乳动物，其中在小鼠基因组中的插入可以在参照小鼠基因组NCBM37的小鼠染色体16的坐标19,027, 763与19，061，845之间，如在坐标19，047，451与19，047，652之间，如在坐标19，047，491与19，047，602之间，如在坐标19,047, 541与19,047, 562之间，如在坐标19,047, 551与19,047, 552之间，或者在其它基因组的等价位置。
29.权利要求26或27的细胞或哺乳动物，其中在小鼠基因组中的插入可以在参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCB頂37的小鼠基因组中小鼠染色体6的坐标70,673,918与70,675, 517之间，如在坐标70, 674, 655与70，674，856之间，如在坐标70，674，705与70，674，806之间，如在坐标70，674，745与70，674，766之间，如在坐标70，674，755与70，674，756之间，或者在另一基因组的等价位置。
30.前述任何权利要求的细胞或哺乳动物，其中所述人类轻链KVJCDNA或者其一部分插入在小鼠K VJC区的立即上游。
31.权利要求1-6和9-30的细胞或哺乳动物，其中所述细胞或哺乳动物基因组被修饰为阻止或降低完全宿主物种特异性抗体的表达。
32.权利要求31的细胞或哺乳动物，其中所述非人类哺乳动物基因组通过所有或部分非人类哺乳动物VDJ区或VJ区的倒位而被修饰。
33.权利要求1-4和7-32的细胞或哺乳动物，其中插入DNA的所述非人类哺乳动物基因组包含未被缺失的内源V(D)J区。
34.前述任何权利要求的非人类细胞或哺乳动物，其在阻止成熟的宿主B和T淋巴细胞的产生的遗传背景中产生。
35.在Rag-1或Rag-2缺陷背景中产生的权利要求34的非人类哺乳动物。
36.权利要求2、4、6、8、10、12-35任一项的细胞，其是能发育成非人类哺乳动物的ES细胞、造血干细胞或者其它细胞,所述非人类哺乳动物能产生嵌合抗体或嵌合抗体链的所有组成成分，所述嵌合抗体或抗体链具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区。
37.权利要求2、4、6、8、10、12-36任一项的细胞，其是能有助于非人类哺乳动物的组织或器官的ES细胞、造血干细胞或者其它细胞,所述非人类哺乳动物能产生嵌合抗体或者嵌合抗体链的所有组成成分，所述嵌合抗体或抗体链具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区。
38.前述任何权利要求的细胞或哺乳动物，其包含插入的来自至少人类重链和人类轻链的人类可变区DNA。
39.权利要求1-38的细胞或哺乳动物，其中所述细胞或哺乳动物在编码嵌合抗体链的DNA的一个、两个或所有三个免疫球蛋白基因座是纯合的。
40.权利要求1-39的细胞或哺乳动物，其中所述细胞或哺乳动物在编码嵌合重链或轻链的DNA的一个、两个或所有三个免疫球蛋白基因座是杂合的。
41.权利要求3-40的细胞或哺乳动物，其中所述细胞的基因组不包含来自另一细胞或生物体的恒定区DNA。
42.权利要求2、4、6、10、12-41的细胞，其是永生化的。
43.前述任何权利要求的细胞或哺乳动物，其基因组包含非人类非宿主转换序列，如S-mu0
44.权利要求43的细胞或哺乳动物，其中所述转换序列是大鼠转换序列。
45.权利要求44的细胞或哺乳动物，其中所述大鼠转换序列 包含或由GAGCT (296次重复)、GGGGT (50次重复)及GGGCT (83次重复)组成，和/或 包含序列GGGCT的3、4、5、6或更多次连续重复。
46.权利要求45的细胞或哺乳动物，其中所述大鼠转换序列具有SEGID NO:1所示序列。
47.前述任何权利要求的细胞或哺乳动物，其中所述转换序列来自小鼠129品系，任选地具有SEG ID NO:4所示序列。
48.权利要求1-46的细胞或哺乳动物，其中所述转换序列来自小鼠C57品系，任选地具有SEG ID NO:5所示序列。
49.前述任何权利要求的细胞，其是ES细胞系AB2.1或者选自C57BL/6、M129的小鼠品系如129/SV、BALB/c以及C57BL/6、M129的任何杂种如129/SV或者BALB/c的细胞。
50.产生非人类哺乳动物或细胞的方法，所述方法包括在非人类哺乳动物基因组中插入: (a)多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，位于宿主非人类哺乳动物恒定区的上游，及(b)任选地一或多个人类Ig轻链K V区和一或多个人类Ig轻链K J区于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游和/或一或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链入J区于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游； 所述插入使得所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者抗体重链或轻链的所有组成成分，其中步骤(a)和(b)可以任意顺序进行，步骤(a)和(b)各自可以逐步进行或者作为单一步骤进行。
51.产生非人类哺乳动物或细胞的方法,所述方法包括在非人类哺乳动物细胞基因组中插入: (a)多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链K J区于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游和/或多个人类Ig轻链λ V区和一或多个人类Ig轻链λ J区于宿主非人类哺乳动物λ恒定区上游，以及 (b)任选地一或多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区于宿主非人类哺乳动物恒定区上游， 所述插入使得所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合抗体或者嵌合抗体重链或轻链的所有组成成分，其中步骤(a)和(b)可以任意顺序进行，步骤(a)和(b)各自可以逐步进行或者作为单一步骤进行。
52.权利要求50或51的方法，其中所述非人类哺乳动物基因组然后被修饰为阻止天然(完全宿主物种特异性)抗体在所述哺乳动物中表达，任选地通过全部或部分非人类哺乳动物VDJ或VJ区的倒位、任选地通过在基因组中插入一或多个位点特异性重组酶位点及随后在重组酶介导的切割中 使用这些位点或者全部或部分非人类哺乳动物Ig基因座的倒位而实现。
53.权利要求50-52的方法，其中所述细胞是ES细胞。
54.权利要求50-53的方法，其中人类VDJ或VJ区插入在宿主非人类哺乳动物恒定区上游是通过同源重组逐步插入多个片段实现的。
55.权利要求50-54的方法，其中所述插入过程在起始盒已经插入ES细胞基因组中提供独特靶向区的位点开始。
56.权利要求50-55的方法，其中一或多个插入事件利用位点特异性重组。
57.权利要求56的方法，其利用由一或多个Frt位点、Flp重组酶:Dre重组酶、Rox位点或PhiC31重组酶介导的重组或涉及一或多个Frt位点、Flp重组酶:Dre重组酶、Rox位点或PhiC31重组酶的重组。
58.权利要求50-57的方法，其中所述方法包括如下步骤: I在细胞基因组中插入DNA形成起始盒(在本文也称作着陆区)； 2将第一 DNA片段插入插入位点中，所述第一 DNA片段包含人类DNA的第一部分及第一载体部分，所述第一载体部分含有第一选择标记或在插入时产生选择标记； 3任选地除去部分载体DNA ； 4在第一 DNA片段的载体部分中插入第二 DNA片段，所述第二 DNA片段含有人类DNA的第二部分及第二载体部分，所述第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记； 5除去任何载体DNA，以使得第一和第二人类DNA片段形成连续序列 '及6如果需要，重复插入部分人类V(D)J DNA及除去载体DNA的步骤，以产生具有足以能与宿主恒定区联合产生嵌合抗体的全部或部分人类VDJ或VJ区的细胞， 其中至少一个DNA片段的插入利用位点特异性重组。
59.权利要求50-58任一项的方法，其中插入的着陆区序列包含SEQID NO:6所示序列或是SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示任何序列。
60.权利要求50-59任一项的方法，其中所述着陆区通过小鼠J1-4与小鼠Cmu序列之间的同源重组而插入小鼠染色体中。
61.权利要求50-60的方法，其中所述着陆区通过在小鼠J1-4与Emu序列之间的同源重组而重组进小鼠染色体中。
62.权利要求50-61的方法，其中所述着陆区包含非内源S-mu，如大鼠S-mu转换序列。
63.权利要求1-60的方法、细胞或哺乳动物，其中将人类编码区DNA序列与非人类哺乳动物控制序列功能性排列，由此人类DNA的转录由非人类哺乳动物控制序列控制。
64.产生特异于希望抗原的抗体或抗体重链或轻链的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫权利要求1、3、5、7、9、11、13-48的非人类哺乳动物以及回收所述抗体或抗体链或者回收产生所述抗体或重链或轻链的细胞。
65.产生完全人源化抗体或抗体链的方法，包括免疫权利要求64的非人类哺乳动物，然后适当地通过对编码所述抗体的核酸的工程化而用人类恒定区置换与抗原特异性反应的抗体的非人类哺乳动物恒定区。
66.根据权利要求64或65产生的人源化抗体或抗体链。
67.根据权利要求64或65产生的人源化抗体或抗体链在医学中的应用。
68.根据权利要求64或65产生的人源化抗体或抗体链用于医学中。
69.包含权利要求64或65的抗体及药物可接受的载体或其它赋形剂的药物组合物。
70.根据权利要求64产生的嵌合抗体的嵌合抗体衍生物。
71.小鼠，其基因组包含在小鼠染色体12的坐标114，667，090与114，665，190之间例如在坐标114，667，089与114，667，090之间插入的人类IgH VDJ DNA，所述插入包含来自人类染色体14的105，400，051-106，368，585位核苷酸(坐标参照人类基因组NCBI36及小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者分别在另一人类染色体14序列或另一小鼠基因组中的等价坐标)，所述插入位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游，由此所述小鼠能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌合重链的所有组成成分，其中所述哺乳动物也包含完整VJC人类轻链区的插入，由此可以产生能与嵌合重链形成抗体的完全人类λ或κ人类抗体链。
72.小鼠，其基因组包含在小鼠染色体12的坐标114,667,090与114,667,091之间插入的人类IgH VDJ DNA，所述插入包含或由来自人类染色体14的105，400, 051-106, 368，585位核苷酸组成(坐标参照人类基因组NCBI36及小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者分别在另一人类染色体14序列或另一小鼠基因组中的等价坐标)，所述插入位于小鼠恒定区上游，由此所述小鼠能产生具有小鼠恒定区和人类可变区的嵌合重链的所有组成成分，其中所述小鼠也包含完整VJC人类轻链区的插入，由此可以产生能与嵌合重链形成抗体的完全人 类λ或K人类抗体链。
73.小鼠，其基因组包含在小鼠染色体12的坐标114，667，090与114，665，190之间插入的人类IgH VDJ DNA，其中坐标参照小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者在另一小鼠品系中等价位置的插入，所述插入包含或由来自人类染色体14的106，328,951-107, 268, 444位核苷酸或者另一人类染色体14序列中等价位置的相同核苷酸组成，其中坐标参照人类GRCH37/hgl9序列数据库，所述插入位于宿主小鼠恒定区上游，由此所述小鼠能产生具有小鼠恒定区和人类可变区的嵌合重链的所有组成成分，其中所述小鼠也包含完整VJC人类轻链区的插入，其可以产生能与嵌合重链形成抗体的完全人类λ或K人类抗体链。
74.权利要求48的小鼠，其中所述插入位于小鼠染色体12的坐标114,666,435与114，666，436 之间。
75.非人类哺乳动物或细胞，其基因组包含位于宿主非人类哺乳动物轻链恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，由此所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。
76.非人类哺乳动物或细胞，其基因组包含位于宿主非人类哺乳动物重链恒定区上游的多个人类Ig轻链V区和一或多个人类J区，由此所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。
77.权利要求75或76的细胞或哺乳动物，其能表达具有重链和轻链的抗体，包括一个嵌合抗体链。
78.转基因，其编码位于宿主非人类哺乳动物轻链恒定区上游的多个人类IgHV区、一或多个人类D区和一或多个人类J区。
79.转基因，其编码位于宿主非人类哺乳动物重链恒定区上游的多个人类Ig轻链V区和一或多个人类轻链J区。
80.多核苷酸着陆区序列，所述多核苷酸包含与靶染色体区同源的核酸区，以允许通过同源重组插入靶染色体中，并且包含核酸位点，其允许重组酶驱动的核酸插入着陆区中，其中所述多核苷酸序列包含一或 多个: (i)非人类非小鼠序列，如大鼠转换序列，任选地SEQID NO:1序列； (ii)5’至3’方向的小鼠Εμ序列、非人类非小鼠转换序列及小鼠Cy； (iii)具有SEQID NO:6序列的3’同源臂。
81.细胞或非人类哺乳动物，其包含已经插入细胞基因组中的权利要求79的着陆区序列。
82.权利要求80或81的细胞、哺乳动物或着陆区，其中大鼠转换序列包含序列GGGCT的3、4、5、6或更多个连续重复，任选地是SEQ ID NO:1。
83.权利要求80-82的细胞、哺乳动物或着陆区，其中着陆区序列包含SEQID NO:2的序列。
84.权利要求80-82的细胞、哺乳动物或着陆区，其中着陆区序列包含SEQID NO:3的序列。
85.非人类细胞或非人类哺乳动物，其包含: 完全人类λ基因座，其包含来自人类的基本上全部的λ VJC区， 嵌合Κ基因座，其包含与非人类宿主K恒定区可操纵连接的基本上全部的人类KVJ区，以及 嵌合重链基因座，其具有与非人类宿主重链恒定区可操纵连接的人类VDJ区。
86.嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C gamma或C mu), 其中所述抗体由相应于细胞(任选地B细胞、ES细胞或杂交瘤)的嵌合重链基因座的核苷酸序列的核苷酸序列编码，所述基因座包含非人类脊椎动物或哺乳动物恒定区核苷酸序列及通过人类V节段、人类D节段和人类J节段的体内重排产生的重排的VDJ核苷酸序列， 所述V区选自来自人类的V1-3区、V2-5区、V4-4区、V1-2区或V6-1区之一，任选地V1-3或V6-1节段。
87.权利要求86的嵌合抗体，其中所述J区是JH4或JH6。
88.权利要求86或87的嵌合抗体，其中所述D区是D3-9、D3-10、D6-13或D-19。
89.权利要求86-88 的嵌合抗体，其包含:V1-3JH4，V1-3JH6，V6-1D3-10, V6-1D6-19，V1-3D3-9, V1-3D3-10, V1-3D6-19。
90.非人类脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其编码权利要求86-89的嵌合抗体。
91.非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其具有编码权利要求86-90任一嵌合抗体的基因组。
92.非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其具有编码权利要求86-91任一嵌合抗体的基因组，所述哺乳动物表达比V2-5、V4-4、V1-2或V6-1抗体更多的V1-3抗体。
93.非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其具有编码权利要求86-92任一嵌合抗体的基因组，所述哺乳动物表达比单独V1-3JH1、V1-3JH2、V1-3JH3或V1-3JH5任一抗体更多的V1-3JH4或V1-3JH6抗体。
94.非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其具有编码权利要求86-93任一嵌合抗体的基因组，所述哺乳动物表达比单独V6-1JH1、V6-1JH2、V6-1JH3或V6-1JH5任一抗体更多的V6-1JH4或V6-1JH6抗体。
95.非人类脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其具有编码权利要求86-94任一嵌合抗体的基因组，所述哺乳动物表达V1-3DH10抗体的量比具有任何其它D区的V1-3抗体的量更大。
96.嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地轻链恒定区)，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人类K V1-8和种系人类K Jl序列，其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中所述V1-8和Jl序列的体内重组而获得，并且其中所述抗体具有与由种系人类K V1-8和种系人类K Jl序列编码的序列不同的可变区序列。
97.权利要求96的嵌合抗体，其中所述抗体序列包含:X1X2TF G Q，其中X1X2=PR、RT或 PW,任选地是 X1X2T FGQGTKVEIKRAD A 基序。
98.嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地轻链恒定区)，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人kV1-6和种系人Kjl序列，其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中所述V1-6和Jl序列的体内重组而获得，并且其中所述抗体具有与由种系人kV1-6和种系人K Jl序列编码的序列不同的可变区序列。
99.权利要求98的嵌合抗体，其中所述抗体序列包含X3X4TF G Q，其中X3X4=PR或PW,任选地是 X3X4T FGQGTKVEIKRAD A 基序。
100.嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地Cga_a*C mu或Ck )，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人KV1-5和种系人K Jl序列，并且其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中所述V1-5和Jl序列的体内重组而获得。
101.嵌合抗体，其包含人类可变区和非人类(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地Cga_a*C mu或Ck )，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人K V1-5和种系人K J4序列，并且其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中所述V1-5和J4序列的体内重组获得。
102.非人脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含权利要求100或101的嵌合抗体链基因座。
103.非人脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含权利要求100或101的嵌合抗体 链基因座。
全文摘要
本发明揭示了产生嵌合人-非人抗体及嵌合抗体链的方法，如此产生的抗体和抗体链，以及包括完全人源化抗体的其衍生物，本发明揭示了包含所述抗体、抗体链及衍生物的组合物，以及适用于所述方法中的细胞、非人哺乳动物和载体。
文档编号C12N15/90GK103228130SQ201180039668
公开日2013年7月31日 申请日期2011年1月7日 优先权日2010年6月17日
发明者A·布拉德利, E-C·李, 梁琦, 汪玮 申请人:科马布有限公司