定制的微阵列构建体及其在靶分子检测中的应用的制作方法

专利名称：定制的微阵列构建体及其在靶分子检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测，鉴定和/或定量可能同时存在于一种样品中的多种靶分子的方法及试剂盒。
背景技术：
及现有技术 可以根据遗传物质中存在的特定序列鉴定生物体或微生物的多种表达基因。表达基因的鉴定及定量通常是在mRNA反转录为相应cDNA之后进行，所述cDNA的检测是通过存在或附着于微阵列上的特定捕获分子进行。特定生物体的检测可通过扩增其基因组DNA的特定序列然后检测和/或鉴定这种扩增序列容易地进行。定量与特定捕获分子结合的靶序列可以测定存在于初始样品中靶分子的数量。优选包括适当的调控方法，鉴于不同步骤的效率所做的校正，例如靶序列的复制或扩增及在微阵列上通过杂交而被捕获的步骤。
带有核苷酸序列阵列的微阵列目前主要按照两种方法制备。第一个方法，在美国专利US 5,510,270及5,700,637中描述，是基于固体支持物上捕获分子或序列的光刻(photolithographic)的原位合成。光刻DNA合成利用快速固相亚磷酰胺化学作用。通过结合5′光保护的亚磷酰胺和一组遮蔽屏(mask)可以实现位置及顺序的调控，其中所述5′光保护的亚磷酰胺可通过光照射活化，而所述遮蔽屏在适当的位置上带有洞，光可以通过这些洞。激发后，去除存在于部分寡核苷酸序列上的光保护基团(该基团是该过程中初期合成的)，加入相应的单体之后通过另一个核苷酸延长该寡聚物。当前的连结效率将这些芯片的实际大小限制在约25个碱基。如超过该极限值，会累积不完全产物。
光刻方法可以在支持物上产生短寡核苷酸。利用该方法，可以通过一系列同样物种的捕获序列(而不是单一序列)鉴定基因或基因序列。为调控特定靶序列的特定杂交，必须对各序列提供一个对照，该对照序列与初始序列一致，只有一个碱基差异。该方法的主要优点是可以使如此获得的阵列或芯片微型化，形成带有数千捕获序列的高密度阵列。
第二种方法基于在阵列基质已知的特定位置上发生机械沉积(deposition)之前捕获序列的化学或酶促合成。利用该方法，待点样、沉积或附着的序列大小没有限制。与原位合成方法相比，沉积技术的一个主要优点是其显著的多变性。该方法可以产生几乎任何目的分子的微阵列或芯片，包括但不限于任何长度的核酸序列，抗体，脂肪，碳水化合物，小化合物等等。此外，可以最优化序列的合成过程，纯化序列，在使用之前检验其质量，和/或在连结到固体表面之前调整其浓度。但是，该方法的一个缺点是较为耗时，因为点样到微阵列或芯片之前必须单独地处理各序列从而限制了阵列的大小。
与寡核苷酸杂交的微阵列的化学作用明显地不同于用长的DNA捕获序列或分子构建的阵列。已观察到长的特定捕获序列可比相应的短片段更好地与存在于溶液或样品中的互补靶序列结合。实际上长的多核苷酸捕获序列被用于直接结合长的多核苷酸靶分子或序列。在常规基因表达实验中，与cDNA结合的捕获序列包含50个或更多碱基，例如70个碱基，甚至可以包含600个碱基或核苷酸。
当仅使用15-20个碱基的短寡核苷酸作为捕获序列(参见如US 5,510,270)时，长cDNAs的充分检测，鉴定和/或定量可以改进该检测方案。首先利用带有T7RNA聚合酶转录起始位点的引物将RNA逆转录为相应cDNA。然后在体外将cDNA再转录为几个RNA拷贝，再将该拷贝切割成小片段。随后用这些小RNA片段在带有一系列捕获序列的阵列上杂交，所述捕获序列分别对应这些RNA片段。必须片段化序列以确保靶RNA序列能够充分接近极短的捕获序列。要求有特定的算法使这些不同捕获分子与靶DNA或mRNA原始序列的杂交图谱适当的关联起来。
对双链DNA(dsDNA)的检测进行类似的改进，可以优先在溶液中再结合，而不是与存在或附着于固体基质上的捕获序列杂交。通过利用带有T3或T7序列的引物进行的双扩增过程及随后的利用RNA聚合酶逆转录过程，将扩增子再一次再转录为RNA。在通过阵列检测之前将这些RNA切割成约40个碱基的片段(参见如国际专利申请WO97/29212的实施例1)。本文利用小于30核苷酸的捕获核苷酸序列，应用上述技术鉴定结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)rpoB基因。由于不能直接检测来自遗传扩增反应(例如PCR)的扩增子，因此从这一点说，所述的方法较为复杂，还需要另一个反应及复制靶序列的循环，这会在所述靶序列的定量中引入额外的偏离值。
尽管存在一些缺点，通过化学合成及寡核苷酸或短多核苷酸序列的沉积构建微阵列还是有益的，因为这是一个快速且廉价的过程。除此之外，可根据待分析或鉴别序列的需要容易地改造捕获分子或序列的设计。
捕获分子不一定必须由核苷酸序列构成。靶分子还可以是通过与其相应的配对物(counterparts)(抗体，抗原，配体，受体等)结合而被检测或捕获的抗体，抗原，受体或配体。上述实例名单并非是穷举。
用户并不总是使用标准的微阵列，即使其可以检测大量不同靶分子。他可能想要检测非常规的靶分子，或者想要提高灵敏度水平。因此用户越来越希望获得能够按照他的的愿望加入一些额外检测分子的定制(customized)或半定制微阵列。可能被进一步定制的基本或标准微阵列已经包含了多种不同的捕获分子，能够检测已被充分测定的基因。
可以构建标准微阵列并交给众多用户，然后这些用户可以使用该阵列检测一些定义清楚的靶基因和其它靶基因，每次应用或每个用户的靶基因都可能不相同。
发明目的 本发明旨在提供用标准微阵列进行新的检测，鉴定及定量方法和试剂盒，所述微阵列可被轻易地改变以满足一个或多个特定用户检测多种靶分子的特定需求。
本发明的另一目的是允许用户在一个特定实验中除了检测一组靶分子(该靶分子与已经同微阵列固体支持物表面结合的捕获分子相匹配)外还可以检测一组新的靶分子，所述新的靶分子可以根据试验而改变，对于这两组靶分子的所述检测是定量的，并与其在样品中的存在相关。
发明概述 本发明涉及检测或定量不同组靶分子(第一组和第二组靶分子)的方法，所述不同组靶分子可能同时存在于一个生物样品中；所述方法包括使这些不同组靶分子与固体支持物表面上存在的(微)阵列相接触的步骤；所述(微)阵列包含第一和第二组捕获分子，这些捕获分子存在于固体支持物表面的不同位置。
在本发明方法中，第一组捕获分子包含至少3种对第一组靶分子特异的捕获分子，其通过特定分子识别(优选通过杂交)作用直接固定第一组靶分子，第二组捕获分子包含至少3种与第二组靶分子(和第一组靶分子)无关且没有直接亲合性的捕获分子；第二组捕获分子能够通过一个衔接分子固定第二组靶分子，所述衔接分子能够在捕获分子和靶分子之间实现互补结合。
此外，在本发明方法中，通过一个校正系数可以方便地获得一组靶分子相对于另一组靶分子的相对定量，该系数是利用在两个捕获分子组中同时定量的至少一个额外相同的靶分子(能结合第一组捕获分子并能通过衔接分子结合第二组)计算得到。
本发明方法所用的校正系数可由本领域技术人员通过利用未知浓度的能够固定两组捕获分子的靶分子获得，或通过利用具有已知浓度的内标物获得，所述内标物被加到样品中并接受与待检测和/或定量的靶分子相同的预处理(纯化，扩增，复制)步骤以及接触步骤。所述已知浓度的内标物还能够与两组捕获分子结合。
因此，为准确定量存在于两组靶分子之一中的靶物质，本领域技术人员可以鉴定由于两组中的两种捕获分子结合而产生的两种信号之间的比率，获得所述信号的目的是为了给本领域技术人员提供一个校正系数，用于定量另一待检测和待定量的靶分子。
本发明另一方面涉及一种检测及定量试剂盒，其包含-一个(微)阵列组固体支持物表面，其包含存在于支持物表面不同位置的第一和第二组捕获分子，其中第一组捕获分子包含至少3种对样品中待检测和定量的靶分子特异的不同捕获分子，所述第一组捕获分子能够直接固定第一组靶分子；-并且其中，在所述固体支持物表面的不同位置上，所述(微)阵列固体支持物表面进一步包含第二组捕获分子，所述第二组捕获分子包含至少3种捕获分子，该捕获分子同可能与第一组靶分子同时存在于样品中的待检测和定量的第二组靶分子(以及第一组靶分子)无关且没有直接结合亲合性；-能够将第二组靶分子特异性结合到第二组捕获分子上的一种或多种衔接分子，以及；-一组靶分子的校正系数，其能够比较样品中第一和第二组靶分子的数量。
在本发明方法和试剂盒中优选第二组捕获分子是全能性捕获分子(“通用微阵列”部分)。因此，它们与自己的互补靶分子不相关，没有直接的结合亲合性，所述结合仅通过衔接分子进行。
根据本发明的第一实施方案，检测和定量是在(微)阵列上进行，该阵列被分成至少两个不同的阵列，存在于固体支持物的同一表面上。各阵列包含第一和第二组捕获分子，其存在于支持物表面的不同位置。所述至少两个不同的阵列包含用于检测同样靶分子的第一组捕获分子和互不相同的用于检测其它靶分子的不同的第二组捕获分子的阵列，各阵列是互不相同的。这就是说，有可能在靶分子的第一个位置上获得特定的类似检测，而在其它类型靶分子通过特定衔接分子与不同阵列的捕获分子结合后，获得所述靶分子的不同检测模式。各阵列的所述衔接分子是不相同的。
根据本发明的另一实施方案，通过第二组捕获分子固定靶分子是由用户向固体支持物加入衔接分子而完成。这是指本发明的阵列是“半定制(semi-customised)”的阵列，可根据用户要求用于获得特定结合，用于在微阵列表面特定位点特异性地鉴定靶分子。
根据本发明的第一方面，所述靶分子、捕获分子和衔接分子是核苷酸序列或包含核苷酸序列。在所述实施方案中，通过第二组捕获分子固定靶分子的过程是如下获得在捕获分子和靶分子之间通过衔接分子实现夹心杂交(sandwich hybridization)，所述衔接分子是互补核苷酸序列或包含互补核苷酸序列。
所述夹心杂交优选通过衔接分子获得，该分子包含第一部分和第二部分，所述第一部分能通过互补碱基对与捕获分子的一个特定末端部分杂交，所述第二部分对一种或多种靶分子的至少一部分具有特异性。
如果捕获分子是核苷酸序列，那么它的特定末端部分是指不能与固体支持物表面结合的5′或3′末端部分。
根据本发明的另一方面，靶分子和捕获分子是蛋白质，衔接分子是嵌合的蛋白质或杂合抗体，能够在捕获和靶分子之间实现特异的间接结合。根据优选实施例，靶分子和捕获分子分别是-抗原和抗体(或者所述抗体的高变的部分)，-或抗体(或其部分)和抗原。
本发明还提供测定(至定量)在初始样品中检测到的两组靶分子的数量的方法。不同靶分子的数量可以是相互之间的相对量，或校正为绝对值(p摩尔)。通过一个系数校正定量检测，该系数使得可以类似地且同时地检测所有被固定的靶分子(被固定到其捕获分子上)。本发明方法中更优选通过检测至少一个被加到所述(生物)样品中并接受与靶分子相同的检测步骤的标准序列来校正定量的检测结果。所述标准分子是在捕获分子的两个组上进行检测，所述捕获分子的两个组存在于固体支持物表面两个位置上。
在本发明另一方面，定量检测两个组中的至少一个共同靶分子，以此校正捕获分子两个组上靶分子的固定效率。在一个特定实施方案中，共同靶分子是管家基因。
优选在两个组的捕获分子上检测并定量3种标准物或3种靶分子，每一靶分子的浓度均以至少3倍(factor)的差异不同于其它靶分子。
为了使捕获分子和靶分子之间通过衔接分子特异结合，第二组捕获分子包含一种或多种能与衔接分子特异性结合的末端反应性化学官能团。优选所述末端反应性化学官能团选自醛基、环氧基、丙烯酸根/酯/盐基团或其混合物。
优选所有的捕获分子都通过共价键或连接方式结合到固体支持物表面，在固体支持物表面形成微阵列。在本发明的第一实施方案中，表面的第二位置包含捕获分子，其末端为反应性化学官能团(例如醛基，环氧基团，或丙烯酸根/酯/盐基团)，该基团可与衔接分子的NH2基团反应。
为避免空间位阻，捕获分子是通过一个特定长度的间隔物(或连接物)结合到固体支持物的表面。所述间隔物元件或分子可以是至少10个原子的聚合链，可以带有支链，可选自聚-乙二醇，聚氨基酸，聚丙烯酰胺，聚氨基糖，多聚糖，聚酰胺，聚丙烯酸酯，聚碳酸酯，聚环氧化物，聚酯分子或化学链，或其混合物。或者，捕获分子的一部分可以作为一个间隔物分子。优选间隔物分子至少为6.8nm长。间隔物分子可以是在约15到约1000个碱基之间的核苷酸序列，优选在约30到约120碱基之间。
本发明的方法和试剂盒特别适合于同步检测，鉴定和/或定量目的生物分子，例如靶多核苷酸或核苷酸序列(可以是同时存在于一个生物样品或试验溶液中的同源序列)，其中一个基本的多参数微阵列是根据用户的需求被改造。优选在检测之前利用本领域常规技术增多(复制)和/或扩增(遗传学扩增)靶分子，例如靶多核苷酸或核苷酸序列(如基因组DNA或RNA序列或扩增子)。或者可以利用本领域技术人员公知的技术扩增检测信号。
在本发明的上下文中，“核酸”，“寡核苷酸”，“阵列”或“微阵列”，“核苷酸序列”，“靶核酸”或“靶核苷酸序列”，“基本上结合”，“特异性杂交”，“背景”，“定量”等等术语的含义如同在国际专利申请WO97/27317中所述，该申请并入本文作为参考。
“同源序列”的含义如欧洲专利EP 1266034所述，该专利并入本文作为参考。
本文中用于构建微阵列的术语“固体支持物”包括任何类型的固体材料，其可接受物理学处理以完成必要的反应，如与试验溶液或可能含有靶分子或靶序列拷贝的样品进行温育。该固体支持物可以是单一成分或是几种材料构成的组合物，其中之一是基质表面，在该表面上捕获分子或核苷酸序列可以被固定或与其结合，形成微阵列。本领域所用的基质典型实例是聚合物，可以被功能化(functionalized)(包括接受向其表面加入接头的过程)，以便更好地固定捕获分子。捕获分子固定或结合的所述基质或支持物表面可以是多孔或无孔的支持物，可以是平滑的或粗糙的，可被置放或安放在另一固体支持物之上，例如由玻璃或塑料构成。
术语“样品”，“生物样品”或“试验溶液”包括任何可能包含靶分子的(生物)样品或溶液。所述靶分子可以是(微)生物体或获自(微)生物体或其组分(例如叶绿体，线粒体，基因，基因产物，蛋白质，肽，毒素，抗原，脂类，糖等)。
在本发明的上下文中，特别是(微)生物体或其组分(肉，骨......)特异性的多核苷酸或核苷酸序列是通过第二组捕获分子进行检测，其中靶分子是通过一个特定衔接分子被捕获。试验溶液可以是含有(微)生物体或其组分PCR产物(复制子)的溶液。
本文中术语“靶分子”可以是核苷酸序列或多核苷酸，也可以是样品中待检测的蛋白质，脂肪，糖类等等。
在本文中，“捕获分子”可包括核苷酸序列，还可以包括抗体或其高变部分(Fab，Fab2等)，抗原或其表位，受体，受体的配体等，其对靶分子具有特异性和/或对衔接分子具有特异性。
在本文中，术语“衔接子”可指多核苷酸序列或多肽序列(例如抗体，嵌合分子等)，其连接捕获分子和靶分子。
参照附图，下面的实施例和特定具体实施方案更详细地描述了本发明。所述实施例，具体实施方案和附图以及所用的参考标记并非是对本发明要求保护范围的限制。


图1代表阵列(7)形式的固体支持物表面(6)，由存在于固体支持物表面不同位置(8，9)的两组捕获分子(A，B)构成。第一组(A)由对靶分子(1)特异的捕获分子(2)组成，而第二组(B)由捕获分子(4)组成，其与靶分子(3)不相关。在捕获分子的两个组(A，B)上同时定量同一种分子(x)。
图2代表用本发明的两个″半定制″阵列(7′，7″)覆盖的玻璃载片的表面。在第一位置上(8′，8″)，两个阵列上的第一组捕获分子(A)是共同的，它们可以检测第一组靶分子(1)。但是在第二位置上(9′，9″)，两个阵列上的第二组捕获分子(B，B′)是不同的，它们可以检测第二组的不同靶分子。在捕获分子的两个组(A，B-B′)上同时定量同一种分子(x)。
图3代表被存在于固体支持物表面不同位置(8，9)的两组捕获分子(2，4)所覆盖的本发明固体支持物表面(6)。第一组捕获分子(2)对于第一组靶分子(1)特异，而第二组捕获分子与第二组靶分子(3)不相关，但可以通过使用靶(3)特异性衔接子(5)检测第二组靶分子。
发明详述 本发明涉及检测、鉴定和/或定量多种靶分子(1，3)的方法及试剂盒。用互补捕获分子固定之后可检测可能同时存在于样品中的物质，所述捕获分子存在于固体支持物表面(6)阵列(7)上。
所述表面(6)包含至少两组捕获分子(2，4)，其存在于固体支持物表面(6)的不同位置(8，9)，其中第一组A包含至少三种对于待检测、鉴定和/或定量的靶分子(1)特异的不同捕获分子(2)，所述捕获分子能够直接固定靶分子(1)；其中第二组B包含至少三种与待检测和定量的其它靶分子(3)不相关且不具备不同亲合性以固定所述靶分子(3)的捕获分子(4)，所述第二组捕获分子(4)通过衔接分子(5)固定靶分子(3)。在捕获分子的两个组上同时定量至少一种相同的分子(x)。
图1和3中描述的本发明的优选实施方案中，捕获分子以阵列(7，7′，7″)的形式存在于固体支持物表面6。如图2所述，检测可通过利用固体支持物表面完成，在所述固体支持物的表面上(6)存在至少两个不同的微阵列(7′，7″)；所述至少两个阵列(7′，7″)在第一位置(8′，8″)包含用于检测同样靶分子(1)的A组捕获分子(2)。
此外，各阵列(7′，7″)还包含不同组(B，B′)的捕获分子(4，4′)，用于检测阵列(7′)与(7″)彼此不同的靶分子(3，3′)，所述第二组(B，B′)捕获分子(4，4′)存在于与第一组A位置(8′，8″)不同的位置(9′，9″)。
根据本发明，通过向标准支持物表面(6)加入能够与全能性捕获分子(4)结合的衔接分子(5)，可以改变所述标准(微)阵列以使其适用于检测、鉴定和/或定量非常见的(其它)的靶分子(3)，所述支持物表面含有针对至少第一组靶分子(1)的捕获分子(2))，所述全能性捕获分子不能直接与可能存在于样品或试验溶液中的任何靶分子(3)结合。所述全能性捕获分子(4)已经存在于(结合于)表面(6)，在定制标准微阵列(7)上。优选所述(全能性)捕获分子(4)是核苷酸序列，例如DNA或RNA序列，其骨架可被修饰。
最优选第二组(B)捕获分子(4)到支持物表面(6)的附着(固定)作用没有导致第一组(A)捕获分子(2)的完全分离和/或失活。优选所述分离和/或失活被保持在尽可能低的程度。
本发明的标准微阵列或阵列(7)在定制之前就含有两个类型的捕获分子(2，4)。第一类型的捕获分子(2)对第一组靶分子(1)特异，而第二类型捕获分子(4)对靶序列(1或3)非特异。它们是全能性的，但可通过与靶-特异性衔接分子(5)结合而具备特异性。
在本发明的一个优选实施方案中全能性捕获分子(4)、衔接分子(5)和靶分子(3)是核苷酸序列。有利地，衔接分子(5)特异于靶多核苷酸(3)或其拷贝的至少一部分，使得通过间接地被捕获分子(4)固定，可以进行特异性杂交、检测、鉴定和/或定量。
待定制的预制标准分析物也被称为标准产品(如一般芯片，用于检测癌症的微阵列，小鼠微阵列等等)，是带有用于检测指定数目很好定义的靶分子的捕获分子的微阵列。与固体支持物表面特定位点结合的捕获核苷酸序列的密度高于约10f摩尔，优选约100f摩尔/厘米2固体支持物表面。标准产品可以是低密度或高密度阵列。低密度阵列利用带有有限数目捕获分子的标准产品，该有限数目针对于有限的和选定的靶分子数目。本发明的微阵列和标准产品每cm2含有至少5，10，50，100，1000或10000个捕获分子的点样。
除通过第一组捕获分子检测靶分子之外，本发明微阵列能够应用户的要求适应性地检测额外靶分子。因此本发明相同的阵列能够用于检测大量不同靶分子，可能的待检测靶分子数目可以比存在的捕获分子数目大至少10，20，50，100乃至500倍。
本发明进一步提供定制该标准产品必需的及随后的检测、鉴定和/或定量必需的工具和试剂。例如本发明还可涉及用于安全地识别及特异性结合靶分子(3)(可能存在于生物样品或试验溶液中)的上述衔接分子(5)，还涉及第二组(B)捕获分子(4)，其不能直接结合存在于样品中的所述靶分子(3)。
第二组(B)捕获分子(4)不具有互补于待检测靶分子(3)的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列。
在正常工作条件下，如果存在的是优选小于10个连续的互补碱基或通常小于15个互补碱基，这些多核苷酸或核苷酸序列靶分子(3)不会与捕获分子(4)结合。在靶分子和全能性捕获分子之间优选小于5，更优选小于3个互补碱基对。最优选在靶多核苷酸或核苷酸序列和该全能性捕获分子之间根本没有互补碱基对。本领域技术人员公知杂交是通过两个序列的同源性或相似性百分比定义的，进一步通过所用的杂交条件(如严格，较少严格或非严格条件)定义，该条件主要依赖于温度和盐浓度。
本发明的一个实施方案涉及可定制的微阵列及其构建，从同一个标准产品开始，一方面用于检测相同且确定的靶分子，另一方面用于检测非确定且可变的靶分子。
在本发明的一个实施方案中，上述衔接分子(5)含有与待鉴定靶分子(3)或其互补序列互补的至少30个连续核苷酸序列(10)，也称为衔接分子的靶特异性部分，还含有对全能性捕获分子(4)特异的至少30个连续核苷酸的序列(11)，所述全能性捕获分子将要检测和/或间接定量靶分子，该序列也称为衔接分子的靶非特异性或靶不相关部分。
在另一实施方案中，衔接分子的靶特异性部分(10)由50或70个以上的碱基构成，甚至100或150个以上的碱基构成。
在本发明的一个优选实施方案中，捕获分子(4)被衔接分子(5)识别的部分存在于捕获分子(4)的末端(未与固体支持物表面(6)结合的那一端)或至少靠近该端。优选不过于靠近捕获分子(4)的另一部分或末端，通过该部分或末端捕获分子(4)附着于固体支持物表面(6)。
在本发明的另一实施方案中，全能性捕获分子(4)含有被衔接分子(5)识别的一个序列以及不能被衔接分子(5)和靶分子(3)识别的一个序列。优选后者是至少约20或30个碱基的间隔序列，优选至少约50或70个碱基，更优选至少约100或150个碱基长，或包括在所述参数之间的序列。
在一个优选实施方案中，通过与全能性捕获分子(4)结合的特异性衔接分子(5)而实现的与靶分子的间接结合效率等同于与存在于标准微阵列产物(7)上的第一组(A)特异性捕获分子(2)的直接结合效率。在本发明的另一具体实施方案中，可以调整加入样品溶液的衔接分子(5)的数量以便使两个组(A，B)具有相同或类似的靶分子(1，3)结合效率，即对靶分子(1，3)的直接和间接结合。
在另一具体实施方案中，存在于样品中的靶分子(1，3)的定量是利用校正完成的，该校正通过使用内部特定已知标准序列，该标准序列加入到样品中的数量是具体已知的。这些序列分子中的一些是通过与第一组(A)捕获分子(2)直接结合进行检测，而其它序列是通过利用上述衔接分子(5)间接地进行检测，两种结合类型可通过各组(A，B)不同的系数进行校正。
在本发明的一个特定具体实施方案中，同一内标物将会通过直接杂交被第一组(A)捕获分子捕获，而通过利用衔接分子(5)被第二组全能性捕获分子捕获。
在另一具体实施方案中，两组靶分子杂交效率的修正系数是通过利用两组捕获分子中检测的至少1种，优选至少3种共同靶分子而获得。在另一优选具体实施方案中，选择的所述3种共同靶分子是以高，中和低的基因拷贝数存在于样品中。这种基因相对数量的差异至少是3倍(factor)，优选10或更多倍。
在一个具体实施方案中，同一组的一个分子与另一分子的校正系数各不不同。一个亚组(subset)分子的校正系数相同，但与同一组的另一分子亚组的校正系数不同。在一个特定具体实施方案中，分子根据浓度被区分为不同的亚组，适用的校正系数各不相同。
像基因或其产物(mRNA或蛋白质)等存在于样品中的靶分子的定量最好通过利用阵列扫描器中的3种不同扫描设置(settings)完成(如用于光电倍增管的Packard阵列扫描器设置是50，70和100)。利用3种设置和以不同数量存在的3种靶或3种内标物能够校正3种不同扫描设置中的两组靶分子的结合效率。
根据本发明的一个具体实施方案，捕获分子(4)通过衔接分子(5)对靶分子(3)的间接结合效率类似或相同于至少约100或150，更优选至少约200或300，更优选至少约400或500个碱基长度的捕获分子(2)对靶分子(1)的直接结合效率。
在本发明的一个具体实施方案中，微阵列含有至少约100或150个碱基长度的捕获分子(2)，更优选至少约200或300个碱基，最优选至少约400或500个碱基，用于直接捕获生物样品或试验溶液中的待检测靶分子(1)。
在另一具体实施方案中，两组(A，B)捕获分子由附着于支持物表面的至少约20或30个碱基长度，优选至少约50或70个碱基长度，更优选约100或150个碱基长度的非特异性或不相关的序列(间隔序列)和在其末端的待检测(直接结合的情况)靶分子(1)或靶序列特异的序列或者衔接分子(5)(间接结合的情况)特异的序列组成。捕获分子的特异性或衔接子特异性部分(11)至少为10或15个碱基长，更优选大于约20或30，更优选大于约40或50个碱基长。能够与相应靶核苷酸序列杂交的捕获核苷酸序列(2)的特异性序列长度可以由约10到约60个碱基组成，更优选约20到约30个碱基。本文中“约”是指可能比提到的数目多或少1，2，3直至5个核苷酸。
在本发明的一个特定具体实施方案中，第二组(B)捕获分子是通过PCR合成，利用一个公共(common)序列作为模板。一个引物具有一个浮动序列(floating sequence)，各捕获序列的浮动序列均不相同，用于识别衔接分子(5)。
本发明的阵列或微阵列(7，7′，7″)非常适于检测和/或定量由细胞表达的基因，可能是靶基因序列复制后至少部分地变成cDNA链而cDNA杂交到本发明提供的特异性捕获分子上。
本发明的方法特别适于检测彼此同源的序列。通过利用小或短的特异性序列可以鉴别同源或几乎相同的序列。例如，用于鉴别同源靶核苷酸序列(1)的第一组(A)捕获分子或衔接分子(5)的靶特异性部分可以在约15到约50个碱基长。同源性的百分比优选高于约40％或50％，优选高于约60％，65％或70％，更优选高于约75％，80％，85％或90％。
本发明的方法甚至可以辨别仅有一个或数个核苷酸差异并因此含有一个或数个SNPs(单核苷酸多态性)的靶序列。
本发明的方法和阵列的优点在于能够用于鉴定和/或定量DNA序列，单或双链序列，所述序列可直接获自生物体或其部分——即无需预先扩增步骤——，或者也可在基因组DNA或RNA部分扩增之后获得。靶序列的扩增可通过本领域任何公知方法实现，包括但不限于PCR，LCR，NASBA，滚动循环(rolling circle)或可以产生相当可靠地复制指定序列的任何其它方法。在遗传学扩增方法中可以使用一种或多种(PCR)引物或引物组。引物可以是通用引物，共有序列引物(consensusprimers)和/或类型-特异性引物。本发明的试剂盒可以包括各容器(chamber)，在其中检测是否存在(微)生物体的任一扩增序列，遗传学扩增是在同一个容器内完成的。可以通过本发明试剂盒进行来自所述(微)生物体的靶核苷酸序列的遗传学扩增方法。
扩增的核苷酸序列可以是最初被反转录为cDNA的mRNA，可以利用相同引物对进行反转录和扩增。
在遗传学扩增循环及其后在阵列上的鉴定过程中可能首先检测到是否存在任何扩增序列。
在微阵列上捕获的靶分子可通过任何本领域公知的物理或化学检测方法进行检测，包括但不限于利用荧光标记，比色法，生物发光，化学发光，电，表面胞质基因共振(surface plasmon resonance)，电磁信号等。由于捕获分子与固体支持物上定义明确的位置相连，因此放大了捕获或杂交信号的阅读和解释。
用于构建本发明微阵列的(不溶的)固体支持物或基质优选选自玻璃，电子器件，硅支持物，硅石，金属或其混合物，是以载玻片，盘状物，凝胶层和/或珠粒形式制备。珠粒可以形成阵列，只要它们具有某些能够彼此区分的特征，以便将珠粒的鉴定与指定捕获分子的鉴定相联系，从而鉴定靶序列。上述实例并非穷举性的。
在本发明的一个具体实施方案中，利用包含至少检测和/或定量装置的仪器，用于检测和/或定量靶分子或来自(微)生物体的组分在阵列上被捕获的位置形成的信号，可以促进被捕获的靶序列的检测，鉴定和/或定量，该装置可以是一个读数装置，用于阅读在所述固体支持物表面记录的信息，或一个计算机程序，用于识别带有与相应捕获分子结合的靶分子的离散区域及其位置，可以是该位置存在的信号的一个定量程序，以及将在这些位置上存在的信号与所述(微)生物体或组分的诊断和/或定量相关联的一个程序。本发明涉及适合于这些目的并能阅读本发明微阵列且解释其结果的仪器。
本发明进一步涉及定制阵列在用于检测、鉴定和/或定量第一和第二组靶分子的生物分子混合物的试剂盒或检测方法中的应用。这些靶分子可属于组分或(微)生物体的不同组、亚组或亚亚组(sub-sub-group)。在本发明的一个具体实施方案中，第一组捕获分子可以对单独的靶组分或其亚组特异，而第二组则对该组的所有组分特异，或反之亦然。
本发明的方法和试剂盒可用于检测任一种(微)生物体或其任一组分。(微)生物体及其组分的实例包括但不限于选自下列的葡萄球菌种S.aureus，S.epidermidis，S.saprophyticus，S.hominis和/或S.haemolyticus，属于分枝杆菌属的样品，属于MAGE家族或HLA-A家族的序列，G偶联受体，多巴胺受体，胆碱受体，组胺受体，细胞色素P450家族的成员，GRAM+或GRAM-家族细菌。
可以选择相应于各科，属，种，亚型或个体生物的组，亚组或单个靶分子或靶序列。优选该科，属，种，亚类或个体是细菌，例如葡萄球菌(Staphylococcus)，肠球菌(Enterococcus)，链球菌属(Streptococcus)，haemolyticus，假单胞菌属(Pseudomonas)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)，奈瑟氏菌属(Neisseria)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，西蒙斯菌属(Simonsiella)，Riemerella，埃希杆菌属(Escherichia)，奈瑟菌属(Neisseria)，脑膜炎球菌(Meningococcus)，摩拉克菌属(Moraxella)，金氏杆菌属(Kingella)，色杆菌属(Chromobacterium)及布兰汉氏球菌属(Branhamella)。上述列表并非穷举性的。
实施例实施例1构建具有靶特异性捕获分子和靶非特异性捕获分子的微阵列并通过使用60个碱基的特异衔接分子检测靶分子玻璃支持物的功能化 根据欧洲专利申请EP1184349中描述的方法，利用醛将玻璃载片功能化。
靶特异性(组A)和靶非特异性捕获分子(组B)在支持物上的固定 按照Delongueville等，2002(Biochem，Pharmacol，64137-149)的描述，特异性捕获分子针对59个基因。它们靶向大鼠Hepatochip dualchip中59个毒理学相关的基因(Eppendorf，HamburgGermany)。合成3种靶-不相关捕获分子并点样在阵列上。PCR扩增插入到质粒中的植物克隆序列，合成了这3种捕获分子。通过衔接子而被固定在靶不相关捕获分子上的这3种靶分子是同时固定在3种靶特异性捕获分子上的。由于3种靶分子是在两组捕获分子上同时被定量，因此可校正这些靶分子的定量。
所用的PCR有义引物如下序列1的PALFAS1(SEQ ID NO1)5′-gcatggatgttgctctcgcgtagacgactggatggctagttactgctctg-3′序列2的PALUCP21(SEQ ID NO2)5′-agtacgtcgacagacttagtcctgaagctcgatggctagttactgctctg-3′序列3的PALL191(SEQ ID NO3)5′-ggctgatcatgtactccaaggtttgttatcgatggctagttactgctctg-3′有义引物在5′末端(黑体)包含30个浮动碱基(floating bases)，后面20个碱基是插入物特异的。
3个PCR反应中反义引物是共同的。在5′末端胺化，并是插入物特异的。
PAL2(SEQ ID NO4)5′-胺-atgagtttcaagatttcaacag-3′ 3种捕获分子的序列如下TPALFAS(SEQ ID NO5)5′胺-
atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatccagtcgtctacgcgagagcaacatccatgc-3′TPALUCP2(SEQ ID NO6)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcgagcttcaggactaagtctgtcgacgtact-3′TPALL19(SEQ ID NO7)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcgataacaaaccttggagtacatgatcagcc-3′ 阴性对照由相同长度捕获分子组成，包含30个碱基的随机序列，其不能被存在于溶液中的衔接子识别。
在点样溶液中稀释捕获分子(EAT Namur，Belgium)。使用平针(plain pins)在支持物的空间分离位置上将两组捕获分子点样到一个阵列上。在室温下干燥载玻片1h。用洗涤缓冲液洗涤载玻片2min，共2次，然后用水洗涤3次。在4℃储藏载玻片待用。
在本发明的定制微阵列上检测靶cDNA 用杂交框包围含有第一和第二组捕获分子的支持物表面，该框限定了与含有靶分子的溶液接触的支持物表面的界限。首先用3种不同的合成衔接分子55℃温育阵列30min。该衔接分子是约60个碱基的多核苷酸。它们含有30个互补于捕获分子的碱基和30个互补于靶cDNA序列的碱基。3种靶cDNA是FAS(登录号U03470，并入本文作为参考)，UCP2(登录号AB010743，并入本文作为参考)和L19(登录号J02650，并入本文作为参考)。
3种衔接分子的序列如下
AFAS 30(SEQ ID NO8)5′-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcgcatggatgttgctctcgcgtagacgactg-3′AUCP230(SEQ ID NO9)5′-atgccattgtcaactgtactgagctggtgaagtacgtcgacagacttagtcctgaagctc-3′AL1930(SEQ ID NO10)5′-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtgggctgatcatgtactccaaggtttgttatc-3′互补于捕获分子的序列以黑体表示。
通过化学合成获得衔接分子(Eurogentec，Liege，Belgium)。在温育以后，用SSC2X溶液洗涤阵列。然后按照本文上述(Delongueville等，2002)，用来自大鼠肝脏的生物素化cDNA温育阵列。用生物素化靶cDNA杂交后，用含有0.01％阻断剂的B1缓冲液以1/1000稀释抗青色素抗体(Jackson ImmunoResearch，Cy3ref-200.162.096，Cy5ref-200.172.096)，用其温育阵列。然后用B1缓冲液洗涤生物芯片2min，洗涤4次。在室温下干燥生物芯片并用GMS418 ScanArray(General Scanning)扫描。图像数字化后，使用imagene软件(Biodiscovery，Marina Del Rey，USA)来确定点样表面的界限，整合各点样的信号，去掉各点样附近局部背景，鉴定各点样的定位并将定位与靶分子的鉴定相联系。基本上按照上面(Delongueville等，2002)所述定量样品中存在的靶分子。校正两组的靶分子定量值，以确定其在分析所用的初始样品中的数量。通过使用在两组捕获分子上同时定量的3种共同靶cDNAs(上述FAS，UCP2和L19)进行校正。
实施例2构建具有靶特异性捕获分子和靶非特异性捕获分子的微阵列并通过使用80个碱基的特异性衔接分子检测靶分子 实验按照实施例1进行。用于检测3种靶cDNA的衔接分子是80个碱基的多核苷酸。它们含有30个互补于捕获分子的碱基(黑体)和50个互补于靶cDNA序列的碱基。
3种衔接分子的序列如下AFAS50(SEQ ID NO11)5′-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcagaggcaaagagaaggaactgcatggatgttgctctcgcgtagacgactg-3′AUCP250(SEQ ID NO12)5′-atgccattgtcaactgtactgagctggtgacctatgacctcatcaaagatagtacgtcgacagacttagtcctgaagctc-3′AL1950(SEQ ID NO13)5′-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtggttggaccccaatgaaaccaggctgatcatgtactccaaggtttgttatc-3′实施例3构建具有靶特异性捕获分子和靶非特异性捕获分子的微阵列并通过使用60个碱基的特异性衔接分子检测靶分子和内标物 按照实施例1进行实验，在两组捕获分子上检测3种共同靶分子。本微阵列在组A中还含有3种内部标准特异性捕获分子(RBCL，CAB10B，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶激活酶(rubisco activase))。使用3种额外的靶不相关捕获分子校正杂交效率。它们用来捕获部分互补于内标cDNA的衔接分子。
PCR扩增来自被插入到质粒中的植物克隆序列，合成了这3种新的靶不相关捕获分子。引物5′末端的30个碱基的浮动序列不同于 使用了以下有义引物
序列1的PALRBCL1(SEQ ID NO14)5′-tctgttcccttacgactcgataagagctctgatggctagttactgctctg-3′序列2的PALCAB1(SEQ ID NO15)5′-actcttgctgaggctattcaaggcggcatcgatggctagttactgctctg-3′序列3的PALRUBI1(SEQ ID NO16)5′-atacagttcaatcgccgagtctacgcggtagatggctagttactgctctg-3′ 同样，有义引物在5′末端(黑体)包含30个浮动碱基(floating bases)，后面20个碱基是插入特异性的。
反义引物同实施例1(SEQ ID NO4)。
用于3种内标物的3种捕获分子序列如下TPALRBCL(SEQ ID NO17)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcagagctcttatcgagtcgtaagggaacaga-3′TPALCAB(SEQ ID NO18)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcgatgccgccttgaatagcctcagcaagagt-3′TPALRUBI(SEQ ID NO19)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatctaccgcgtagactcggcgattgaactgtat-3′ 3种内标物cDNA是RBCL(登录号L14403，并入本文作为参考)，CAB10B(登录号M32606，并入本文作为参考)和Lycopersiconpennellii核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶激活酶(登录号AF037361，并入本文作为参考)。
用于3种内标物的3种衔接分子序列如下ARBCL30(SEQ ID NO20)5′-gtagcttaccctttagacctttttgaagaatctgttcccttacgactcgataagagctct-3′ACAB30(SEQ ID NO21)5′-ccaccacatctgctactgcagtgctgaatgactcttgctgaggctattcaaggcggcatc-3′ARUBI 30(SEQ ID NO22)5′-gacggcttctacattgcccctgctttcatgatacagttcaatcgccgagtctacgcggta-3′3种内标物是以1000ng(AB)，100ng(RBCL)和30ng(RCA)的浓度加入。以3个扫描器设置计算两组捕获分子的相对结合效率，并用于校正两组捕获分子中靶分子的检测值。校正是在针对定量是线性的基因的各扫描器设置下进行。
互补于捕获分子的衔接分子部分以黑体表示。
通过化学合成获得衔接分子。其余方面，实验是按照实施例1进行，在内标物捕获分子上获得的信号用于校正靶特异性和靶非特异性捕获分子之间的杂交效率。
序列表<110>Eppendorf AG<120>专门的微阵列构建及其用于靶分子检测的用途<130>BP.EAT.004A/EP<140>EP04447112.6<141>2004-05-04<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALFAS1有义引物<400>1gcatggatgt tgctctcgcg tagacgactg gatggctagt tactgctctg 50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALUCP21有义引物<400>2agtacgtcga cagacttagt cctgaagctc gatggctagt tactgctctg 50<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PALL191有义引物<400>3ggctgatcat gtactccaag gtttgttatc gatggctagt tactgctctg50<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PAL2反义引物<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>4atgagtttca agatttcaac ag 22<210>5<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALFAS捕获分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>5atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120
tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc cagtcgtcta cgcgagagca acatccatgc 220<210>6<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALUCP2捕获分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>6atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc gagcttcagg actaagtctg tcgacgtact 220<210>7<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALL19捕获分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>7
atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc gataacaaac cttggagtac atgatcagcc 220<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFAS30街接分子<400>8ataaagtttt gggctgctgt gtggcaatgc gcatggatgt tgctctcgcg tagacgactg 60<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AUCP230街接分子<400>9atgccattgt caactgtact gagctggtga agtacgtcga cagacttagt cctgaagctc 60<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AL1930街接分子<400>10cgtcctccgc tgtggtaaaa agaaggtgtg ggctgatcat gtactccaag gtttgttatc 60
<210>11<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFAS50街接分子<400>11ataaagtttt gggctgctgt gtggcaatgc agaggcaaag agaaggaact gcatggatgt60tgctctcgcg tagacgactg80<210>12<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AUCP250街接分子<400>12atgccattgt caactgtact gagctggtga cctatgacct catcaaagat agtacgtcga 60cagacttagt cctgaagctc 80<210>13<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AL1950街接分子<400>13cgtcctccgc tgtggtaaaa agaaggtgtg gttggacccc aatgaaacca ggctgatcat60gtactccaag gtttgttatc80<210>14
<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALRBCL1有义引物<400>14tctgttccct tacgactcga taagagctct gatggctagt tactgctctg 50<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALCAB1有义引物<400>15actcttgctg aggctattca aggcggcatc gatggctagt tactgctctg 50<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALRUBI1有义引物<400>16atacagttca atcgccgagt ctacgcggta gatggctagt tactgctctg 50<210>17<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALRBCL捕获分子
<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>17atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc agagctctta tcgagtcgta agggaacaga 220<210>18<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALCAB捕获分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>18atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc gatgccgccttgaatagcct cagcaagagt 220<210>19<211>220<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>TPALRUBI捕获分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>19atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc taccgcgtag actcggcgat tgaactgtat 220<210>20<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ARBCL30街接分子<400>20gtagcttacc ctttagacct ttttgaagaa tctgttccct tacgactcga taagagctct 60<210>21<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ACAB30街接分子<400>21ccaccacatc tgctactgca gtgctgaatg actcttgctg aggctattca aggcggcatc 60<210>22
<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ARUBI30街接分子<400>22gacggcttct acattgcccc tgctttcatg atacagttca atcgccgagt ctacgcggta60
权利要求
1.在(微)阵列固体支持物表面(6)上检测和定量可能同时存在于生物样品中的第一组和第二组靶分子(1，3)的方法，所述(微)阵列(7)含有存在于固体支持物表面(6)不同位置(8，9)的第一组(A)和第二组(B)捕获分子(2，4)，其中第一组捕获分子(A)由对第一组靶分子(1)呈特异性的至少3种捕获分子(2)组成并通过特异性分子识别作用直接固定第一组靶分子(1)，其中第二组捕获分子(B)由和第二组靶分子(3)不相关并没有直接结合亲合性的至少3种捕获分子(4)组成，第二组捕获分子(B)能够通过衔接分子(5)固定第二组靶分子(3)，其中第一组靶分子(1)相对于第二组靶分子(3)的相对定量是通过一个校正系数获得，该校正系数通过使用在两组(A，B)捕获分子(2，4)上同时定量的至少一个相同的分子(x)计算得到。
2.权利要求1的方法，其中属于一组的靶分子的相对定量被划分为至少2个靶分子亚组，并根据不同校正系数校正。
3.权利要求1的方法，其中属于一组的靶分子被划分为至少2个靶分子亚组，通过不同检测扫描器设置定量。
4.权利要求2的方法，其中靶分子的亚组相应于靶分子的不同浓度。
5.在前任一权利要求的方法，其中属于第一组或第二组靶分子的靶分子(1，3)的检测是定量的，其中所述定量检测通过一个校正系数校正，该校正系数允许类似地和同步地定量所有起初存在于样品中并被固定在相应捕获分子上的靶分子。
6.权利要求5的方法，其中通过检测至少一个被加到样品中并接受与靶分子相同的检测步骤的已知浓度的标准分子来校正定量的检测。
7.权利要求5的方法，其中在两组(A，B)捕获分子(2，4)上检测至少一个靶分子。
8.权利要求6或7的方法，其中通过在两组(A，B)中定量检测靶分子和/或标准分子来校正靶分子(1，3)在两组(A，B)捕获分子(2，4)上的固定效率。
9.权利要求1的方法，其中第二组(B)捕获分子(4)是全能性捕获分子。
10.在前任一权利要求的方法，其中检测是在存在于固体支持物表面(6)上的至少两个阵列(7′，7″)上进行；其中所述至少两个阵列(7′，7″)包含第一组(A)捕获分子(2)用于检测同一靶分子(1)；以及各阵列含有不同亚组(B，B′)的捕获分子(4，4′)，用于检测一个阵列(7′)与另一阵列(7″)之间不同的靶分子(3，3′)。
11.在前权利要求1到10任一项的方法，其中靶分子(3)固定到第二组(B)捕获分子(4)是通过用户向捕获分子加入衔接分子(5)完成。
12.在前任一权利要求的方法，其中靶分子、捕获分子和衔接分子是核苷酸序列。
13.权利要求12的方法，其中靶分子(3)固定到第二亚组(B)捕获分子(4)是通过在捕获分子(4)和靶分子(3)之间通过衔接分子(5)进行夹心杂交而完成。
14.权利要求13的方法，其中衔接分子(5)含有第一部分(11)，该部分可通过互补碱基配对与捕获分子(4)的特异性末端部分杂交，其中衔接分子(5)还含有第二部分(10)，该部分对一种或多种靶分子(3)的至少一部分是特异的。
15.权利要求1到11任一项的方法，其中靶分子和捕获分子是蛋白质，其中衔接分子是嵌合的蛋白质或杂合抗体。
16.权利要求1到11任一项的方法，其中靶分子和捕获分子分别是抗原和抗体(或者所述抗体的高变的部分)或，抗体(或者所述抗体的高变的部分)和抗原。
17.在前任一权利要求的方法，其中第二组(B)捕获分子(4)包含能够特异性结合衔接分子(5)的末端反应性化学官能团。
18.权利要求17的方法，其中所述末端反应性化学官能团选自醛基、环氧基、丙烯酸根/盐/酯基团，或是其混合物。
19.一种检测和定量试剂盒，其含有-具有一个表面(6)的固体支持物，该表面含有至少两组(A，B)捕获分子(2，4)，这两组捕获分子存在于所述固体支持物表面(6)的不同位置(8，9)，-其中位于第一位置(8)的第一组(A)捕获分子含有至少3种对样品中待检测和定量的第一组靶分子(1)特异的不同捕获分子(2)，所述捕获分子能够直接固定靶分子(1)，-其中位于第二位置(9)的第二组(B)捕获分子具有至少3种与待检测和定量的第二组靶分子(3)不相关且不具备直接结合亲合性以固定靶分子(3)的捕获分子(4)，和-一种或多种能够将第二组靶分子(3)结合到第二组(B)捕获分子(4)上的衔接分子(5)，-用于获得第一组靶分子(1)相对于第二组靶分子(3)的相对定量的可能手段和信息。
20.权利要求19的检测和定量试剂盒，其中用于获得相对定量的手段是一种将要随靶分子(1，3)加入样品中并接受相同检测步骤的标准分子。
21.权利要求19或20的试剂盒，其中第二组(B)捕获分子(4)是全能性捕获分子。
22.在前权利要求19到21任一项的试剂盒，其中固体支持物表面(6)含有至少两个阵列(7′，7″)，其中所述阵列包含第一组(A)捕获分子(2)，用于检测同一靶分子(1)，各阵列(7′，7″)还含有不同组(B，B′)捕获分子(4，4′)，用于检测一个阵列(7′)与另一阵列(7”)之间不同的靶分子(3，3′)。
23.在前权利要求19到22任一项的试剂盒，其中靶分子，捕获分子和衔接分子是核苷酸序列。
24.权利要求19到22任一项的试剂盒，其中靶分子和捕获分子是蛋白质，其中衔接分子是嵌合的蛋白质或杂合抗体。
25.在前权利要求19到22任一项的试剂盒，其中靶分子和捕获分子分别是-抗原和抗体(或者所述抗体的高变的部分)；或-抗体(或者所述抗体的高变的部分)和抗原。
26.权利要求23的试剂盒，其中捕获分子(4)结合到靶分子(3)是通过在捕获分子(4)，靶分子(3)和衔接分子(5)之间进行夹心杂交而完成。
27.权利要求26的试剂盒，其中衔接分子(5)含有第一部分(11)，该部分可通过互补碱基配对与捕获分子(4)的特异性末端部分杂交，其中衔接分子含有第二部分(10)，该部分对一种或多种靶分子(3)的至少一部分特异。
28.在前权利要求19到27任一项的试剂盒，其中第二组(B)捕获分子(4)包含能够特异性结合衔接分子(5)的末端反应性化学官能团。
29.权利要求28的试剂盒，其中所述末端反应性化学官能团选自醛基、环氧基和丙烯酸根/酯/盐基团，或是其混合物。
全文摘要
本发明涉及可能同时存在于一种生物样品内的不同组靶分子(1，3)的检测和定量方法，该方法利用存在于固体支持物表面(6)的微阵列，该微阵列含有不同组(A，B)的捕获分子(2，4)，这两组捕获分子存在于固体支持物表面(6)的不同位置(8，9)。
文档编号C12Q1/68GK1693481SQ20051005622
公开日2005年11月9日 申请日期2005年3月31日 优先权日2004年5月4日
发明者乔斯·勒马克勒, 拉斯－埃里克·彼得斯, 康拉德·拜罗伊特 申请人:埃佩多夫股份公司