专利名称：核酸提取方法
技术领域：
本发明涉及从细胞中提取核酸的核酸提取方法。
背景技术：
为了提取核酸，需要破坏(溶解)细胞的膜结构，从而使细胞的内容物释放到细胞夕卜。微生物被认为是细菌、古细菌、原生生物、真菌类等一般为显微级大小以下的生物。它们各自的特征不同，在细菌中，根据细胞的膜结构的差异，大致分为大肠杆菌等革兰氏阴性菌、枯草杆菌等革兰氏阳性菌。例如，与革兰氏阴性菌的细胞壁相比，革兰氏阳性菌的细胞壁中肽聚糖层更厚且密度更高。另外，对念珠菌等真菌而言，细胞壁的主成分为葡聚糖及壳多糖，与上述细菌的组成不同。由此，在利用酶·化学细胞溶解法的情况下，需采用针对该对象的方案(protocol)。特别是在使用酶的情况下，存在着对于细菌多使用溶菌酶、对于真菌则多使用酵母裂解酶这样的差异。另外，即使在革兰氏阳性菌中，关于金黄色葡萄球菌，溶葡球菌酶也是有效的，因此多被使用。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特许第3866762号公报专利文献2 :日本特公平07-002120号公报
发明内容
发明要解决的课题酶·化学细胞溶解法广泛用于市售的核酸提取试剂盒。但是，在将核酸提取试剂盒中从细胞的溶解至核酸提取的总处理时间与其中细胞溶解的处理时间进行比较时，在许多试剂盒中，细胞的溶解占用了大部分的处理时间。另外，存在着试剂的添加或搅拌等多个工序，比较麻烦。因此，在传染病的防疫对策、生物恐怖袭击应对措施等要求迅速检测的情况下，特别要求缩短处理时间。另外，如上所述，在酶 化学细胞溶解法中，方案各不相同，需要根据细胞的种类而变更酶或方案，比较麻烦。特别是在检查含有未知微生物的试样的情况下，需要对多个方案进行试验。进而，虽然可得到长链的核酸，但酶的反应时间较长，缺乏迅速性。因此，酶 化学细胞溶解法不适于要求迅速性的应用。本发明的目的在于提供一种可适于比较广泛的微生物并且可迅速地提取核酸的核酸提取方法。解决课题的手段本发明的核酸提取方法为一种从细胞中提取核酸的核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括将细胞悬浮液加入容器中的工序；将所述容器密闭的工序；在所述容器密闭的状态下将容纳在所述容器中的所述细胞悬浮液加热至100°c以上的规定最高温度的工序。
根据该核酸提取方法，通过在容器密闭的状态下将细胞悬浮液加热至100°C以上的规定最高温度，由此可以迅速地提取核酸。
在所述加热工序中，加热所述容器的时间可以低于120秒。所述细胞为革兰氏阴性菌，所述规定最高温度可以为105°C以上且125°C以下。所述细胞为革兰氏阳性菌，所述规定最高温度可以为125°C以上且160°C以下。所述细胞为真菌，所述规定最高温度可以为125°C以上且160°C以下。还可以包括在保持所述容器的密闭状态下将已被加热至所述规定最高温度的所述细胞悬浮液冷却的工序。还可以包括在内压为大气压以上的状态下打开经过所述加热工序的容器的工序。还可以包括将已被加热至所述规定最高温度的所述细胞悬浮液冷却后再加热的工序。还可以包括向所述细胞悬浮液中混合细胞溶解促进剂的工序。在将所述容器密闭的工序中，可以在所述容器内没有气体的状态下密闭所述容器。在将所述容器密闭的工序中，可以将比所述容器内的所述细胞悬浮液的沸点更高的溶剂密闭在所述容器内。所述加热工序可以由将加热部预热至100°C以上的设定温度的工序以及使所述容器与已达到所述设定温度的所述加热部接触的工序构成。发明效果根据本发明的核酸提取方法，通过在容器密闭的状态下将细胞悬浮液加热至100°C以上的规定最高温度，由此可迅速地提取核酸。附图
简要说明图I是示出使容器与加热装置的加热部接触的时间和用数据记录器所测量的容器内的溶液温度之间的关系的图；图2是示出对大肠杆菌加热时的最高处理温度与DNA检测值之间的关系的图；图3是示出对大肠杆菌的加热时间与DNA检测值之间的关系的图；图4是示出对念珠菌加热时的最高处理温度与DNA检测值之间的关系的图；图5是示出经过加热条件不同的加热工序后的念珠菌细胞的图像的图；图6是比较通过对念珠菌进行的各处理所产生的DNA提取效果的图；图7是示出在不同的细胞溶解促进剂(表面活性剂)中对念珠菌进行高温加热处理的DNA提取效果的图。
具体实施例方式以下对本发明的核酸提取方法的一个实施方案进行说明。实施例I以下，作为实施例I，对细胞悬浮液的加热条件与细胞悬浮液的温度变化之间的关系的实验进行说明。作为容纳细胞悬浮液的容器，可使用具有用于密闭的机械结构的锁式微量离心管(> 口:y夕夕4 十工一 ■/ )(容量o.6ml)。另外，作为用于加热的装置，可使用油浴(温度范围室温 200°C)。另外，为了实施实验以及本发明而使用的装置并不限定于此。以下对实验的步骤进行说明。(步骤I)在容器中设置热电偶，同时以在容器内没有气体层部分的方式将细胞悬浮液与20μ I的加入缓冲液(20mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)、2%TritonX-IOO (商品名))一起加入。进而，使用机械结构密闭容器。在此，所谓“加入缓冲液”是为了使核酸提取稳定化及效率化而使用的，Tris-HCl是用于抑制溶液的PH值变动、并稳定地保持所提取的核酸的缓冲液。另外，TritonX-IOO是以(C14H22O(C2H4O)n)为组成的SIGMA公司制的聚合物，其是作为细胞溶解促进剂而添加的表面活性剂。(步骤2)将加热装置预热至设定温度。(步骤3)使容器与加热装置的加热部(例如，油浴中的油)接触30秒以进行加热。(步骤4)使容器从加热装置的加热部脱离。(步骤5)用与热电偶连接的数据记录器测量加热过程中及加热后的细胞悬浮液的温度变化。图I是示出通过重复以上的步骤而测量的温度变化的图。在图I的图表中，横轴表示使容器与加热装置的加热部接触的时间，纵轴表示用数据记录器测量的温度。另外，分别在加热部温度为95°C、105°C、115°C、125°C、135°C、或者145°C的情况下测量温度。如图I所示，通过将加热部的温度设为115°C左右以上，可迅速地将细胞悬浮液加热至100°C以上的温度。另外，如加热开始30秒后的温度变化所示的那样，可以发现从加热部的脱离引起温度急剧下降。实施例2接着，作为实施例2，对从大肠杆菌中提取DNA时的最高处理温度与提取量之间的关系进行说明。以下，对为了得到来自大肠杆菌的DNA提取结果而进行的实验的步骤进行描述。(步骤I)将大肠杆菌DH-5α株在LB培养基中培养I晚。(步骤2)分别等量地混合大肠杆菌培养液和2倍浓度的加入缓冲液(40mMTriS-HCU4% TritonX-100)，作为样品。(步骤3)将20μI样品加入到容器中，并将容器密闭。(步骤4)使容器与已预热的加热装置的加热部接触，加热30秒。(步骤5)使容器从加热部脱离。(步骤6)从容器中取出加热后的样品，转移到试管中。(步骤7)使加入有样品的试管在15300Xg下离心分离10分钟。(步骤8)在不吸入沉淀的未破碎菌体或残渣的条件下，将上清液转移到新的试管中。 (步骤9)使用可扩增的引物，对大肠杆菌基因组DNA中存在的gyrB基因进行实时PCR0用扩增长度不同的4种(64、180、409、896bp)的引物组来评价同一样品。
(步骤10)通过三次重复实验，求得平均值及标准偏差。(步骤11)横轴上取基于实施例I的实验结果和加热装置的预热温度而确定的加热时的最高处理温度，纵轴上绘制通过实时PCR算出的样品中所提取的可PCR的DNA量(检测值)。误差条采用标准偏差。图2是示出通过上述步骤11而得到的图表的图。如图2所示，通过最高处理温度为100°C以上的加热处理，检测值增大，在约115°C下为最大值。在该温度以上的高温下，检 测值减少。据认为，在处理温度过高的情况下DNA发生片断化，一部分不能发挥作为PCR扩增模板的作用。如图2所示，在4种(64、180、409、896bp)中，使用任一个扩增长度的引物组进行评价时均显示大体相同的趋势，在105°C 125°C左右的最高处理温度下，可得到较高的检测值。实施例3接着，作为实施例3，对从大肠杆菌中提取DNA时的加热处理时间与提取量之间的关系进行说明。以下对实验的步骤进行描述。(步骤I)按与实施例2同样的方法制备样品。(步骤2)将加热装置预热至125°C。其与实施例2所示的实验中，加热30秒时DNA的提取量为最大的条件相同。(步骤3)使容器与加热装置的加热部接触，进行一定时间(O 300秒)的加热。(步骤4)使容器从加热部脱离，并将样品加入到新的试管中。(步骤5)使加入有样品的试管在15300Xg下离心分离10分钟。(步骤6)在不吸入沉淀的未破碎菌体或残渣的条件下，将上清液转移到新的试管中。(步骤7)使用可扩增引物，对大肠杆菌基因组DNA中存在的gyrB基因进行实时PCR0用扩增长度180bp的引物组来评价同一样品。图3是示出步骤3中的加热时间和步骤7中得到的DNA量(检测值)之间的关系的图，横轴表示加热时间，纵轴表示检测值。如图3所示，可以确认通过约30秒的处理，可有效地提取可PCR扩增的基因组DNA。但是，由于长时间的加热处理，DNA发生分解，难以进行PCR扩增。根据图3，据认为加热时间最优选30秒左右，但是在将“检测值=2”设为阀值时，优选15秒以上且低于120秒的处理。实施例4接着，作为实施例4，对从念珠菌中提取DNA的实验进行说明。实验的步骤如下所示。(步骤I)将念珠菌在GP培养基中培养15小时。(步骤2)分别等量地混合念珠菌培养液和2倍浓度的加入缓冲液(40mMTriS-HCU4% TritonX-100)，作为样品。(步骤3)将20μ I样品加入到容器中。(步骤4)使容器与已预热的加热装置的加热部接触，加热30秒。(步骤5)使容器从加热部脱离。
(步骤6)从容器中取出加热后的样品，转移到试管中。(步骤7)使加入有样品的试验管在2000Xg下离心分离3分钟。(步骤8)在不吸入沉淀的未破碎菌体或残渣的条件下，将上清液转移到新的试管中。(步骤9)使用可用112bP扩增的引物，对念珠菌基因组DNA中存在的T0P2基因进行实时PCR。(步骤10)对进行了杀菌处理(80°C、加热20分钟)或高压灭菌处理(121°C、15分钟)的样品也进行离心分离，并进行上清液的实时PCR测定。杀菌处理基于“Rapidsimultaneous detection and identification of sixspecies Candida using polymerase chain reaction and reverse line hybridizationassay”(J Microbiol Methods. 2007May, 69 (2) :282_7” 来进行设定。图4为这样的图横轴取基于实施例I的实验结果和加热装置的预热温度而确定的加热时的最高处理温度，纵轴上描绘的是通过实时PCR算出的样品中所提取的可PCR的DNA量(检测值)。误差条采用标准偏差。如图4所示，可以发现在最高处理温度为100°C以上的范围内，DNA提取量增加，并且在130°C以上的条件下可有效地提取。从进行了杀菌处理或高压灭菌处理的样品中未检测到DNA。实施例5接着，作为实施例5，对采用本发明提取DNA的情况与进行杀菌处理的情况的比较实验进行说明。如图4所示，在上述实施例4中，在95°C时DNA未被提取，在132°C的处理时，可有效地提取DNA。作为与本发明中的DNA提取相类似的处理，已知有杀菌处理。例如，作为杀菌的条件，可采用在80°C下加热20分钟等。但是，仅满足该杀菌条件并不能提取DNA。为了显示这些，进行以下的实验。实验中，在明视野及激发光照射下，利用光学显微镜对使用溴乙啡锭二聚体进行染色的各处理后的念珠菌进行观察，并对摄影图像进行比较，其中所述溴乙啡锭二聚体是活细胞不被染色、死细胞可被染色的荧光试剂。图5是示出经过实施例4中进行的处理(最高处理温度25°C、95°C及132°C )、杀菌处理、以及高压灭菌处理后的光学图像及荧光图像的图。另外，图6是比较通过各处理而产生的DNA提取效果的图。如图5所示，实施例4中在25°C下进行处理时未检测到荧光，可以确认念珠菌未死亡。另一方面，95°C时观察到荧光，可以确认杀菌。同样地在133°C下也确认存在荧光。另外，如图6所示，由杀菌处理及高压灭菌处理后的样品显示出与未进行加热的样品(例如，实施例4中的25°C下的处理)相同的检测值，可以确认DNA几乎未被提取。如上所示，即使在杀菌的条件下，也不一定提取DNA。实施例6接着，作为实施例6，对组合使用作为细胞溶解促进剂的表面活性剂SDS (十二烷基硫酸纳)广生的提取效率的提闻进行说明。
图7是示出在不同的细胞溶解促进剂(表面活性剂)中对念珠菌进行高温加热处理时的DNA提取效果的图。作为向加热前的样品中添加的细胞溶解促进剂，对使用TritonX-100及SDS时的情况进行了比较。如图7所示，作为细胞溶解促进剂，使用SDS时比使用TritonX-100能更有效地从念珠菌中提取DNA。例如，在图7中，在最高处理温度为132°C下进行高温加热处理并且添加有SDS的情况下，检测值为300以上。由此判断，可依据所提取的DNA的用途来选择细胞溶解促进剂。例如，在需要DNA的高灵敏度检测的情况下，在被SDS抑制的酶反应中使用DNA的情况下，可以使用比SDS更温和的表面活性剂TritonX-100。另外，据认为，根据细胞溶解促进剂的溶解能力的强度，DNA提取的最佳处理温度·时间条件不同。与如TritonX-100那样温和的细胞溶解促进剂相比，如SDS这样强的 细胞溶解促进剂可在低温下充分地破坏细胞的膜结构，从而提取DNA。以下对本发明的变形例及应用例进行说明。(高温处理后的降温)作为高温处理后的降温工序，可选择以下的工序。(A-I)保持密闭状态的快速冷却在保持容器的密闭状态下，将加热后的样品在每个容器内用珀尔帖元件等进行快速冷却时，产生热冲击，从而提高了细胞破碎效率，因此提高了核酸提取率。这对革兰氏阳性菌或真菌等具有坚固结构的细胞是有效的方法。(A-2)保持密闭状态的自然冷却在保持容器的密闭状态下，将加热后的样品自然冷却时，由于未施加热冲击，因此，可在抑制对核酸损伤的状态下提取核酸。该方法可以提取长链的核酸，因此在需要较长的PCR扩增产物时是有效的。(密闭状态的打开)作为打开容器的密闭状态的时机，可以选择以下的时机。(B-I)在100°C以上的高温保持状态下实施在加热后的容器为100°C以上的高温期间打开容器的密闭状态时，打开时的内压为大气压以上，从而产生急剧的压力变化。因此，由于产生剪切力，细胞破碎效率提高，从而提高了核酸提取率。这对革兰氏阳性菌或真菌等具有坚固结构的细胞是有效的方法。(B-2)冷却至100°C以下，并且将内压降低至大气压后实施在加热后的容器冷却至100°C以下后打开容器的密闭状态时，打开时未施加剪切力，因此，可以在抑制对核酸损伤的状态下提取核酸。由于可以提取长链的核酸，因此该方法在需要较长的PCR扩增产物时是有效的。(联合使用细胞溶解促进剂)通过使用细胞溶解促进剂，可对革兰氏阳性菌或真菌等具有坚固结构的细胞、或者芽胞、卵囊等成为更牢固状态的细胞有效地进行核酸提取。关于添加细胞溶解促进剂的时机，存在以下时机。(C-I)高温处理前添加在高温处理前向样品中添加细胞溶解促进剂的情况下，通过细胞溶解促进剂削弱了细胞的膜结构，高温处理有效地起作用，从而提高了核酸提取效率。通过在细胞溶解促进剂中进行高温处理，可以有效地发挥其作用。该方法对样品量少、想更可靠地在单一条件下进行提取的情况是有效的。(C-2)高温处理后添加在高温处理后向样品中添加细胞溶解促进剂的情况下，通过高温处理削弱了细胞的膜结构后，可以有效地使溶解促进剂起作用，从而可在短时间内高效地提取核酸。该方法对具有牢固结构的细胞是有效的。作为细胞溶解促进剂，可以举出碱(Na0H、K0H等)、酸(HCUH2SO4等)、酶(蛋白质分解酶蛋白酶K等；多糖分解酶壳多糖酶、溶解酶素、酵母裂解酶等)、表面活性剂(阴离子性SDS等；阳离子性CTAB (溴化十六烷基三甲基铵)等；非离子性Triton-X等；两离子性甜菜碱(具有特定结构的化合物的总称，三甲基甘氨酸等)等)、氧化还原剂(过氧化氢水、β -巯基乙醇、二硫苏糖醇等)、蛋白质变性剂(胍盐酸盐、脲等)、螯合剂(EDTA(乙 二胺四乙酸)等)。也可以混合使用多个上述物质。也可以根据需要加入缓冲液。(经多次高温处理)可以重复多次高温加热(至100°C以上的加热)和冷却工序。该方法特别是对革兰氏阳性菌或真菌等具有坚固结构的细胞是有效的。作为具体的工序，有如下工序。(D-I)高温处理后，实施上述的冷却工序(A-I)，并且再次实施高温处理。至少实施两次加热和冷却工序。(D-2)高温处理后，实施冷却工序(A-2)，并且再次实施高温处理工序。该情况下，也至少实施两次加热和冷却工序。(D-3)高温处理后，实施打开工序(B-I)，并且再次实施高温处理。该情况下，也至少实施两次加热和冷却工序。(反应容器)作为加热时所使用的容器(反应容器)，例如可使用以下的容器。(E-I)反应用塑料管(E-2)可热熔融的袋子(E-3)玻璃试管(E-4)微全分析系统芯片(利用液体的完全填充)通过控制容器内的状态，可以谋求向高温加压状态的迅速转变。具体而言，有以下的方法。(F-I)以不在容器中残留气泡或气层等的方式，加入细胞悬浮液，并密闭。之后，移至加热工序。(F-2)对相对于容器的内容积而言较少的细胞悬浮液，通过在气层部分中层叠矿物油等高沸点溶剂，可以提高密闭性。该情况下，也在容器密闭后移至加热工序。此时，在气相部分中充满蒸气，达到饱和蒸气压后，进行沸点以上的加热。因此，容器内可更迅速地被加压，从而可以形成100°c以上的高温。(容器的机械封闭)通过采用机械方式来封闭容器，可防止在容器的内压上升时密闭状态被解除。由此，可以稳定地实施加热处理。(G-I)作为机械密闭的例子，有用与容器对应的形状的部件扣住的方法(固定)。
(适于革兰氏阴性菌的条件)(H-I)作为适合于革兰氏阴性菌的加热条件的一个例子，可以举出满足加热时间为15秒以上且低于2分钟、并且最高处理温度为105°C以上且125°C以下的条件(参照图2)。(适于革兰氏阳性菌、真菌的条件)(I-I)作为适于革兰氏阳性菌、真菌的加热条件的一个例子，可以举出满足加热时间为I分钟以内、并且最高处理温度为 125°C以上且160°C以下的条件(参照图4)。(添加TritonX-100作为细胞溶解促进剂的情况)(为了在短时间内均匀地进行加热所优选的容量)在加热工序中，作为可在短时间内均匀地加热样品的容器的容量，可以举出以下的范围。(J-I)至少 2ml 以下。(J-2)优选 O. 6ml 以下。(J-3)更优选 O. 2ml 以下。(对象细胞)本发明中作为核酸提取对象的细胞主要为微生物细胞。作为微生物,可以从不动杆菌(Acintobacter)属、放线菌(Actinomyces)属、气球菌(Aerococcus)属、气单胞菌(Aeromonas)属、产喊杆菌(Alclaigenes)属、芽抱杆菌(Bacillus)属、拟杆菌(Bacteriodes)属、博德特氏菌(Bordetella)属、布兰汉氏球菌(Branhamella)属、短杆菌(Brevibacterium)属、弯曲杆菌(Campylobacter)属、念珠菌(Candida)属、二氧化碳曬纤维菌(Capnocytophagia)属、色素杆菌(Chromobacterium)属、梭菌(Clostridium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、隐球菌(Cryptococcus)属、异常球菌(Deinococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、丹毒丝菌(Erysielothrix)属、大肠杆菌(Escherichia)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、兼性双球菌(Gemella)属、嗜血杆菌(Haemophilus)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、乳酸球菌(Lactococcus)属、军团菌(Legionella)属、明串珠菌(Leuconostoc)属、李斯特菌(Listeria)属、微球菌(Micrococcus)属、分支杆菌(Mycobacterium)属、奈瑟氏球菌(Neisseria)属、隐抱子菌(Cryptosporidium)属、诺卡氏菌(Nocardia)属、厄氏菌(oerskovia)属、副球菌(Paracoccus)属、足球菌(Pediococcus)属、消化链球菌(Peptostreptococcus)属、丙酸杆菌(Propionibacterium)属、变形菌(Proteus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、红球菌(Rhodococcus)属、红螺菌(Rhodospirillium)属、葡萄球菌(Staphlococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、弧菌(vibrio)属、以及耶尔森氏菌(Yersinia)属构成的组中选择。本发明也可应用于微生物以外的动物细胞或昆虫细胞、植物细胞、支原体、病毒等。对于本发明的处理对象，也可以混合多个如上所述的种类不同的细胞。另外，虽然在贫营养状态下存在采用芽孢或孢子等形态的微生物，但是由这样的繁殖状态所产生的细胞状态也是可以的。(核酸的种类)本发明中作为提取对象的核酸主要为基因组DNA、核糖体RNA和质粒DNA。
(用途)本发明的核酸提取方法可应用于核酸精制的粗提取液(用于硅胶膜法、荷电微粒法、酚氯仿法等)、核酸扩增的模板(PCR、RT-PCR、LAMP、NASBA等)、核酸检测的目标(实时PCR检测、微阵列检测、杂交保护实验、核酸序列测序等)等。另外，也可以将本发明的核酸提取方法应用于核酸提取试剂盒。例如可以举出将硅胶膜、带电磁性粒子等作为载体使用的试剂盒或者使用酒精沉淀法的试剂盒。
如上说明，根据本发明的核酸提取方法，通过在容器密闭的状态下将细胞悬浮液加热至100°c以上的规定最高温度，可以迅速地提取核酸。本发明的应用范围并不限定于上述实施方案。本发明可广泛地应用于从细胞中提取核酸的核酸提取方法。
权利要求
1.一种核酸提取方法，其为从细胞中提取核酸的核酸提取方法，其特征在于，包括 将细胞悬浮液加入到容器中的工序； 将所述容器密闭的工序； 在所述容器密闭的状态下，将所述容器中容纳的所述细胞悬浮液加热至100°c以上的规定最高温度的工序。
2.根据权利要求I所述的核酸提取方法，其特征在于，在所述加热工序中，加热所述容器的时间低于120秒。
3.根据权利要求I或2所述的核酸提取方法，其特征在于，所述细胞为革兰氏阴性菌，并且所述规定最高温度为105°C以上且125°C以下。
4.根据权利要求I或2所述的核酸提取方法，其特征在于，所述细胞为革兰氏阳性菌，并且所述规定最高温度为125°C以上且160°C以下。
5.根据权利要求I或2所述的核酸提取方法，其特征在于，所述细胞为真菌，并且所述规定最高温度为125°C以上且160°C以下。
6.根据权利要求I 5中任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，还包括在保持所述容器的密闭状态下将已被加热至所述规定最高温度的所述细胞悬浮液冷却的工序。
7.根据权利要求I 6中任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，还包括在内压为大气压以上的状态下打开经过所述加热工序的容器的工序。
8.根据权利要求I 7中任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，还包括将已被加热至所述规定最高温度的所述细胞悬浮液冷却后再加热的工序。
9.根据权利要求I 8中任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，还包括向所述细胞悬浮液中混合细胞溶解促进剂的工序。
10.根据权利要求I 9中任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，在将所述容器密闭的工序中，在所述容器内没有气体的状态下将所述容器密闭。
11.根据权利要求I 10中任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，在将所述容器密闭的工序中，将比所述容器内的所述细胞悬浮液的沸点更高的溶剂密闭在所述容器内。
12.根据权利要求I 11中任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，所述加热工序由将加热部预热至100°c以上的设定温度的工序以及使所述容器与达到所述设定温度的所述加热部接触的工序构成。
全文摘要
本发明提供一种可应用于比较广泛的微生物并且可迅速地提取核酸的核酸提取方法。所述方法包括将细胞悬浮液加入到容器中的工序、将所述容器密闭的工序、以及将加热部预热至100℃以上的设定温度的工序。此外，所述方法还包括通过使所述容器与达到所述设定温度的所述加热部接触，在所述容器密闭的状态下将所述容器中容纳的所述细胞悬浮液加热至100℃以上的规定最高温度的工序。
文档编号C12N15/10GK102618530SQ20121002164
公开日2012年8月1日 申请日期2012年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者佐佐木伸大, 和气仁志, 小关良宏, 山田晃世, 田口朋之, 茂木豪介 申请人:国立大学法人东京农工大学, 横河电机株式会社