专利名称：：一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记，该标记的开发可直接应用于洋葱分子标记辅助育种，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：洋葱(Alliumcepa.L),又称圆葱、葱头,百合科、葱属，二年生植物，已有5000多年的栽培历史。据2009年FAO统计，至少有175个国家栽培洋葱。世界洋葱种植面积370万公顷，产量7230万吨，在所有的蔬菜作物中，其种植面积居第二位，产量居第三位；其中，我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，生产面积超过100万公顷，总产量2107万吨，约占全世界产量的30%。洋葱素有保健食品的美称，不仅可鲜食，还大量用于加工，具有降低和预防血栓形成，降血脂、降血压、抗动脉硬化、预防心肌梗塞的作用，深受消费者的喜爱。我国洋葱栽培历史较短，品种资源较匮乏，目前种植的品种可分为红皮、黄皮及白皮洋葱，栽培品种以常规品种为主。随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加，但是目前生产上主要以进口杂交种和一些常规种选育为主，缺少具有自主知识产权的杂交一代品种，需要花费大量的外汇从国外进口种子，使出口创汇蔬菜生产的成本居高不下。为了改变我国在洋葱育种领域上的落后局面，尽快研制出具有我国自主知识产权的洋葱杂交种，其关键在于广泛收集品种资源的同时解决洋葱育种周期长的问题(为普通蔬菜作物白菜、萝卜的2-4倍)。加快分子标记辅助选择以及雄性不育系利用的研究，走现代分子生物学与常规育种相结合的道路；加快育性材料的鉴定工作已成为目前亟待解决的难题，是洋葱杂交育种选育的关键环节。目前，在洋葱雄性不育的鉴定中，细胞质鉴定的分子标记研究已经取得了显著的进展。但是在细胞核鉴定上，由于洋葱基因组DNA巨大(17.9pg)，每I条染色体上的核苷酸有15，290Mbp，是玉米基因组的6倍、番茄的16倍、拟南芥的107倍[KingJJ,BradeenJM,BarkO,etal.Alow-densitygeneticmapofonionrevealsarolefortandemduplicationintheevolutionofanextremelylargediploidgenome.TheoreticalandAppliedGenetics,1998.52:52-62.]。G0kge和Havey在两个开放授粉的洋葱群体内[G0k^eAF,JMcCallum,YSatoandMJHavey.MoleculartaggingoftheMslocusinonion.JournaloftheAmericanSocietyforHorticulturalScience,2002,127,576-582.]，以A0B272(0.9cM)标记为辅助工具，尝试选择保持系，但发现该标记与保持系几乎没有关联，作者认为可能是因为在长久的开放授粉环境下，A0B272标记与Ms位点之间已经进行了充分的染色体交换，因此只用该分子标记无法准确地选出保持系。在我们以前的研究中，已开发了一个与雄性不育育性恢复基因相关的cDNA分子标记(WHR240)，而且该标记在多个洋葱材料中得到验证，但是因该标记是以反转录的特定时期、特定组织的cDNA为模板，因此在操作和具体利用上具有一定的局限性(RNA的提取、反转录等前提条件以及单显性标记)，在大规模的育种材料鉴定工作上还存在着一定的局限性。另外，山东省农业科学院蔬菜研究所葱姜蒜研究中心(以下简称研究中心)在洋葱雄性不育基因位点的分子标记方面取得了突破性进展，已经开发了与洋葱雄性不育基因ms和育性恢复基因Ms紧密连锁的共分离DNA分子标记，应用该标记能够准确判断Ms或ms基因的是否纯在，但是由于不是共显性标记，不能一次扩增来完成基因型的判断，必须分别用不育基因连锁标记和育性恢复基因标记进行扩增后，根据两次获得的结果综合判断基因型，而且还存在对扩增失败有错判的可能性。而一种共显性的DNA标记可以通过单次验证的结果来准确地判断雄性不育位点的基因型(MsMS、MSmS、mSmS)。因此，一种共显性DNA分子标记的开发将成为辅助洋葱雄性不育杂交种选育的最有效的方法。SSR(SimpleSequenceRepeat)简单序列重复也称微卫星DNA，串联重复的核心序列为l-6bp，其中最常见是双核苷酸重复，S卩(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同，是一种共显性分子标记。SSR标记的基本原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。ESTs(expressedsequencetags)是指从不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆进行5'或3'端测序后得到的长约300-400bp的基因表达序列片段。利用多种生物信息学分析软件，对序列进行前处理，然后设计SSR引物，电泳分析扩增片段的大小。SSR标记的开发还可应用于遗传图谱的构建、DNA指纹图谱的建立、种质资源多样性研究。因此，一种共显性DNA核标记的开发不仅可以减少鉴定杂交后代的工作量、试验成本、保持系选育的时间，而且可以直接通过一次试验就能够直接鉴定出样品在Ms位点的基因型(MsMS、MSmS、mSmS)。获得洋葱细胞核育性标记，对于筛选洋葱雄性不育系和配套保持系，选育洋葱杂交种满足市场需求，填补洋葱杂交育种领域上的空白，具有重要意义。
发明内容本发明根据研究中心已测序的洋葱AFLP片段序列，两端设计引物[AFLP-U5'TTAACGTCATCAACCGTTCAT3'；AFLP-D5'GGGACAAAAGAATAGCAATATG3']分别扩增可育基因池和不育基因池，测序后用DNAMAN软件分别比对两个基因池的不同克隆之间序列差异，利用misa软件搜索SSR位点以及primer3设计SSR弓I物[USSR-15'TTAACGTCATCAACCGTTCAT3'；DSSR-15;TTGGCTTCATCTCCRCTTC3']，PCR试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳等分子生物学实验方法，开发出了一个能够区分洋葱核基因Ms位点的共显性SSR分子标记WH-SSR-I[USSR-15'TTAACGTCATCAACCGTTCAT3';DSSR-15'TTGGCTTCATCTCCRCTTC3']，该标记的开发对洋葱雄性不育基因Ms位点基因型(MsMs、Msms、msms)的准确、快速鉴定,加速洋葱杂交种的选育进程,具有重要意义。一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记WH-SSR-1，引物核苷酸序列为USSR-I5/TTAACGTCATCAACCGTTCAT3'，如SEQIDNO.I所示；DSSR-I5/TTGGCTTCATCTCCRCTTC3'，如SEQIDNO.2所示；开发此标记所用的上游引物AFLP-U的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物AFLP-D的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示AFLP-U5/TTAACGTCATCAACCGTTCAT3；AFLP-D5/GGGACAAAAGAATAGCAATATG3'。所述洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记及引物可以用于鉴别洋葱雄性不育基因Ms位点基因型，应用时步骤如下提取待检测洋葱样本的叶片总DNA，经引物[USSR-1，DSSR-1]PCR扩增后，检测是否有扩增产物，若只有一条102bp的扩增带，则Ms位点基因型为纯合显性(MsMs)，若只有I条99bp的扩增带，则Ms位点基因型为纯合隐性(msms)，若有102bp、99bp两条扩增，则Ms位点基因型为杂合(Msms)。所述提取待检测洋葱样本的叶片总DNA采用CTAB法提取[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,andManiatis,T.,inMolecularCloningALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,Vol.I,2,3(1989)]。所述PCR扩增的反应体系为25μL体系，其中2.5μL10XPCRBufferwithMg2+；4.0μLdNTPsofeach2.5mM;各IμL10ymol/LofPrimer[USSR-1和DSSR-1]；0.5μLTaqDNApolymerase(5u/μL)；1μLOnionDNATemplate；15μLCldH2O0反应程序为94°C预变性4min，[94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec]，30个循环，72°C延伸5min，4°C保存；上述PCR扩增体系所用模板DNA的用量为20ng100ng。所述检测是否有扩增产物的方法为将经过PCR扩增得到的产物于6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测扩增片断，数码相机拍照。上述操作步骤及操作条件如无特别说明，均按本领域常规操作步骤及操作条件进行。本发明获得了洋葱核基因Ms位点SSR分子标记一个，命名为WH-SSR-I，该标记在239株的BC1分离群体中，所有可育株中(Msms)均扩增出两条带，而在不育株(msms)中仅扩增出了一条带，没有观察到染色体交换株的出现(表1，图3)，上述结果说明该标记与Ms位点紧密连锁。为了验证本标记在实际育种工作的可行性及使用范围，我们用来源不同遗传背景的已知Ms位点基因型的材料,雄性不育系(msms),父本自交系(MsMs)进口杂交种(Msms)进行了验证。验证结果表明，所有纯合显性的材料均只有I条约102bp带的扩增，而纯合隐性材料均只有I条99bp带的扩增，杂合材料存在两条带的扩增，验证结果与实际表型完全相符(表2，图5)。本发明的SSR分子标记的开发为洋葱分子标记辅助选择育种体系的建立奠定了基础，与目前技术相比，其优点是(I)标记稳定本发明所开发的SSR分子标记WH-SSR-I，在[118X(118X12-12)]群体中，所有材料的标记类型与表型完全一致，即不育株仅有一条带(<IOObp)的扩增，而可育株有两条带的扩增(一条带<IOObp,—条带>IOObp);在15个不同来源的材料验证，杂合体均扩增出了2条带，而纯合Ms仅扩增出了偏大的带，纯合ms均扩增出了I条偏小的带，鉴定结果与基因型和表型完全一致(表2，图5)。(2)共显性标记=WH-SSR-I标记为一种共显性DNA标记，能够直接鉴定所测个体在Ms位点的基因型(MsMs、Msms或者msms)。这个标记的开发,是首次在雄性不育基因Ms位点上，与雄性不育基因(ms)和育性恢复基因(Ms)共分离的共显性标记，国内外还尚未见到此方面的报道。其特点是，共显性标记可通过一次扩增来完成三种不同基因型的准确鉴定。目前在Ms位点上报道的论文有A0B272标记和WHR240标记。若采用A0B272标记进行保持系的鉴定，由于存在着与Ms位点的交换值(O.9cM)不能准确鉴定所测个体的基因型。而WHR240标记由于其鉴定材料为幼蕾的RNA，因此，不仅受到鉴定时间的限制，而且需要对RNA样品进行前处理，增加了鉴定的复杂程度和成本，不适合大规模鉴定工作。本中心开发的另外的两个与Ms位点紧密连锁的DNA分子标记OSG-SCAR(专利申请号201110247512.4)和OMS-SCAR(专利申请号2011110226231.4)标记，虽然能够准确鉴定三种不同的基因型，但是必须通过两次扩增来完成，由于其为显性标记，无法直接鉴定样本的基因型，在鉴定实施过程中，增加了由于实验操作而造成的鉴定错误的可能性。(3)分子标记辅助选择操作简便，节约成本洋葱是两年生植物，其育种年限是白菜、萝卜等蔬菜育种年限的2-4倍，常规选育方法，周期长，成本高，费时又费力。通过本发明，只需对洋葱总DNA，进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，即可有效的鉴定材料细胞核Ms位点的基因型，而且还可以通过一次性扩增就可以区分杂合体和纯合体基因型，这一点是目前为止的其它标记方法所不能替代的。WH-SSR-I分子标记是洋葱核Ms位点的一种共显性分子标记，不仅克服了以往分子标记的不足，而且避免了常规方法繁琐的筛选过程，还可以节省4-6年杂交测交时间以及此过程中大量人力、物力消耗，从而使得其操作过程更简单、有效。图I:洋葱叶片总DNA提取结果。图2=AFLP片断在Ms位点的差异分析，其中，阴影部份为SSR重复位置，下划线为引物部分。图3:WH-SSR-1标记在回交群体中的连锁分析，其中，1-25:可育单株(Msms)；26-50:不育单株(msms)；MMarker0图4=WH-SSR-I在三种不同基因型洋葱材料中的扩增结果，其中，I:可育纯合体基因型单株(MsMs)；2:可育杂合体基因型单株(Msms)；3:不育纯合体基因型单株(msms)；MMarker0图5=WH-SSR-I标记对不同来源遗传背景的15份材料中的扩增结果，1_9:为日本沈井种苗株式会社的洋葱杂交种S(Msms),其中，1-3:夕一术；4_6:木才了一义;7_9··了卜^；10-12:不育系118S(msms);13-24为日本七宝种苗株式会社的洋葱杂交种，其中，13-15:I；3号;16-18:夕一廿>;19-21了KK>^；22~24:甘70；M=Marker;25_36:育性恢复系S/N(MsMs)，其中，25-27PR146;28_30PR149;31_33PR153；34-36PR156;37_45为不育系S(msms)，其中，37-39PF502；40~42:PF10_8;43_45:PF17_5。具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例I(一)材料与方法6I.植物材料以洋葱雄性不育系118S(msms)为母本与父本自交系12-12S(MsMs)杂交，所获Fl代S(Msms)为父本与母本不育系118S(msms)回交,获得两个回交后代分离群体,然后用回交一代分离群体构建可育基因池S(Msms)和不育基因池S(msms)。标记可行性验证材料本中心选育的不同类型的不育系PF502(黄皮、早熟)，PF10-8(黄皮、中熟)，PF17-5(红皮、中晚熟)；日本泷井种苗株式会社杂交种(夕一*'、木才T一;^、7卜>)，日本七宝种苗株式会社的杂交种(I；3号、七宝甘70、夕一开'>、7*K、;育性恢复纯合体材料(PR146、PR149、PR153、PR156)，来源于日本不同洋葱品种(杂交种)，核基因型为MsMs，通过测交、回交方法选育而成，选育方法参见[Pike,L.Μ.1986.Onionbreeding.InBasset,M.J.(ed.)BreedingVegetableCrops.AVIPublishingCo.,Connecticut,pp,357-394]。2.总DNA的提取与检测基因组DNA提取方法采用改良CTAB法，琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测。3.序列分析与引物的设计根据测序所获得的AFLP片段序列，设计基因特异性引物AFLP-U5/TTAACGTCATCAACCGTTCAT3'；AFLP-D5/GGGACAAAAGAATAGCAATATG3'。分别对回交群体中的可育基因池和不育基因池进行PCR扩增，克隆回收扩增片段，对单克隆进行测序，可育基因池随机挑取20个克隆，不育基因池随机挑取10个克隆，利用DNAMAN软件对不同克隆之间的AFLP测序片断，进行比对分析。在peri操作环境下，执行misa.pi命令,搜索SSR位点；利用primer3软件设计SSR引物USSR-I:5,TTAACGTCATCAACCGTTCAT3'；DSSR-I5/TTGGCTTCATCTCCRCTTC3'。由上海生工生物技术有限公司合成，PAGE纯化。4.PCR扩增及检测PCR扩增在美国伯乐的TC-XP-D型基因扩增仪上进行，25μL体系，其中2.5μL10XPCRBufferwithMg2+;4·OμLdNTPsofeach2.5mM；各IyL10ymol/LofPrimer[USSR-1和DSSR-1]；0.5μLTaqDNApolymerase(5u/μL)；1μLOnionDNATemplate；15yLddH20。PCR扩增体系所用模板DNA的用量为IμL(约20ng)。反应程序为94°C预变性4min,[94°C变性30sec,58°C退火30sec,72°C延伸30sec]，30个循环，72°C延伸5min，4°C保存；PCR产物于6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测扩增片断数码相机拍照。5.单株验证通过田间分离群体中观察判断各株的育性，WH-SSR-I标记鉴定Ms位点的基因型，反应体系、程序以及检测方法参照4。6.WH-SSR-I标记在其他来源不同遗传背景的已知基因型材料中的验证利用WH-SSR-I标记引物对已知基因型不同来源的其他材料(表2)进行验证，以证实表型与鉴定的基因型之间的关系，反应体系、程序以及检测方法参照4。(二)结果与分析I.洋葱叶片总DNA提取分析由图I可以看出，所提取的DNA条带清晰，无拖尾现象，无RNA残留，证明其基本无降解；并且点样孔清晰，证明无杂质残留(图I)。分光光度计检测分析，所提取的DNA0D260/0D280均在I.8-2.O之间，可以满足后续试验的要求。2.序列分析与引物设计根据本研究中心已获得的AFLP测序序列，对于回交群体中可育基因池和不育基因池PCR扩增后，发现在可育基因池和不育基因池之间存在一个插入/缺失(IN/DEL)标记位点(图2)，该标记位点在不育基因池中(10个克隆)均表现为缺失TCT，而在可育基因池20个克隆中有9个克隆表现为插入TCT序列，11个克隆表现为缺失TCT序列。经misa软件分析后发现该插入缺失标记为SSR标记位点(WH-SSR-I)，其重复单元为TCT重复，在Ms位点纯合隐性(msms)群体中为4次重复，在杂合状态(Msms)群体重复次数有两种，一种为4次重复；一种为5次重复，两种重复的分离比例适合I:I分离比例，我们推测该位点为Ms和ms差异位点，其中ms为4次TCT重复，而Ms为5次TCT重复。以此为基础，我们开发了I对SSR引物[USSR-1:5'TTAACGTCATCAACCGTTCAT3'；DSSR-15/TTGGCTTCATCTCCRCTTC3']用于区分该位点的类型，其预期扩增大小ms纯合为99bp、Ms纯合为102bp、Msms杂合为99bp和102bp2条带。3.WH-SSR-I标记在[118X(118X12-12)]回交分离群体中的连锁分析WH-SSR-I标记在239株的BC1分离群体中，所有可育株(Msms)均扩增出了两条带(一条带<IOObp,—条带>IOObp),而不育株(msms)仅扩增出了一条带(<IOObp),无交换值(表1，图3)。因此我们分析，WH-SSR-I标记可能在与Ms位点紧密连锁。表1WH-SSR-1标记与洋葱雄性核不育基因(Ms，ms)连锁分析组合回交组合BCl可育S(Msms)不育S(msms)总个交换值％二带一带二带一带体数11812-1S(msms)XS(Msms)61OO54115O11812-2S(msms)XS(Msms)61OO63124O4.WH-SSR-I标记在来源不同遗传背景已知基因型材料中的可行性验证在对不育系118S(msms)、父本12_12S/N(msms)以及回交一代分离群体中可育株(杂合体)S(Msms)的三种基因型材料的验证中，不育系118仅扩增出了一条带(<100bp)，杂合体中扩增了2条带(一条带<IOObp,—条带>IOObp),父本12-12扩增出了一条大于IOObp的带(图4)。5.WH-SSR-I标记在分子标记辅助育种中的可行性验证WH-SSR-I标记对15个不同来源的材料进行鉴定，扩增结果表明杂合体均扩增出了2条带,而纯合Ms基因型仅扩增出了偏大的带(一条带>IOObp),纯合ms基因型均扩增出了一条偏小的带(<IOObp)。分子鉴定结果表现型与基因型完全一致(表2，图5)。上述结果说明，WH-SSR-I标记是与Ms位点紧密连锁共分离的共显性标记。表2洋葱不同遗传背景已知基因型材料单株验证结果权利要求1.一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.I和SEQIDNO.2所示。2.权利要求I所述的一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记的引物，其特征在于开发此分子标记所用的上游引物AFLP-U的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物AFLP-D的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.权利要求I所述的一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记在鉴别洋葱雄性不育基因Ms位点基因型中的应用。4.权利要求2所述的引物在鉴别洋葱雄性不育基因Ms位点基因型中的应用。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于应用步骤为提取待检测洋葱样本的叶片总DNA，经引物PCR扩增后，电泳检测是否有扩增产物，若只有一条102bp的扩增带，则基因型为纯合显性，若只有I条99bp的扩增带，则基因型为纯合隐性，若有102bp、99bp两条扩增，则基因型为杂合。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为25iiL体系，其中2.5iiL10XPCRBufferwithMg2+；4.OuLdNTPsofeach2.5mM;各IyLIOumol/LofPrimer[USSR-1和DSSR-1]；0.5uLTaqDNApolymerase(5u/uL)；1uLOnionDNATemplate；15ULddH20o7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应程序为94°C预变性4min,[94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec]，30个循环，72°C延伸5min,4°C保存；PCR扩增体系所用模板DNA的用量为20nglOOng。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测是否有扩增产物的方法为将经过PCR扩增得到的产物于6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测扩增片断，数码相机拍照。全文摘要本发明公开了一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记WH-SSR-1，开发此标记所用的核苷酸引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，应用此标记检测洋葱样本的引物核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本发明的洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记及引物可以用于鉴别洋葱雄性不育基因Ms位点基因型提取待检测洋葱样本的叶片总DNA，经引物PCR扩增后，检测扩增产物的大小。本发明的分子标记不仅克服了以往分子标记的不足，而且避免了常规方法繁琐的筛选过程，还可以节省4-6年杂交测交时间以及此过程中大量人力、物力消耗，从而使得其操作过程更简单、有效。文档编号C12Q1/68GK102586239SQ20121004245公开日2012年7月18日申请日期2012年2月23日优先权日2012年2月23日发明者刘冰江,吴雄,杨妍妍,缪军,霍雨猛申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所