专利名称：利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β _葡萄糖苷酶的方法。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶可以催化水解多种β -葡萄糖苷键，具有底物广谱性和多种生物功能，比如(I) β -葡萄糖苷酶用于纤维素的水解 纤维素是自然界最丰富的碳资源，从纤维素分解为葡萄糖需要3种酶协同作用。β -葡萄糖苷酶可以将纤维二糖水解为葡萄糖，而纤维素酶组分中β -葡萄糖苷酶含量少，活力低，因此成为纤维素酶解的瓶颈。因此筛选或者通过基因工程改造得到高活性的β-葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。(2) β -葡萄糖苷酶制备高生物活性苷元的应用研究发现，自然界多种具有高生物活性的物质，由于大部分以糖苷形式存在而降低了其活性。利用葡萄糖苷酶水解掉葡萄糖后可以得到高活性的苷元。例如，人参皂甙是人参中的主要有效成分，含量约4%，但并非所有的人参皂甙都有很高的生物活性。如具有强烈抗癌作用的人参皂甙Rh2在人参中的质量比仅为10_5。而以低活性的人参二醇类皂甙Rg3为底物，β-葡萄糖苷酶可以水解掉一个葡萄糖后得到人参皂甙Rh2。例如，大豆异黄酮具有的很多重要的生理功能，研究发现大豆异黄酮苷元的生理活性远比其相应糖苷的活性高。大豆异黄酮中97% 99%是以大豆异黄酮糖苷形式存在，苷元形式仅为大豆异黄酮总量的1% 3%。利用β_葡萄糖苷酶可以水解大豆异黄酮糖苷为高生物活性的大豆异黄酮苷兀。传统的β -糖苷酶筛选，比如以纤维二糖为唯一碳源的筛选方法，主要是对β -糖苷酶产生菌的筛选，获得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列较慢，也就不能够重组为具有高效、高适应性的工程菌。
发明内容
本发明目的是提供一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β -葡萄糖苷酶的方法，该方法筛选时间短，精度高，误差少，且可以较快获得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氣基酸序列，进一步重组为具有闻效、闻适应性的工程菌。本发明采用的技术方案是本发明提供一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β -葡萄糖苷酶的方法，所述方法为(1)从富含纤维素资源的地点采集土样，提取总DNA，构建fosmid文库，获得富集菌液；(2)将富集菌液于含七叶苷的基础培养基中，20 40°C培养12 24h进行初筛，获得菌落周围呈现黑色的菌株；所述含七叶苷的基础培养基的终浓度组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10 20g/L，七叶苷O. I lg/L，柠檬酸铁O. I 5g/L，氯霉素10 50mg/L，溶剂为水；(3)挑取步骤(2)获得的菌落周围呈现黑色的菌株接种至基础培养平板上，20 40°C培养12 24h进行复筛，获得复筛培养后的平板；所述基础培养基终浓度组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10 20g/L，氯霉素10 50mg/L，溶剂为水；(4)取3 IOml 4-甲基伞形酮-β -D-葡萄糖苷(4-MUG)的低熔点琼脂糖溶液均匀平铺在步骤(3)获得平板的上层，待琼脂糖溶液凝固后，20 40°C培养O. I lh，紫外灯下观察菌落，菌落周围显荧光的，即获得所述β-葡萄糖苷酶产生菌株，进而获得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，通过本领域公知的生物工程方法将β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列重组为各种工程菌；若无荧光的，即为假阳性菌株；所述4-甲基伞形酮-β -D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液的终浓度组成为4-甲基伞形酮-β -D-葡萄糖苷O. I lg/L，低熔点琼脂糖I 10g/L，溶剂为水，所述低熔点琼脂糖的凝胶温度为24 28°C，优选低熔点琼脂糖Agarose LM GQT。进一步，步骤(2)所述含七叶苷的基础培养基中七叶苷的终浓度优选为0. 5g/L，柠檬酸铁的终浓度优选为2g/L。 步骤⑵所述富集菌液先进行ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6倍稀释(优选10_5倍稀释)，再分别于含七叶苷的基础培养基中进行初筛培养。步骤⑵所述初筛温度为37°C，培养时间为24h。进一步，步骤(3)所述复筛温度优选为37°C，培养时间优选为24h。进一步，步骤(4)所述培养温度优选为37°C，培养时间优选为40min。步骤(4)所述4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液的终浓度组成优选为4-甲基伞形酮-β -D-葡萄糖苷0. 4g/L，低熔点琼脂糖5g/L，溶剂为水，所述低熔点琼脂糖的凝胶温度为24 28°C，优选低熔点琼脂糖Agarose LM GQT。步骤(4)所述4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液温度降至40°C时均匀平铺在步骤(3)获得的复筛培养后菌株的平板上。本发明所述从富含纤维素资源的地点采集土样，提取其总DNA，构建Fosmid文库，采集地点分别为辽宁盘锦市、内蒙古呼和浩特市，采集日期为2007年10月，分别命名为16号Fosmid文库和18号Fosmid文库。本发明提取土壤总DNA、构建Fosmid文库的方式方法是本领域的技术人员所熟知的，不再赘述。本发明从富含纤维素资源的地点采集土样，提取其总DNA，构建Fosmid文库，将七叶苷和柠檬酸铁加入基础培养基中制备初筛平板，对Fosmid文库进行初筛，挑取菌落周围呈现黑色的菌株进行复筛，用4-MUG低熔点琼脂糖溶液覆盖复筛菌株，培养后紫外灯下观察，菌落周围显荧光的，确定为表达β -葡萄糖苷酶活性的克隆，将该克隆直接测序或者构建亚库后测序，即可获得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列。本发明从辽宁盘锦市、内蒙古呼和浩特市采集土壤分别获得16号Fosmid文库和18号Fosmid文库，根据本发明方法分别筛选得到β-葡萄糖苷酶HU-Yl和β -葡萄糖苷酶HU-Hl，所述β -葡萄糖苷酶HU-Yl的序列为atgaaaatct taagtacgaa tattctcatt gttagtctgg tccttttggt tggatgtagt 60cagccggaat cttcacagca agcctccaat cctaaaatgg atgcctttat taatgacttg 120atgctgaaga tgacgctgga agaaaaaatc ggacagctaa accttcccgt tgcgggtggc 180
cctgccaccg gcattgccgt aaataaaggt cttgaagataaaatacgggc agggcaagta240ggtggaatct ttggtgtgtg ggggcccgat aaagttagaaaggtgcagga gattgcagtg300aatgaatcac gactgaagat ccctctgttt tttggattggatgtaattca cgggcacaaa360actatctacc cgataccact gggtatggcc gccacgtgggacatgtcgtt aattgaacgt420ggtgcccagt tggctgcgca ggaagcatca gccgaaggattgaactggac cttctcaccc480atggtggata tttcccgcga ccctcgctgg ggtcgtatttcagaaggctc tggtgaagat540ccctatctcg gttcgctcat cgcgcaagcc atggtaagaggctatcaggg taatgatctg 600gcggccacca ataccattat ggcatgtgtg aaacactttgctttatatgg cgctgccgaa660gccggcagag attataacac agtggatatg agtcgtgctacgatgtataa tttttttctt720cctccttata aagctgcgct ggatgctggt gcggccagtatcatgagttc atttaatgta780gtggatggaa tcccggcttc gggtaacaaa tggctcttaaccgatgtgct gcgaaagcaa840tggggcttca agggctttgt ggtgtcagat tacaccagtattaacgaaat gatcaatcac900ggcatgggcg atttgaaaac ggtttcatca ctcgcgctgaatgcaggcat ggacatggac960atggtgggag aaggtttttt aactacgttg aagaaatcaatagaagagaa aacggttacc1020gaagaacaaa tcgatcaggc atgccgcaga atattggaagccaaatacaa attgggattg1080ttcgatgatc cttacaaata tatcagcgaa gaacgtgctgctaaagaagt tttcaataac1140gatactcgcc aggtagcacg ccagttggct gcccattcttttgtgttgct gaaaaacaag1200gatcaacttt tgcctctcaa caaaaccaaa acaatggctttcattgggcc gttggccaat1260aatcaacgcg atatgttggg tacgtgggtg attggtggtgaatgggataa atctgtttcg1320gtgctggaag gtgttaaaaa tgcactgggc gaaaaaggcaaagtgttgca tgccaaaggt1380gccaacatta ccaacgatcc ggagatgatt aagcggttgaatttctttgg tcaacctaac1440gtggtgctcg atgagcgctc ctcacaagca atgttgcaggaggcagtagc cactgcatct1500cgtgcagata ttattgtagc ggtgttgggc gaatcgcaaagcatgtcggg tgagtcgtcc1560agccgtacac agttagatct cccggaaagc caaaaagaactattgaaggc actcgtaaaa1620actggtaaga aggtagtgct tgtattgttt accggtcgcccgttaacatt aacctgggaa1680gatgaaaatg tggatgctat tctgaatgta tgggcacccggacatgaagc aggtaatgcc1740attgccgatg tgttgtttgg taactacaat ccttccggtaaactgcctgc aacgtttccg1800cgaagcgtgg gccaggttcc gttgtattac aatcacttgaatacaggccg cccctggaat1860ggtattgatg acaccaagtt taaatccaac tacctggacgaagccaatgt gcccttgtat1920cctttcggat ttggacttag ttacactacg tttggtttttctgatataac cctcagtaag1980caagagttga aaggcaatga aacattaacg gccacggtaacggtaacgaa taccggaaac2040tacgaaggcg aggaaactgt gcagttatac attcgcgatgtggtgggatc ggtgtctcgc2100ccgatgaaag agctgaaagg cttttcaaag atcaatcttaagcccggaga aagtaagcaa2160gtgagtttcg aaatcacacc caatgatctt aagttttataattacgatct gaagtatgag2220tgggaaccgg gcgattttga aatcatgatt ggctccaattcccgcgatgt aaaaatggct228 0tctataaact ggaagaaata a与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明方法筛选时间短，精度高，误差少，且可以较快获得β_葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，进一步重组为具有高效、高适应性的工程菌。
图IFosmid-Yl及其对照在七叶苷平板上的生长情况1为Fosmid-ΥΙ在七叶苷平板上生长，呈现黑色；2为对照在七叶苷平板上生长，没有颜色变化；图2Fosmid_Yl及其对照在4-MUG作用下的紫外灯观察情况=IFosmid-Yl在紫外灯下显示的强烈荧光，2对照在紫外灯下显示的微弱荧光。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I : 取IOg辽宁盘锦市米集的土壤样品，应用MoBio公司的PowerSoil DNA IsolationKU，严格按照说明书操作，提取土壤DNA。取50mlDNA(0. 5μ g/μ I)，按照Epicentre公司的CopyControI Fosmin LibraryProduction Kit的使用说明，对该DNA片段进行末端补平，低熔点琼脂糖凝胶电泳后，切取分离含20-60kb碱基之间的DNA的条带，溶胶法回收该DNA,连接，包装，转导入EPI300宿主细胞，涂到含氯霉素的平板上，37°C培养24小时。挑取单克隆保藏，洗脱平板上的菌落保藏池文库，命名为16号Fosmid文库。18号Fosmid文库的构建方法同上所述，土壤样品采集自内蒙古呼和浩特市。实施例2 含七叶苷的基础培养基(初筛培养基)终浓度组成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，七叶苷O. 5g/L，柠檬酸铁2g/L，氯霉素15mg/L，溶剂为水。基础培养基(复筛培养基)终浓度组成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠IOg/L，琼脂粉15g/L，氯霉素15mg/L，溶剂为水。配制4-MUG低熔点琼脂糖溶液4_甲基伞形酮-β -D-葡萄糖苷(4-MUG)的终浓度为0.4g/L，低熔点琼脂糖(Agarose LM GQT，凝胶温度为24 28°C )的终浓度为5g/L，溶剂为水。从实施例I的16号Fosmid文库中取一管池保藏的菌液O. Olml,用无菌水分别稀释10_3、10_4、10_5、10_6倍，获得4份稀释菌液，分别吸取O. 2mL稀释菌液，均匀涂布在初筛培养基上，置于37°C恒温培养箱培养24小时,取稀释倍数合适、菌落生长均勻的平板,挑取菌落周围培养基变为黑色的菌株(稀释倍数为10_5)，命名为Fosmid-Yl，以无β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作为对照，结果见图I所示(图I中的I为Fosmid-Yl，2为对照)，Fosmid-Yl菌落周围有黑色，对照没有，然后将Fosmid-Yl接种在2份复筛培养基平板上(一份以无β_葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作为对照)，37°C恒温培养箱培养24小时，获得复筛培养后的平板，再取降温到40°C时的4-MUG低熔点琼脂糖溶液6ml均匀平铺在上述复筛培养后的平板上，待琼脂糖凝固后，于37°C培养40分钟，紫外灯下观察菌落，菌落周围显荧光，确定为表达葡萄糖苷酶活性的克隆，进而构建亚库后测序，得到葡萄糖苷酶HU-Yl，序列见SEQ. NOl所示，结果见图2所示，图2中I为Fosmid-Yl，2为对照。实施例3 β -葡萄糖苷酶HU-Yl在制备白藜芦醇中的应用将实施例2获得的β-葡萄糖苷酶HU-Yl基因与pET 28a表达载体连接，再将其转ΛΕ. Coil BL21 中。将获得的 E. Coil BL21/pET 28a/Yl 在含 IOOmL 50yg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中摇床过夜培养。将IOml过夜培养后的菌液倒入IL 50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基培养，直到菌液OD6tltl达到O. 6-0. 8时加入IPTG至终浓度为I. OmmoI/L, 28°C诱导12h后，离心收集菌体，菌体用25ml磷酸缓冲液pH7. 4使其重悬浮，并反复冻融使细胞破碎。离心取上清，含β -葡萄糖苷酶HU-Yl蛋白的上清用O. 22 μ m醋酸纤维素滤膜过滤后用镍柱亲和层析进行纯化获得β -葡萄糖苷酶HU-Yl纯酶。配制pH = 6的O. 2mol/L的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。取一支试管，加入该缓冲液20ml，加入lmg/ml虎杖苷溶液20ml，混合均匀。加入lmg/ml的β -葡萄糖苷酶HU_Y13ml，混匀后于37°C摇床反应12小时。取反应液5000rpm离心5分钟，沉淀物即为白藜芦醇粗制品。干燥后称重，得到6. Img白藜芦醇,收率约为52%。实施例4
含七叶苷的基础培养基(初筛培养基)终浓度组成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，七叶苷O. 5g/L，柠檬酸铁2g/L，氯霉素15mg/L，溶剂为水。基础培养基(复筛培养基)终浓度组成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠IOg/L，琼脂粉15g/L，氯霉素15mg/L，溶剂为水。配制4-MUG低熔点琼脂糖溶液4_甲基伞形酮-β -D-葡萄糖苷的终浓度为0. 4g/L，低熔点琼脂糖的终浓度为5g/L，溶剂为水。从实施例I的18号Fosmid文库中取一管池保藏的菌液0. 01ml，用无菌水分别稀释10_3、10_4、10_5、10_6倍，获得4份稀释菌液，分别吸取0. 2mL稀释液，均匀涂布在初筛培养基上，置于37°C恒温培养箱培养24小时，取稀释倍数合适(稀释10_4倍)、菌落生长均匀的平板，挑取菌落周围培养基变为黑色的菌株，命名为Fosmid-Hl，以无β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作为对照，然后接种在2份复筛培养基平板上(一份以无β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作为对照)，37°C恒温培养箱培养24小时进行复筛培养，获得复筛培养后的平板，取降温到40°C时的4-MUG低熔点琼脂糖溶液6ml均匀平铺在上述复筛培养后的平板上，37°C培养I小时，紫外灯下观察，菌落周围显荧光的，确定为表达β -葡萄糖苷酶活性的克隆，进而构建亚库后测序，得到β -葡萄糖苷酶HU-Hl。实施例5 含七叶苷的基础培养基(初筛培养基)终浓度组成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，七叶苷0. 5g/L，柠檬酸铁2g/L，氯霉素15mg/L，溶剂为水。基础培养基(复筛培养基)终浓度组成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠IOg/L，琼脂粉15g/L，氯霉素15mg/L，溶剂为水。配制4-MUG低熔点琼脂糖溶液4_甲基伞形酮-β -D-葡萄糖苷的终浓度为0. 4g/L，低熔点琼脂糖的终浓度为5g/L，溶剂为水。从实施例I的16号Fosmid文库中取一管池保藏的菌液0. Olml,用无菌水分别稀释10_3、10_4、10_5、10_6倍，获得4份稀释菌液，分别吸取0. 2mL稀释液，均匀涂布在初筛培养基上，置于37°C恒温培养箱培养24小时，取稀释倍数合适、菌落生长均匀的平板(稀释10_5倍)，挑取菌落周围培养基变为黑色的菌株，命名为Fosmid-H2，以无β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作为对照，然后接种在2份复筛培养基平板上(一份以无β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作为对照)，37°C恒温培养箱培养24小时进行复筛，获得复筛培养后的平板，再将降温到40°C时的4-MUG低熔点琼脂糖溶液6ml均匀平铺在上述复筛培养后的平板上，37°C培养40分钟，紫外灯下观察，菌落周围未显荧光，确定为ー株显现假阳性 的克隆。
权利要求
1.一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选￠-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于所述方法为(1)从富含纤维素资源的地点采集土样，提取总DNA，构建fosmid文库，获得富集菌液；(2)将富集菌液于含七叶苷的基础培养基中，20 40°C培养12 24h进行初筛，获得菌落周围呈现黑色的菌株；所述含七叶苷的基础培养基的终浓度组成为蛋白胨IOg/L,酵母粉5g/L，氯化钠10g/L,琼脂粉10 20g/L,七叶苷0. I lg/L，柠檬酸铁0. I 5g/L，氯霉素10 50mg/L，溶剂为水；(3)挑取步骤⑵获得的菌落周围呈现黑色的菌株接种至基础培养基中，20 40°C培养12 24h进行复筛，获得复筛后的平板；所述基础培养基终浓度组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10 20g/L，氯霉素10 .50mg/L，溶剂为水；(4)取4-甲基伞形酮-P -D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液均匀平铺在步骤(3)获得的平板上，20 40°C培养0. I lh，紫外灯下观察菌落，菌落周围显荧光的，即得所述￠-葡萄糖苷酶产生菌株，进而获得￠-葡萄糖苷酶的DNA序列，若无荧光的，SP为假阳性菌株；所述4-甲基伞形酮-P -D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液的终浓度组成为.4-甲基伞形酮-P -D-葡萄糖苷0. I lg/L，低熔点琼脂糖I 10g/L，溶剂为水，所述低熔点琼脂糖凝胶温度为24 28°C。
2.如权利要求I所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(2)所述含七叶苷的基础培养基中七叶苷的终浓度为0. 5g/L，柠檬酸铁的终浓度为2g/L。
3.如权利要求I所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(2)所述富集菌液先进行10_5倍稀释，再于含七叶苷的基础培养基中进行初筛培养。
4.如权利要求I所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(2)所述初筛温度为37°C，培养时间为24h。
5.如权利要求I所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(3)所述复筛温度为37°C，培养时间为24h。
6.如权利要求I所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(4)所述培养温度为37°C，培养时间为40min。
7.如权利要求I所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(4)所述4-甲基伞形酮-P-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液的终浓度组成为4-甲基伞形酮-P-D-葡萄糖苷0. 4g/L，低熔点琼脂糖5g/L，溶剂为水，所述低熔点琼脂糖凝胶温度为24 28°C。
8.如权利要求I所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(4)所述4-甲基伞形酮-P-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液温度降至40°C时均匀平铺在步骤(3)获得的复筛培养后的菌株的平板上。
全文摘要
本发明公开了一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法(1)从富含纤维素资源的地点采集土样，提取总DNA，构建fosmid文库，获得富集菌液；(2)将富集菌液于含七叶苷的基础培养基中，20～40℃培养12～24h进行初筛，挑取菌落周围呈现黑色的菌株接种至基础培养基中，20～40℃培养12～24h进行复筛，再将4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液均匀平铺在复筛平板上，20～40℃培养0.1～1h，紫外灯下观察菌落周围显荧光的，即得所述β-葡萄糖苷酶产生菌株，进而获得β-葡萄糖苷酶的DNA序列；本发明方法筛选时间短，精度高，误差少。
文档编号C12R1/19GK102732597SQ20121012716
公开日2012年10月17日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者李海峰, 蓝袁洋, 黄黎锋 申请人:杭州师范大学