专利名称：一种小肽螯合铜复合物的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小肽螯合铜复合物的制备方法与应用。
背景技术：
动物为了保证每一个细胞，组织，器官，腺体及系统的正常功能需要特定的微量元素，微量元素是动物不可缺少的营养物质，日粮中添加一定高质量、高利用率的微量元素对动物健康和最大限度发挥其生产潜力具有十分重要的作用(NRC，1998 ；Richards,2008)。铜是动物体必需的微量元素之一，是动物体内许多酶(如酪氨酸酶、胺氧化酶、抗坏血酸氧化酶、亚铁氧化酶、超氧化物歧化酶和细胞色素氧化酶)组成成分，参与机体代谢。当机体缺铜时，多种酶的活性降低。导致贫血、心脏肥大、骨变形、主动脉瘤、肌肉间出血、毛发褪色、脊髓的脱鞘髓。大量的研究已经证实，铜对动物机体的免疫系统有着重要影 响，适当水平的铜元素含量对维持免疫功能的正常至关重要。由于无机微量元素之间存在相互拮抗作用，比如铜、锌之间，铁、锌之间，导致吸收利用率降低。人们多超量添加希望解决缺乏问题，但不仅效果有限，还产生了对环境的污染(Cao, 1997)。微量元素的缺乏能够导致许多动物代谢甚至临床疾病的发生。在家畜和禽类生产过程中，微量元素的缺乏直接导致生长缓慢和饲料转化效率下降(NRC，1998)。现在有机微量元素已成为国内外饲料及养殖行业研究的热点。目前，市场上常见的有机微量元素主要为有机酸类微量元素和氨基酸螯合微量元素。从上世纪80年代开始出现以富马酸铁，葡萄糖酸锌等为代表的有机酸类微量元素。第二代的简单有机盐，虽然稳定性好，但与部分营养物质仍会发生拮抗作用。在消化吸收过程中受影响的因素也较多，生物学利用率仍较低。金属离子与氨基酸分子通过配位键结合后，使其分子内电荷趋于中性，形成了较稳定的化学结构(黄雪等，2008;)。但在瘤胃或单胃内酸环境下的稳定性问题一致没有很好地解决(梁建光等，2008)。因此，研发一类生物学利用率高，在瘤胃或单胃内酸环境下的稳定性好的有机铜元素具有十分重要的市场意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小肽螯合铜复合物的制备方法。本发明所采用的技术方案是
一种小肽螯合铜复合物的制备方法，包括如下步骤
1)将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；
2)将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30 37°C下振荡培养18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，继续酶解6 12h，得到小肽发酵液；或者是往培养液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接种芽孢菌，30 37°C下继续振荡培养18 30h，得到小肽发酵液；
3)测定小肽发酵液中小肽的含量，灭酶后，继续加入水溶性铜盐，混合均勻，控制反应温度在55 65 °C，pH为5 6，进行螯合反应；
4)将反应产物干燥，得到小肽螯合铜复合物。所述蛋白原料为 柏、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏蛋白、花生柏、马铃薯蛋白、菜柏、大豆浓缩蛋白中的至少一种。所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。以上原料均可在原料市场购得。每IOOml培养液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。所述芽孢菌为地衣芽孢杆菌iBaciIlus Iicheniformis)或/和枯草芽孢杆菌{BeilIus subtilis、或 I 和纳豆芽抱杆菌Cfeci77w5· natto、。
所述芽孢菌的接种浓度为5 X IO7 IOX 107cfu/ml培养液。所述蛋白酶为中性蛋白酶，加入量为400 700U/g蛋白原料。步骤3)中，小肽与水溶性铜盐的摩尔比为I 3 :1。所述水溶性铜盐为碱式氯化铜、硫酸铜和氯化铜中的至少一种。上述方法制备得到的小肽螯合铜复合物作为饲料添加剂的应用。本发明的有益效果在于
本发明小肽螯合铜制备方法的螯合率高，达到94%以上，所得到的小肽螯合铜复合物在动物胃内的稳定性好，营养更加全面，可用作饲用添加剂，补充日粮的微量元素，提高动物体的免疫机能。
图I是标准蛋白的分子量和出峰时间曲线图 图2是小肽发酵液凝胶G-15洗脱图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不仅限于此。以下实施例中所用到的菌液按以下方法制备
从斜面试管培养基中刮取一环地衣芽孢杆菌Iicheniformis)或枯草芽孢杆菌iBcillus或纳豆芽孢杆菌{Bacillus菌种加入到液体培养基中,摇
瓶培养。摇瓶种子培养基与培养条件为葡萄糖1%、酵母膏O. 5%、蛋白胨O. 5%、牛肉膏O. 5%、食盐O. 05%、磷酸二氢钾O. 1%。pH=7. 0-7. 2、121°C灭菌18分钟。于32°C恒温摇床中，200r/min振荡培养24h，得到菌种液。以上三个菌种购自广东省微生物菌种保藏中心，地衣芽孢杆菌(McilliisIi cheni formi s )和枯草芽抱杆菌 C5ci77w5· subtil is、的编号分别为 GIM1. 8=AS1. 518,GIM1. 19=AS1. 210。以下实施例中所用到的中性蛋白酶购自肇东市日成酶制剂有限公司，商品型号为AS. 1398，酶活力为 50000U/g。以下实施例中所用到的检测方法和计算公式如下所示
一、检测小肽发酵液中小肽的含量及小肽转化率
I、原理小肽发酵液中的大分子蛋白质和肽链较长的多肽用三氯醋酸溶液进行沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后经离心、过滤、消化、蒸懼，测定其蛋白质含量即酸溶蛋白。本方法参照大豆肽粉(Soy peptides powder)中华人民共和国轻工行业标准(QB/ T 2653 -2004)修订而成。2、试剂及仪器
IOOml烧杯；10ml，25ml移液管；半微量粗蛋白质测定试剂和装置；15%三氯醋酸溶液(TCA溶液)；4500转/分钟的离心机。3、方法
取样将小肽发酵液搅拌均匀后，取IOml样品，80°C烘干，准确称重，用于测定小肽含量，重复三次。具体步骤如下
样品用水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，无损的移入IOOml容量瓶中，定容至刻度(100 ml总样本液)静止10分钟。摇动容量瓶取15ml浑浊液用离心机4500转离心10分钟，取IOml上清液注入试管管中，再加入15%三氯醋酸10ml，静止沉降15分钟后，用定性滤纸过滤。取滤液IOml (相当于用于消化的样本液为5ml)注入干燥的消化管中，加入硫酸铜O. 2g，硫酸钠3g，再加浓硫酸10ml，消化方法及蒸馏方法与凯氏定氮法相同。样品中肽含量的计算公式
权利要求
1.一种小肽螯合铜复合物的制备方法，包括如下步骤 1)将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌； 2)将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30 37°C下振荡培养18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，继续酶解6 12h，得到小肽发酵液；或者是往培养液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接种芽孢菌，30 37°C下继续振荡培养18 30h，得到小肽发酵液； 3)测定小肽发酵液中小肽的含量，灭酶后，继续加入水溶性铜盐，混合均勻，控制反应温度在55 65 °C，pH为5 6，进行螯合反应； 4)将反应产物干燥，得到小肽螯合铜复合物。
2.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于所述蛋白原料为豆柏、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏蛋白、花生柏、马铃薯蛋白、菜柏、大豆浓缩蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。
4.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于每IOOml培养液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。
5.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于所述芽孢菌为地衣芽抱杆菌{Bacillus licheniformi s')或/和枯草芽抱杆菌iBcillus subtil is)或/和纳豆芽抱杆菌natto)。
6.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于所述芽孢菌的接种浓度为5 X IO7 IOX 107cfu/ml培养液。
7.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为中性蛋白酶，加入量为400 700U/g蛋白原料。
8.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于步骤3)中，小肽与水溶性铜盐的摩尔比为I 3 :1。
9.根据权利要求I所述的小肽螯合铜复合物的制备方法，其特征在于所述水溶性铜盐为碱式氯化铜、硫酸铜和氯化铜中的至少一种。
10.权利要求I 9任一项的方法制备得到的小肽螯合铜复合物作为饲料添加剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小肽螯合铜复合物的制备方法与应用。制备方法包括如下步骤将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；将芽孢菌和蛋白酶接到培养液中，发酵酶解或酶解发酵，得到小肽发酵液；继续加入水溶性铜盐，控制反应温度在55～65℃，pH为5～6，螯合反应；将反应物干燥，得到小肽螯合铜复合物。本发明小肽螯合铜制备方法的螯合率高，达到94%以上，所得到的小肽螯合铜复合物在动物胃内的稳定性好，并含有多种生物活性成分，营养更加全面，可用作饲用添加剂，补充日粮的微量元素，提高动物体的免疫机能。
文档编号C12R1/125GK102827910SQ20121027295
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者潘军, 张伟强, 王瑞平, 苏全, 马春平 申请人:广州市博善生物饲料有限公司