专利名称：一种提高辣椒疫霉卵孢子产量及促进卵孢子萌发的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高辣椒疫霉卵孢子产量及促进卵孢子萌发的方法。
背景技术：
由辣椒疫霉引起的辣椒疫病以及番茄和南瓜等茄科和葫芦科作物上的疫病目前在亚洲、美洲、欧洲和澳洲普遍发生，在我国大部分省市也都有发生。由于辣椒疫病蔓延迅速，对寄主植物破坏性强，从苗期到结果期都可发病，严重危害了植株茎杆、叶片及果实并最终导致死苗和烂果乃至绝收，加之对于此类病害缺少抗病品种以及有效的农业栽培管理措施等原因，导致其危害逐渐加重并难以控制，目前已成为我国蔬菜生产中的重要病害。辣椒疫霉属于异宗配合病原卵菌，存在Ap A2两种交配型，在田间可发生有性生殖产生卵孢子。辣椒疫霉的卵孢子是由有性世代产生的具有厚壁的一种休眠有性孢子，在自 然界中可以抵抗不良环境，是辣椒疫霉越冬的主要方式。自然条件下，辣椒疫霉卵孢子形成后通常需要经过一段时间的休眠才能陆续萌发，但是在室内条件下，一些野生型菌株或诱导获得的突变体菌株卵孢子产生量少、萌发率低，给疫霉菌遗传学等相关研究带来了困难。遗传分析研究要求辣椒疫霉在室内培养条件下可以快速产生大量卵孢子，并能够同时萌发，以缩短试验周期并保障研究结果的准确性。对于疫霉卵孢子产生以及萌发的研究也有相关报道，但是同属不同种的疫霉菌株其卵孢子产生及萌发所需条件不同，且目前主要集中于对致病疫霉、苎麻疫霉、大豆疫霉、恶疫霉等卵孢子的产生以及萌发条件的研究，关于辣椒疫霉卵孢子的研究国内未见报道。建立一种简易、高效的诱导辣椒疫霉卵孢子大量产生及萌发的方法，是本领域亟待解决的一个技术问题，也为辣椒疫霉遗传学相关研究奠定了基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高辣椒疫霉卵孢子产量的方法。本发明所提供的提高辣椒疫霉卵孢子产量的方法，包括如下步骤用10%V8蔬菜汁培养基培养辣椒疫霉菌株，培养条件为黑暗。上述过程中，所述培养的时间为15天-60天，具体为45天-60天；所述培养的温度为25°C -28°C，具体为25°C。本发明的另一个目的是提供一种促进辣椒疫霉卵孢子萌发的方法。本发明所提供的促进辣椒疫霉卵孢子萌发的方法，包括如下步骤(I)将辣椒疫霉卵孢子在黑暗条件下培养15-45天；(2)用质量百分含量为O. 05%—O. 25%的高锰酸钾处理步骤(I)所得卵孢子；(3)将步骤(2)所得卵孢子在16h日光灯/8h黑光灯交替照射的条件下培养。上述过程中，所述步骤(I)中，培养的时间为15天、30天或45天；所述步骤(2)中，所述高锰酸钾的质量百分含量为O. 1% — O. 25%。上述过程中，所述步骤(2)中，所述高猛酸钾的质量百分含量为O. 1%或O. 25% ；
上述过程中，所述步骤(2)中，所述处理的方法为将所述卵孢子制成悬浮液，向悬浮液中加入高锰酸钾，超声处理20-40S。上述过程中，超声处理的时间具体为30s，超声的功率为250W，工作频率为40KHz。上述过程中，所述步骤(3)中，培养的时间为5天。上述过程中，所述步骤(3 )中，所述培养中使用的培养基是S+L培养基。具体制备方法为:卵磷脂 O. lg，基础培养液 IOml [MgSO4 · 7H20 IOOmg, (NH4) SO4 IOOmg, K2HPO4 60mg，CaCl2 ·2Η20 30mg, KH2PO4 30mg, ZnSO4 ·7Η20 3mg，蒸馏水 100ml]，葡萄糖 0. 04g，琼脂粉 14g，蒸懼水定容至1L。上述过程中，步骤I)中，培养所用的培养基为10%V8蔬菜汁培养基。上述过程中，所述步骤(I)和步骤(3)中，温度为25°C -28°C，具体为25°C。
上述过程中，在所述步骤(I)之前，包括如下步骤用权利要求I或2所述方法制备辣椒疫霉卵孢子。在室内条件下诱导辣椒疫霉产生大量的卵孢子，并且产生的卵孢子能够在同一时间大量萌发，对开展疫霉菌有性生殖后代的生物学遗传及变异研究以及疫霉菌遗传学相关研究都具有重要的意义。本发明为实现在短时间内诱导辣椒疫霉卵孢子大量产生及萌发提供了一种经济、简易和有效的方法，为获得大量辣椒疫霉单卵孢子群体用于抗药性或其它遗传学研究提供了保证。
图I为辣椒疫霉自交培养方法。图2为辣椒疫霉杂交对峙培养方法。图3为辣椒疫霉卵孢子萌发图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用辣椒疫霉菌株Sx-3、Sx-22、Ηχ-l和Sx_2在文献“崔晓岚，孟庆晓，毕扬等.辣椒疫霉对烯酰吗啉的敏感基线及室内抗药性突变体研究.植物病理学报.2009,39 (6) :630-637”中公开过，公众可从中国农业大学获得。下述V8汁均指V8蔬菜汁。实施例I、提高卵孢子产量一、培养基的筛选10%V8培养基V8蔬菜汁100ml，CaCO3 O. 2g，琼脂粉14g，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，121° C，20min，待冷却至40 50° C时，倒入灭菌培养皿中备用。SLA培养基β -谷甾醇20mg、卵磷脂500mg、CaCO3 O. 2g、天冬氨酸10mg、V8蔬菜汁100ml、琼脂2g和去离子水900ml。将卵磷脂置于50ml水中，用匀浆机(500r/min)匀浆3min,把卵磷脂充分打散，加入V8汁、CaCO3、琼脂，补足水至1000ml，将β -谷甾醇用少量(数毫升)二氯甲烷溶解后与培养基混合。天冬氨酸用少量的水溶解后单独分装于三角瓶内，121° C灭菌20min，待培养基降至50° C左右，将天冬氨酸溶液加入培养基中，摇匀倒入灭菌培养皿中备用。色氨酸培养基β -谷甾醇30mg、L_色氨酸20mg、CaCl2 lOOmg、维生素B1 Img> 10%的V8培养基1000ml。将β-谷留醇先溶于少量二氯甲烷中，后加入10%的V8培养基中，121° C灭菌20min，L-色氨酸和维生素B1混合后溶于少量水中，单独灭菌，在使用前待培养基降至50° C左右时加入，摇匀倒入灭菌培养皿中备用。辣椒疫霉自交产卵孢子产量的检测方法(如图I所示)将采自我国陕西的辣椒疫霉菌株Sx-3 (A2交配型)、Sx-22 (A1交配型)分别接种于上述10%V8培养基、SLA培养基或色氨酸培养基平板上，于25° C黑暗条件下培养5d，移去接种点的菌饼后使用瓶口直径为4cm的灭菌三角瓶，将长满菌丝的培养基打成直径4cm的菌饼，将菌饼以菌丝面朝上的方式移入1%水琼脂平板的中央，在菌丝面上覆一张灭菌的聚碳酸酯膜(47mm，孔径O. 2 μ m)，轻压此膜以排尽气泡使之与菌饼紧密接触，随后将同样大小的相对交配型菌株的菌饼以菌丝面朝下的方式置于聚碳膜上方，并与膜以及下方菌饼紧贴，使用封口膜封好后置于25° C黑暗条件下分别培养15d、30d、45d和60d后，计算辣椒疫霉卵孢子的产量。每个处理均有4个重复，结果取平均数。 结果如表I.表I辣椒疫霉Sx-22和Sx-3在不同培养基上自交产生卵孢子的量
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5 30 d 45 d _ J5d 30 d 45 cl 60 d 15d 30 d 45 i _ Sx-22 ndx I 23b 4.3b 5.4b nd nd 3,2a SJa ni 2,1 b 4.6b | 5.0b Sx-3 nd 5,4 ay 7J a TJ a nd 3.2 3_6 a 43 h nd 5.9 a 8,9 a 10,7 a Avmge — [ 4-2 5J 6J — .12 —2 M— 3J— — 4,0 6—8十 | 7.9 +表注xnd，未检测到；y使用Fisher的统计方法比较0. 05水平下菌株产生卵孢子量的差异显著性，相同字母代表没有显著性差异；z使用Fisher统计方法分析O. 05水平下菌株在其它培养基上产生卵孢子的量与在色氨酸培养基上产生量的差异显著性，+和-分别代表显著多于或是显著少于。表I表明，辣椒疫霉在不同培养基上产生卵孢子的量存在差异，从培养不同时间两株自交菌株产生的平均卵孢子量可以看出，除30d时10%V8培养基上产生卵孢子的量与色氨酸培养基上产生的量无显著性差异外，45和60d时10%V8蔬菜汁培养基上产生卵孢子的量都显著高于其他培养基。二、培养条件的筛选辣椒疫霉杂交卵孢子的产量将经过预培养的采自我国陕西以及河北的辣椒疫霉Hx-I (A1交配型)、Sx-2 (A2交配型)、Sx-3 (A2交配型)和Sx_22 (A1交配型)打取5mm大小的菌饼采用直接配对法即对峙培养的方法接于10%V8蔬菜汁培养基平板上(如图2所示)，试验设计为两两配对杂交，即Hx-I X Sx-2、Hx-I X Sx-3, Sx-22 X Sx-2和Sx_22 X Sx-3进行杂交培养，使用封口膜封好后分别置于25° C下24h黑暗和24h光照培养箱中培养，每个处理4次重复，分别于7d、15d、30d、45d和60d后计算卵孢子的产量。结果如表2。表2不同培养条件下4对辣椒疫霉杂交组合产生卵孢子的量
权利要求
1.一种提高辣椒疫霉卵孢子产量的方法，包括如下步骤用10%v8蔬菜汁培养基培养辣椒疫霉菌株，培养条件为黑暗。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述培养的时间为15天-60天，具体为45天-60天；所述培养的温度为25°C -28°C，具体为25°C。
3.一种促进辣椒疫霉卵孢子萌发的方法，包括如下步骤 (1)将辣椒疫霉卵孢子在黑暗条件下培养15-45天； (2)用质量百分含量为0.05%—0. 25%的高锰酸钾处理步骤(I)所得卵孢子； (3)将步骤(2)所得卵孢子在16h日光灯/8h黑光灯交替照射的条件下培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中，培养的时间为15天、30天或45天； 所述步骤(2)中，所述高锰酸钾的质量百分含量为0. 1% — 0. 25%。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述高锰酸钾的质量百分含量为0. 1%或0. 25%。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述处理的方法为将所述卵孢子制成悬浮液，向悬浮液中加入高锰酸钾，超声处理20-40S。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，培养的时间为5天。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(I)和步骤(3)中，温度为25°C -28°C，具体为25°C。
9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于在所述步骤(I)之前，包括如下步骤用权利要求I或2所述方法制备辣椒疫霉卵孢子。
全文摘要
本发明提供了一种提高辣椒疫霉卵孢子产量的方法及促进卵孢子萌发的方法。本发明提供的提高辣椒疫霉卵孢子产量和促进卵孢子萌发的方法，包括如下步骤用10%V8蔬菜汁培养基培养辣椒疫霉菌株，培养条件为黑暗，培养温度为25°C-28°C。将辣椒疫霉卵孢子在黑暗条件下保持15-45天；用质量百分含量为0.05%-0.25%的高锰酸钾处理卵孢子后，制备卵孢子悬浮液，将其涂在S+L培养基上16h日光灯/8h黑光灯交替照射的条件下诱导卵孢子萌发。本发明为实现在短时间内诱导辣椒疫霉卵孢子大量产生及萌发提供了一种经济、简易和有效的方法，为获得大量辣椒疫霉单卵孢子群体用于抗药性或其它遗传学研究提供了保证。
文档编号C12R1/645GK102807957SQ20121028443
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者刘西莉, 毕扬, 崔晓岚, 王茜, 李健强, 陈磊, 卢晓红 申请人:中国农业大学