专利名称：一种简单快速的肉鸭粪样总dna提取方法
技术领域：
本发明属于动物医学领域，特别涉及动物粪便中DNA的提取方法。
背景技术：
动物肠道中存在约30个属500多种不同的细菌，约I X IOltl个活细菌，形成了复杂而动态平衡的微生态系统，动物胃肠道内庞大多样的微生物群落与动物的健康和疾病有密切的联系，对宿主营养物质的消化、吸收及免疫机制激活、生长发育等都起着十分重要的作用。若这种微生态平衡失调，则动物机体正常的生理功能就会发生紊乱，导致疾病的发生、流行，对畜牧养殖业尤其是规模化养殖产生了极大的潜在威胁。因而，近年来对肠道微生物区系结构及其多祥性研究成为当前的热点，但由于肠道的特殊生存环境，使得肠道中
有60% -80%的微生物目前无法用传统的分离培养技术进行研究，从而阻碍了人们对肠道微生物结构及其多祥性的客观认识。迄今为止，肠道中只有极少部分微生物可以被培养，绝大多数还不为人所知。随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，肠道微生物的研究也深入到了基因和作用机制水平，人们能避开了传统菌的群分离培养过程，直接从DNA水平上对这些肠道菌群进行相关研究，从粪便样品中提取高质量的、具有代表性的肠道菌群总DNA是肠道微生物生态学研究的基础。但由于粪便不但组成成分复杂(含有多聚糖、胆酸、胆盐、胆色素、腐殖质、动物肠道脱落细胞及碎片、各种无机物和有机物等PCR的强抑制物)，而且粪便中细菌类型数目繁多，而不同细菌因其各自独特的细胞壁成分和结构，又对不同的提取方法的敏感程度有所差异，从而导致了不同方法的提取效率不尽相同，进而使得肠道菌群多祥性分析结果不尽如人意，甚至造成偏差。目前粪便样品总DNA并没有标准、统ー的提取方法，因而，选择较好的DNA提取方法对肠道微生态研究非常关键。目前，国内外常用的DNA提取方法主要包括机械法，如硅珠法、冻融法等；化学法，如SDS法、苯酚法等；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等和商业试剂盒法。这几种类型的DNA提取方法中，机械法、化学法及酶或其组合方法是实验室常规提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超声波或反复冻融来裂解细胞释放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、_■氧化娃等进行DNA的抽提，最后无水こ醇沉淀。这几种常规的提取方法的优点是原理清楚，便于分析及查找实验中出现的问题，而不足在于所提取的DNA纯度不高或者得率较低，常含有大量的PCR抑制物，除肠道菌基因组外，还掺杂动物细胞、食物残渣的基因组DNA及杂质，纯度不够理想，需要进ー步纯化处理才能用于后续的实验操作，如用蛋白酶K裂解粪便的同时还另外用十六烷基三甲基溴化铵来除去PCR反应抑制物，并且还用酚-氯仿进行了多次的抽提才得到较高纯度的总DNA ；在用蛋白酶K提取粪便样品总DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子来纯化所得到的总DNA。试剂盒法虽然操作简单、快捷、效率高，但所提总DNA浓度、得率低，价格较昂贵、处理大批样品的科研成本太高，缺乏实验室通用性，不适于用于大规模粪便样品总DNA提取。另外由于专利等其它原因，试剂盒中具体成分及其含量不是很清楚，如果发生操作失败，很难分析找出实验失败原因。因此，需要找到ー种新得能快速、高质、高效、廉价及无害提取具有代表性的肠道菌群总DNA的方法。
发明内容
本发明的目的之ー在于提供肉鸭粪样总DNA提取方法，操作简单、快速、高效、高质且价格经济能适于实验室大規模提取的新方法。本发明主要包括粪便样品的预处理、样品DNA提取、PCR及电泳。以采集新鲜粪便样品或冻存的粪便样品为材料，先用PBS缓冲液等对粪便样品进行预处理，以获得粪便样品菌悬液，再以20-50 μ I的Clelex-100和30 μ L的O. 15molEDTA溶液组成的混合液，共同裂解细胞释放DNA。为实现上述技术目的，本发明的技术方案为一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，具体包括以下步骤A预处理将肉鸭粪样用缓冲液浸泡不少于5分钟后，充分震荡均匀，得肉鸭粪样混悬液；将肉鸭粪便混悬液通过离心处理，去除杂质并收集沉淀物I ;离心时，可将细菌沉淀于Eppendorf管中，并通过重复离心，收集细菌沉淀I入灭菌的离心管中；B 洗涤在步骤A所得沉淀物I中加入缓冲液，离心并去除上清液，重复离心处理至上清液无异色，得沉淀物II;C 提取在沉淀物II中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混合液振荡混匀，45-60°C水浴9-60分钟；初次离心，弃上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低温下使DNA复性；再次离心，取上清液III，所述上清液 III。进ー步，在步骤A中，将肉鸭粪样用相当于其体积10倍的PBS溶液浸泡15分钟。进ー步，在步骤A中，离心处理的条件为4°C，10000转/分钟，离心至少6分钟。进ー步，在步骤B中，在所述沉淀物I中加入PBS溶液，沉淀物I与PBS溶液的添加比例为每200-300mg沉淀物I添加ImLPBS溶液。进ー步，在步骤B中，离心处理的条件为10000转/分钟离心至少3分钟。进ー步，在步骤C中，在沉淀物II中加入与步骤B所述缓冲溶液等量的蒸馏水，重悬并离心，离心条件为10000转/分钟离心不少于3分钟。进ー步，在步骤C中，所述混合液中蛋白酶K和EDTA溶液的体积比3 2，所述蛋白酶K的初始浓度为20mg/ml，所述EDTA溶液的初始浓度为O. 15moL。进ー步，在步骤C中，所述初次离心的条件是4°C，12000转/分钟离心10分钟。进ー步，所述蛋白酶K和所述EDTA溶液的体积比为3 2，所述沉淀物II与所述蛋白酶K的体积比为I 10-20 ;所述裂解液为Clelex-100，Clelex-100与EDTA溶液的体积比为20-50 30，所述沉淀III和所述Clelex-100的体积比为I 10-20，所述EDTA溶液的浓度为O. 15mol/L，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。进一歩，将步骤C所得上清液III中DNA为模板，其上游引物为5’ -aacgcgaagaaccttac-3’，其下游引物为5’ -gcgtgtgtacaagaccc-3’，PCR 的反应条件预变性，94°C，5min ;变性，94°C 45s ;退火，56°C 45s ;延伸，72°C 45s，循坏 33 次；最后 72°C延伸IOrnin0本发明已进行了广泛的比较研究，通过分析所得粪便总DNA的浓度、纯度、得率及16SrDNA全长扩增结果表明，本发明所得的DNA片段较完整、大小约为500bp，浓度、纯度、得率高，所得DNA可直接作为PCR扩增的模板，以及粪便微生态学等方面的研究。本发明简单方便，产量、得率和浓度及纯度高且价格便宜。
图I为本发明提取的DNA电泳检测图图中编号1-3为重复3次平行提取的粪便总DNA ;编号4-6为常规酚氯仿法提取的粪便总DNA ;编号7-9为试剂盒法提取的粪便总DNA ；编号10为标准品；上样量均为5 μし其中M为Marker DL-2000,分子量标准从下至上依次为 IOObp,250bp,500bp,750bp,IOOObp,2000bp。
具体实施例方式本发明方法提取肉鸭粪便样品总DNA。实验所用样品为采集的麻鸭的粪便，所采集的粪便样品于_20°C下保存，备用。实施例II预处理称取备用的粪便样于ー无菌的离心管A中，用10倍体积的PBS浸泡15分钟；在实践操作中，浸泡时间在不少于5分钟，或用其它缓冲液替代PBS，均可实现除杂质及离心分离的功能。浸泡完成后，于漩涡振荡器上振荡混匀，充分悬浮清洗菌体；混匀的悬液于4°C，500转/分钟后，离心10分钟，去除粗颗粒(低速离心的目的在于去除粪便中的粗颗粒，除了离心之外，也可以采用如过滤等其它方式去除粗颗粒杂质)，将去除粗颗粒后的液体于另ー只50mL灭菌离心管内B中；之后，4°C，10000转/分钟，离心6分钟，收集沉淀物I于Eppendorf管中。通过重复离心，从保存的粪便样品中转移200-300mg离心后的细菌沉淀入2mL灭菌的离心管中。2 洗涤 在所得沉淀物I加入ImL PBS,振荡15秒混匀，10000转/分，离心3分钟，倾去上清，得沉淀物II。重复此步骤至上清无异色。在沉淀物I中添加其它的缓冲溶液并通过其它离心条件也可达到对沉淀物的洗涤作用。在沉淀物II中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混合液振荡混匀，45-60°C水浴9-60分钟；初次离心，弃上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低温下使DNA复性；再次离心，取上清液III，所述上清液 III。3 提取在沉淀物II中加入ImL双蒸水，振荡混匀，10000转/分钟离心3分钟，倾去上清，重复此步骤I次；取出离心管，10000转/分钟离心5分钟后，吸取上清液II 450 μ L至另ー 2mL离心管中；加入30 μ L初始浓度为O. 15moL的EDTA溶液，20 μ L蛋白酶K(初始浓度为20mg/mL)(蛋白酶K和沉淀物II的体积比为10-20 I的范围内均可实现)，振荡混匀，55°C水浴消化，经实验证实，O. 15-1小时均可实现水浴消化的效果；4°C，12000转/分钟离心10分钟，弃上清，得沉淀III，沉淀III可用于总DNA的提取；在沉淀III中加裂解液Clelex-100 (20-50 μ L均可，裂解液Clelex-100与沉淀III的体积比为10-20 I的范围内均可实现，优选15 I)，和30 μ L初始浓度为O. 15moL的EDTA溶液，浸没沉淀III。置于冰上3分钟，使DNA复性。离心2分钟，取上清，-20°C保存。测DNA含量备用。申请人:用本发明对同一肉鸭粪便样品进行了 3次的重复提取实验，如图I所示，结果表明本发明方法的多次重复提取的实验效果基本一致，这说明该发明方法非常地稳定，适用于肉鸭粪便总DNA的大規模提取。实施例2对实施例I提取的DNA进行16SrDNA的PCR扩增检测。应用本实施例2提 取的 DNA 作为模板，以设计的引物U968f :5’ -aacgcgaagaaccttac-3 和 L1401r 5’ -gcgtgtgtacaagaccc-3’，扩增粪便微生物16SrDNA V3区。利用常规方法、试剂盒法和本发明的方法制备的粪便总DNA IyL作PCR反应的模板，分别扩增粪便微生物的16SrDNAV3区。50 μ L PCR反应体系组成如下
权利要求
1.一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤 A预处理 将肉鸭粪样用缓冲液浸泡不少于5分钟后，充分震荡均匀，得肉鸭粪样混悬液，将肉鸭粪便混悬液通过离心处理,去除杂质并收集沉淀物I ; B洗涤 在步骤A所得沉淀物I中加入缓冲液，离心并去除上清液，重复离心处理至上清液无异色，得沉淀物II ； C提取 在沉淀物II中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混 合液振荡混匀，45-60°C水浴9-60分钟；初次离心，弃上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低温下使DNA复性；再次离心，取上清液III，所述上清液111中含有总DNA。
2.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤A中，将肉鸭粪样用相当于其体积10倍的PBS溶液浸泡15分钟。
3.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤A中，离心处理的条件为4°C，10000转/分钟，离心至少6分钟。
4.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤B中，在所述沉淀物I中加入PBS溶液，沉淀物I与PBS溶液的添加比例为每200-300mg沉淀物I添加ImLPBS溶液。
5.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤B中，离心处理的条件为10000转/分钟离心至少3分钟。
6.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤C中，在沉淀物II中加入与步骤B所述缓冲溶液等量的蒸馏水，重悬并离心，离心条件为10000转/分钟离心不少于3分钟。
7.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤C中，所述混合液中蛋白酶K和EDTA溶液的体积比3 2，所述蛋白酶K的初始浓度为20mg/ml，所述EDTA溶液的初始浓度为0. 15moL。
8.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤C中，所述初次离心的条件是4°C，12000转/分钟离心10分钟。
9.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，在步骤C中，所述蛋白酶K和所述EDTA溶液的体积比为3 2，所述沉淀物II与所述蛋白酶K的体积比为I 10-20 ;所述裂解液为Clelex-100, Clelex-IOO与EDTA溶液的体积比为20-50 30，所述沉淀III和所述Clelex-100的体积比为I 10-20，所述EDTA溶液的浓度为0. 15mol/L，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
10.根据权利要求I所述的一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，其特征在于，将步骤C所得上清液III中DNA为模板进行PCR扩增，其上游引物为.5，_aacgcgaagaaccttac_3，，弓 1. :5，_gcgtgtgtacaagaccc_3，。
全文摘要
本发明属于动物医学领域，特别涉及动物粪便中DNA的提取方法，具体为将肉鸭粪样用缓冲液浸泡并震荡均匀，去除杂质，收集沉淀物I，加入缓冲液，离心并去除上清液，离心处理至上清液无异色，得沉淀物II；在沉淀物II中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA混合液振荡混匀水浴；离心，弃上清液，得沉淀III；在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低温下使DNA复性；离心取上清液III，所述上清液III中含有总DNA；本发明所得的DNA片段较完整、大小约为500bp，浓度、纯度、得率高，所得DNA可直接作为PCR扩增的模板，以及粪便微生态学等方面的研究。本发明简单方便，产量、得率和浓度及纯度高且价格便宜。
文档编号C12N15/10GK102851277SQ20121033008
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者杨金龙, 刘作华, 黄勇, 付利芝, 彭祥伟, 郑华, 沈克飞, 杨睿, 张素辉 申请人:重庆市畜牧科学院