专利名称：一种辅助鉴定具有绿子叶性状大豆的方法
技术领域：
本发明涉及ー种辅助鉴定具有绿子叶性状大豆的方法。
背景技术：
大豆[Glycine max (L. ) Merr.]作为世界上最重要的经济作物之一，是人类蛋白质和脂肪的重要来源，在食品、饲料、エ业上具有广泛的用途。大豆种子的子叶顔色分为黄、绿两色。我国大豆种质资源丰富，但是具有绿子叶性状的大豆种质资源较少，仅占2. 77%。随着经济水平的提高，膳食结构的调整，人们对大豆的需求正逐步趋向多元化、多用途的方向发展，绿子叶大豆以其独特的外观品质及特殊的食用、加工特性正逐步受到人们的关注及加工企业的青睐。因此，加快绿子叶大豆种质资源的利用和新品种的选育，成为大豆遗传 育种工作中的重要研究内容之一。常规育种是通过性状的表现型间接对基因型进行选择，这种选择方法虽然可行，但是由于目的基因位点有纯合和杂合之分，需要多年自交鉴别，故育种年限较长。近年来，随着分子标记技术的发展，分子标记辅助育种和分子设计育种等现代育种技术应运而生，使人们能够直接对基因型进行选择，选择结果更加客观、准确，大大提高育种的效率和缩短育种的年限。因此，利用分子标记技术对选择性状进行分子标记，是分子标记辅助育种和分子设计育种等工作的基础，同时主要农艺性状分子标记的获得，对于控制该性状基因的研究也具有十分重要的理论和实际意义。SSR (Simple Sequence Repeat)标记是一种操作简便的分子标记,属于显性标记，在基因组中分布平均、多态性高、结果准确，在许多农作物的遗传多样性研究、分子标记、基因定位和分子标记辅助育种等方面广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供ー种辅助鉴定具有绿子叶性状大豆的方法。本发明提供了ー种辅助鉴定具有绿子叶性状大豆的方法(方法甲)，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt408引物对进行PCR扩增；如果所述PCR扩增在180-220bp区间内只得到了 190bp±5bp的产物，待测大豆为候选的具有绿子叶性状的大豆；如果所述PCR扩增在180-220bp区间内没有得到190bp±5bp的产物，或所述PCR扩增在180-220bp区间内除了得到190bp±5bp的产物还得到了 190bp±5bp以外的产物，待测大豆为候选的不具有绿子叶性状的大豆；所述Satt408引物对由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所不的单链DNA分子组成。本发明还提供了所述Satt408引物对在辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆中的应用。本发明同时提供了所述Satt408引物对在制备辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的试剂盒中的应用。所述Satt408引物对或所述方法(方法甲)可用于筛选具有绿子叶性状的大豆。
所述Satt408引物对或所述方法(方法甲)可用于绿子叶性状大豆的育种，即将所述方法鉴定为的绿子叶性状大豆用于育种。在方法甲的基础上，本发明还提供了另ー种准确度更高的辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的方法(方法こ)，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，分别用Satt408引物对和Sattl29引物对进行PCR扩增；如果同时满足特定条件甲和特定条件こ，待测大豆为候选的具有绿子叶性状的大豆；如果不同时满足特定条件甲和特定条件こ，待测大豆为候选的不具有绿子叶性状的大豆；所述特定条件甲如下采用Satt408引物对进行PCR扩增时，在180-220bp区间内只得到了 190bp±5bp的产物；所述特定条件こ如下采用Sattl29引物对进行PCR扩增时，在120-160bp区间内只得到了 130bp±5bp的产物；所述Satt408引物对由序列表的序列I所不的单链DNA分子和序列表的序列2所不的单链DNA分子组成；所述Sattl29引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子組成。本发明还保护所述Satt408引物对和所述Sattl29引物对在辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆中的应用。本发明还保护所述Satt408引物对和所述Sattl29引物对在制备辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的试剂盒中的应用。引物组合物或所述方法(方法こ)可用于筛选具有绿子叶性状的大豆；所述引物组合物由所述Satt408引物对和所述Sattl29引物对组成。所述引物组合物或所述方法(方法こ)可用于绿子叶性状大豆的育种，即将所述方法鉴定为的绿子叶性状大豆用于育种。本发明还保护ー种辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的试剂盒，包括所述Satt408引物对。所述试剂盒还可包括所述Sattl29引物对。本发明提供的方法中，利用分子标记鉴定植株幼苗中是否存在绿子叶基因，同时 可鉴定出控制子叶的基因型，进而推断植株将产生何种颜色的子叶，其后代是否会发生子叶顔色分离，对育种具有重大价值。本发明可应用于绿子叶品种的分子标记辅助育种和分子设计育种，能够大大減少田间选择的工作量、缩短育种年限。同时由于所获得的绿子叶的分子标记Satt408_19(lbp标记和Sattl29_13(lbp标记与绿子叶基因之间的遗传距尚只有2. IcM,可利用该标记对绿子叶基因进行进一歩深入研究。
图I为Satt408引物对在部分‘科丰14’ X ‘丹豆6号’的F2代分离群体中的PCR扩增电泳图；1 ‘科丰14’ ；2 ‘丹豆6号’ ；3-12 F2代分离群体中的黄子叶单株；13-20 F2代分离群体中的绿子叶单株。图2为Sattl29引物对在部分‘科丰14’ X ‘丹豆6号’的F2代分离群体中的PCR扩增电泳图；1 ‘科丰14’ ；2 ‘丹豆6号’ ；3-13 F2代分离群体中的黄子叶单株；14-20 F2代分离群体中的绿子叶单株。图3为实施例2中采用Satt408引物对时部分样本的PCR扩增电泳图；1 ‘科丰14’ ；2 ‘丹豆6号’ 3-10 :黄子叶性状大豆(依次为中黄4号、中黄7号、中黄10号、中黄14号、中黄18号、中黄27号、中品662、中品661) ；11-20绿子叶性状大豆(依次为T41、PI157416、黑皮青瓤、大青仁、鲁庄大黑豆、开江黑豆、仙游绿心豆、7904、L62-1027、L69-4663)。图4为实施例2中采用Sattl29引物对时部分样本的PCR扩增电泳图；1 ‘科丰14’ ；2 ‘丹豆6号’ 3-10 :黄子叶性状大豆(依次为中黄4号、中黄7号、中黄10号、中黄14号、中黄18号、中黄 27号、中品662、中品661) ; 11-18绿子叶性状大豆(依次为T41、PI157416、黑皮青親、大青仁、鲁庄大黑丑、开江黑丑、仙游绿心丑、7904)。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例I、辅助鉴定大豆绿子叶性状的SSR引物对及相应分子标记的发现以黄子叶大豆品种‘科丰14’为母本，绿子叶大豆品种‘丹豆6号’为父本，进行杂交，获得Fl代，Fl代自交，获得子叶顔色性状分离的F2代种子。F2代种子的子叶顔色分析表明，黄子叶和绿子叶种子的比例分别为5968粒1957粒，为3:1，符合经典遗传学I对基因分离规律，证实为黄/绿子叶性状由I对基因控制，黄子叶对绿子叶为显隐性关系。选取同I株Fl植株上收获的子叶顔色分离的F2代种子，总粒数为246粒，具有黄子叶的187粒，具有绿子叶的59粒，黄、绿分离比为3. 17 :1，接近3 :1，经卡平方检测，X2=0. 1348 < X20.05jl = 3. 84，符合由I对显性基因控制的3黄I绿的理论比例。将F2代种子按照子叶顔色分别种植，获得123个F2代单株的幼苗(102株为黄子叶、21株为绿子叶；部分种子没有出苗)。分别提取F2代单株幼苗的基因组DNA，利用集群分离分析法(BulkedSegregant Analysis, BSA),以大豆SSR引物对为DNA扩增反应的引物，筛选与绿子叶性状(基因)紧密连锁的分子标记。经PCR扩增和扩增产物的凝胶电泳，在840对SSR弓丨物的筛选结果中，有2对SSR引物(Satt408引物对和Satt129引物对)在绿子叶幼苗的DNA中能够各自扩增出I条特异的DNA片段，分子量分别为190bp±5bp和130bp±5bp (部分结果见图I和图2)。Satt408引物对(该引物对的退火温度为60°C，靶序列位于Dla染色体位点)对于具有绿子叶性状大豆的特异性靶序列为190bp±5bp，将该特异性靶序列命名为Satt408_19一标记。Satt408引物对对于具有黄子叶性状且黄子叶基因为纯合型的大豆的特异性靶序列为210bp±5bp。Satt408引物对对于具有黄子叶性状且黄子叶基因/绿子叶基因为杂合型的大豆来说，同时具有上述两种特异性靶序列。Sattl29引物对(该引物对的退火温度为60°C，靶序列位于Dla染色体位点)对于具有绿子叶性状的大豆的靶序列为130bp±5bp，将该特异性靶序列命名为Sattll29_13(lbp.记。Sattl29引物对对于具有黄子叶性状且黄子叶基因为纯合型的大豆的特异性靶序列为145bp±5bp。Sattl29引物对对于具有黄子叶性状且黄子叶基因/绿子叶基因为杂合型的大豆来说，同时具有上述两种特异性靶序列。同吋，收获F2代植株产生的种子，分析每个植株种子子叶的顔色，确定每个植株子叶的基因型，并与分子标记測定的基因型比较。表I为试验材料中各个单株实际的基因型及SSR引物Satt408和Sattl29扩增产生的分子标记带型统计表。Satt408列中，A表示采用Satt408引物对扩增仅具有与‘科丰14’具有相同的带型，B表示采用Satt408引物对扩增仅具有与‘丹豆6号’具有相同的带型，H表示采用Satt408引物对扩增同时具有‘科丰14’和‘丹豆6号’的带型，-表示采用Satt408引物对扩增不具有‘科丰14’的带型且不具有‘丹豆6号’的带型。Sattl29列中，A表示采用Sattl29引物对扩增仅具有与‘科丰14’具有相同的带型，B表示采用Sattl29引物对扩增仅具有与‘丹豆6号’具有相同的带型，H表示采用Sattl29引物对扩增同时具有‘科丰14’和‘丹豆6号’的带型，-表示采用Sattl29引物对扩增不具有‘科丰14’的带型且不具有‘丹豆6号’的带型。因为黄色子叶相对绿色子叶为显性，且单株中可能发生了标记位点交換,如果Satt408列和Sattl29列中至少有ー个为H且子叶性状为黄色，基因型填写为H，如果子叶性状为绿色、基因型填写为B，如果Satt408列和Sattl29列均为A且子叶性状为黄色，基因型填写为A。表1F2代分离群体中各个单株的实际子叶基因型及Satt408和Satt129扩增产生的分子标记带型统计
权利要求
1.一种辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt408引物对进行PCR扩增；如果所述PCR扩增在180_220bp区间内只得到了 190bp±5bp的产物，待测大豆为候选的具有绿子叶性状的大豆；如果所述PCR扩增在180-220bp区间内没有得到190bp±5bp的产物，或所述PCR扩增在180_220bp区间内除了得到190bp±5bp的产物还得到了 190bp±5bp以外的产物，待测大豆为候选的不具有绿子叶性状的大ii ;所述Satt408引物对由序列表的序列I所不的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。
2.Satt408引物对在辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆中的应用；所述Satt408引物对由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。
3.Satt408引物对在制备辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的试剂盒中的应用；所述Satt408引物对由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。
4.Satt408引物对或权利要求I所述的方法在筛选具有绿子叶性状的大豆中的应用；所述Satt408引物对由序列表的序列I所不的单链DNA分子和序列表的序列2所不的单链DNA分子组成。
5.一种辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，分别用Satt408引物对和Sattl29引物对进行PCR扩增；如果同时满足特定条件甲和特定条件乙，待测大豆为候选的具有绿子叶性状的大豆；如果不同时满足特定条件甲和特定条件乙，待测大豆为候选的不具有绿子叶性状的大豆； 所述特定条件甲如下采用Satt408引物对进行PCR扩增时，在180-220bp区间内只得到了 190bp±5bp的产物； 所述特定条件乙如下采用Sattl29引物对进行PCR扩增时，在120-160bp区间内只得到了 130bp±5bp的产物； 所述Satt408引物对由序列表的序列I所不的单链DNA分子和序列表的序列2所不的单链DNA分子组成；所述Sattl29引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。
6.Satt408引物对和Sattl29引物对在辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆中的应用；所述Satt408引物对由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述Sattl29引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。
7.Satt408引物对和Sattl29引物对在制备辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的试剂盒中的应用；所述Satt408引物对由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述Sattl29引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。
8.引物组合物或权利要求5所述的方法在筛选具有绿子叶性状的大豆中的应用；所述引物组合物由Satt408引物对和Sattl29引物对组成；所述Satt408引物对由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述Sattl29引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。
9.一种辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的试剂盒，包括Satt408引物对；所述Satt408引物对由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子組成。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括Sattl29引物对；所述Sattl29引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定具有绿子叶性状的大豆的方法。本发明提供的方法包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt408引物对进行PCR扩增；如果在180-220bp区间内只得到了190bp±5bp的产物，待测大豆为候选的具有绿子叶性状的大豆；如果在180-220bp区间内没有得到190bp±5bp的产物，或在180-220bp区间内除了得到190bp±5bp的产物还得到了190bp±5bp以外的产物，待测大豆为候选的不具有绿子叶性状的大豆；Satt408引物对由序列1和2所示的单链DNA分子组成。本发明的方法中利用分子标记鉴定植株幼苗中是否存在绿子叶基因，进而推断植株将产生何种颜色的子叶，其后代是否会发生子叶颜色分离，对育种具有重大价值。
文档编号C12Q1/68GK102851367SQ20121033029
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者谢皓, 陈学珍, 倪资园, 郭蓓, 杨柳, 张娇, 薛树鹏, 郭远 申请人:北京农学院