专利名称：一种在植物柱头和花托特异性表达β-D-葡糖醛酸酶基因的方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域中一种柱头和花托特异表达的植物启动子及其应用，特别涉及一段来源于拟南芥CiraAiiZoASi1S thaliana、一果胶酶基因(AtIgl7150、启动子及其应用。
背景技术：
基因表达的时间与水平对生物的发育极其重要，而基因表达的调控包括反式作用因子与顺式调控元件的特异性结合从而启动转录起始，进而使基因得到时空性表达。启动子是基因的一段DNA序列，它通常位于结构基因的5’端，可以被RNA聚合酶识别、结合并启始转录。根据启动子的转录模式可以将其分为三类组成性启动子(即能使调控基因在所有组织或器官中均表达)；组织特异性启动子(即使调控基因仅在特定组织或器官中表达)；诱导性启动子(即仅在内外环境刺激诱导条件下才能调控下游基因表达)。可见，启动子是影响基因表达效率的重要因素之一。在植物中，由于组织特异性启动子所指导的基因仅在特定发育时空表达，这就是目的基因产物仅在某一空间累积，增加区域表达量，避免了植物营养的不必要浪费。因而在现代植物分子遗传工程中，组织特异性启动子的应用范围愈来愈广。如叶片特异表达启动子 RbcS (EMBO J. 1990，9:1717-1726)，CahiEMBO J. 1996，15:3732-3743)，WL21 (MoI Cell Biol. 1993，13:2614-2622)等；维管束特异性启动子 GRPl. 8 O0ZafliCell. 1991，10:1051-1061)，Pal2 O0Zafli /· 1995，6:859-876)，0sgrp-2 O0Zaflia.2003，216:824-833)等；果实特异性启动子 EAO0Zafli1992，100:2013-2017)，m (Plant Mol Biol. 1998，37:1001-1011), Q{Plant Mol Biol. 1995，28:423-435)和 SAllG0Zafli Mol Biol. 1993，21:625-640)等；根特异性启动子 TobRB7 O0Zafli Cell.1991，3:371-382);花药、花粉特异性启动子 TA29 O0Zafli Cell. 1990, 2:1201-1224)，QAOiPlant Mol Biol. 2001，45:577-585)，Lat^2 {Plant Mol Biol. 1998，37:859-869)等；韧皮部特异性启动子PP2 {Transgenic Res. 2004, 13:559-566)等；种子特异性启动子 GluB-IO0Zafli J. 2000，23:415-421)，PBFO0Zafli Cell Phyisol. 2004，45:1509-1518)等。植物花器官及荚果是植物繁殖的重要器官，因此寻找该部位特异性表达的启动子对于基因功能研究和转基因育种都具有重要的作用。本发明提供一种新的植物启动子，所述启动子能够调控目的基因在植物柱头和花托处表达，并且该活性一直持续到荚果的整个发育期。
发明内容
本发明目的在于提供拟南芥一果胶酶基因的启动子序列(SEQ IDNo. I),以及该序列在植物基因工程中用于柱头和花托特异性表达的用途，为后续基础和应用研究奠定基础。本发明从拟南芥中克隆了果胶酶A2g7775 基因启动子序列(SEQ ID NO. 1)，并研究了该序列调控β-D-葡糖醛酸酶Wtt )基因的表达。本发明公开了一种在植物柱头和花托特异性表达β -D-葡糖醛酸酶基因的方法，是将拟南芥一果胶酶J775 基因启动子DNA片段克隆到历fldIII和双酶切的双元表达载体PBI121中，构建启动子表达载体P::⑶S，将构建好的表达载体P::⑶S转入农杆菌，取含表达载体P: GUS的农杆菌转化拟南芥。本发明还公开了拟南芥一果胶酶基因的启动子在植物柱头和花托处特异表达β-D-葡糖醛酸酶基因中的应用。
本发明提供所述的基因的启动子在转基因植物中能使目的基因在植物柱头和花托特异性表达的用途，该活性一直持续到荚果的整个发育期。所述的植物优选为拟南芥。所述的目的基因优选为基因。实验证明，本发明的DNA片段是一启动子，该启动子具有特异的表达活性，特异在植物柱头和花托表达，并且该活性一直持续到荚果的整个发育期。本发明启动子为特异表达的基因功能研究及植物转基因育种提供了有利工具，具有重要意义。
图I为PCR克隆扩增得到的启动子片段，P (启动子)，M (分子量标准物):DL2000 ； 图2为构建的启动子表达载体(P: :GUS)结构示意图。图3为P: AUS转基因拟南芥植株花器官⑶S组织化学染色图。图4为P: AUS转基因拟南芥植株荚果⑶S组织化学染色图。
具体实施例方式实施例I :全长启动子克隆与中间载体构建
以拟南芥thaliana, Columbia ecotype)叶片为材料，用 CTAB 法(.EMBO J 1987, 6:3901-3907)提取植物总DNA。以植物总DNA为模板，通过特异引物扩增果胶酶J tlgl725 基因的启动子片段。合成引物primer-Ι (5 ’ - AAGCTTGTATACAGGTTTTAGTAGTTGAT-3’，SEQ ID NO. 2,引入了 ZffndIII 位点)、和 primer-2 (5，-GGATCCAATGCACGGCGCCATCTTCTTCT -3’，SEQ ID NO. 3，引入了汉·ΗΙ 位点)。扩增出 581bp启动子片段(命名为P)(图I)。PCR产物P直接与pGEM-T (购自Promega公司)克隆载体连接，转化DH5a大肠杆菌感受态菌株，筛选阳性克隆(内含有启动子片段P)。实施例2 =GUS融合表达载体的构建
用限制性酶VifldIII和双酶切实施例I中的阳性克隆及双元表达载体PBI121(北京天恩泽基因科技有限公司)，将酶切后的全长启动子及缺失启动子片段分别与PBI121酶切片段连接，构建启动子表达载体(P: :GUS)(图2)，分别把它们转化到DH5 a大肠杆菌感受态菌株中，进行扩繁。实施例3 :农杆菌转化
将构建好的表达载体(P::⑶S)转入农杆菌宿主细胞EHA10国家微生物资源库(产品ID为20110114049)中。具体方法如下构建的表达载体(P::⑶S)大肠杆菌菌株接种到IOml含Km (50 μ g/ml) LB液体培养基中，37°C过夜培养后，提质粒，为后续转化农杆菌备用。EHA105农杆菌菌株接种5ml含Sm (50μ g/ml)YEP液体培养基中，28°C下200rpm培养48小时。离心收集菌体，用O. IM冰冻CaCl2重悬，冰上放置20分钟后，4°C下5000rpm离心2分钟，收集的菌体用200 μ I O. IM冰冻CaCl2悬浮。然后加入制备好的表达载体质粒(P:⑶S)，冰上放置20分钟，_70°C放置10分钟，37°C放置5分钟后加入800 μ I不含抗生素的YEP液体培养基，28°C培养4小时后，离心收集菌体，用玻璃涂棒涂布与含有Km(50 μ g/ml)和Sm (50μ g/ml)的YEP固体培养基平板上，28°C培养2天。用特异性引物(primer-1/primer-2)对菌落进行PCR鉴定,筛选阳性克隆。实施例4 :拟南芥转化及鉴定
取含表达载体(P::⑶S)的农杆菌(实施例3中已构建)菌液20μ1，加入5ml YEP, 28 °C恒温振摇过夜，将此5ml菌液倒入250ml含Km (50 μ g/ml)和Sm (50 μ g/ml)的YEP液体培养基中，28°C恒温振摇过夜，农杆菌的浓度应达到0D600=1. 8时，4000rpm离心15分钟， 弃去上清，加入浸润培养基(l/2MS+5%蔗糖)，重悬后，加入表面活性剂Silwet-L77，使其终浓度达到O. 02%。将拟南芥植株的花序浸没在菌液中，浸润持续2min，用保鲜膜覆盖过夜后揭膜。正常生长，收取种子。种子晾干后先用70%乙醇消毒10分钟，再用10次氯酸钠消毒5分钟，最后用灭菌水冲洗5编。将灭菌好的拟南芥种子点在MS固体培养基(含30 μ g/ml Km抗生素)上，25°C人工气候箱内培养，光照16小时/黑暗8小时，2_3周后叶片发绿且根伸长的即为疑似转基因植株。对这些植株提基因组DNA，用⑶S特异引物(上游引物5’ -GATGTCACGCCGTATGT-3’，SEQ ID NO. 4 和下游引物 5’ -CACACTCTGTCTGGCT-3’，SEQ IDNO. 5) PCR扩增进行进一步验证。选择阳性苗，放于人工气候箱内培养。实施例5:⑶S活性检测
取实施例4中的阳性苗各器官(如花、叶、根、茎等)，分别置于GUS染色液(50mM磷酸缓冲液；5mM铁氰化钾；5mM亚铁氰化钾；IOmMEDTA ；lmM X-Gluc)中，37°C温育5小时，样品经75%乙醇脱水后观察照相，如图3 (花)，图4 (荚果)。在其它组织器官均未观察到GUS活性。
权利要求
1.一种在植物柱头和花托特异性表达β-D-葡糖醛酸酶基因的方法，是将拟南芥一果胶酶基因启动子DNA片段克隆到历/7dIII和双酶切的双元表达载体PBI121中，构建启动子表达载体P::⑶S，将构建好的表达载体P::⑶S转入农杆菌，取含表达载体P: :GUS的农杆菌转化拟南芥。
2.拟南芥一果胶酶基因的启动子在植物柱头和花托处特异表达β-D-葡糖醛酸酶基因中的应用。
全文摘要
本发明涉及在植物柱头和花托特异性表达β-D-葡糖醛酸酶基因的方法，是将拟南芥一果胶酶(At1g17150)基因启动子与目的基因构建成表达盒，然后通过农杆菌转化到拟南芥中。实验证明，本发明的启动子具有特异表达活性，特异的在植物柱头和花托处表达，并且该表达活性一直持续到荚果的整个发育期。本发明启动子为植物的转基因育种及特异表达的基因功能研究提供了有利的工具，具有重要的应用和基础研究意义。
文档编号C12N15/82GK102864166SQ20121032901
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者曹军, 刘海军, 石峰 申请人:江苏大学