专利名称：等温核酸扩增反应试剂及等温核酸扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种等温核酸扩增的技术，具体是一种利用大肠杆菌解旋酶RecQ蛋白、UvsY蛋白、UvsX蛋白和重组Klewnow exo_聚合酶等实现非PCR仪器依赖性的高灵敏度核酸扩增技术。
背景技术：
利用聚合酶链式反应(英文全称Polymerase Chain Reaction,简称PCR)进行核酸体外扩增是1983年以来发展起来的一项革命性技术，目前已被广泛运用于现代化的农业和医学以及食品工业等领域。通过这一技术，可以实现微量核酸的高效扩增，将极少量的特异核酸序列分子扩增到仪器可以检测到的水平。PCR由变性一退火(复性)一延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热至90-95°C—定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55-60°C，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75°C，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。利用PCR技术，可以对一些转基因植物进行阳性筛选通过对各种插入功能基因的特有片段的扩增，可以判断植株是否是阳性转化植株，得到其是否携带功能基因的信息，从而进行下一步一对其功能的鉴定。常规的核酸体外扩增技术(PCR技术)，由于需要使用昂贵的PCR仪器和消耗大量电力，其成本和应用范围均受到一定限制。随着恒温体外核酸扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如TMA技术(转录介导的核酸扩增技术)、SDA技术(链置换核酸扩增技术)、LAMP (环介导核酸扩增技术)、HDA (解旋酶依赖等温核酸扩增技术)等均可在等温条件下扩增DNA。这些技术只需要温度控制装置来保持一个反应温度，即60-65°C，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖。若能在更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能在更低的温度条件下，特别是在室温条件下，能实现核酸扩增，并且特异性和/或灵敏度更高的核酸等温扩增技术。本申请的发明人通过研究发现RecQ蛋白、UvsY蛋白和UvsX蛋白可在等温条件下使模板双链解旋、稳定单链并使引物和模板之间发生链替换，从而能够替代传统PCR的变性(94度)和退火(50-60度)步骤，同时，在DNA聚合酶的催化下合成核酸。在单链结合蛋白SSB以及缩合剂聚乙二醇存在的条件下，这一反应过程中的化学平衡倾向于产物的合成，并且可以不断重复这一过程而最终实现核酸的高效扩增。本发明提供了一种核酸扩增反应试剂，包含大肠杆菌解旋酶解旋酶RecQ蛋白、UvsY蛋白、UvsX蛋白和DNA聚合酶。具体而言，本发明的核酸扩增反应试剂的成分包括Tris(PH7. 4)缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇(PEG)、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、肌酸激酶(Creatinekinase)、引物组、SSB蛋白、大肠杆菌解旋酶RecQ蛋白、UvsY蛋白、UvsX蛋白和DNA聚合酶。本发明的核酸扩增反应试剂的配比优选如下
Tris25-75mM 醋酸钾25-75 mM
醋酸镁5-15 mM
二硫苏糖醇2. 5-10 mM
PEG5-10 % (w/v)
ATP5-10 mM
dNTPs1-2 mM
肌酸激酶2. 7-4. 3Pg/U
磷酸肌酸25-50 mM
引物组每种引物10 m
SSB 蛋白800 ng/ML
RecQ 蛋白10 ng/ML
UvsX 蛋白60 ng/ML
UvsY 蛋白50 ng/ML
DNA 聚合酶50 ng/ML。Tris溶液的pH值优选为7. 4，聚乙二醇的分子量优选为15000-20000 ;DNA聚合酶优选重组Klewnow exo-聚合酶，重组Klewnow exo-聚合酶是重组Klewnow片段去掉3' —5'外切酶活性，通过个别碱基的突变，使其5' —3'聚合酶活性增强。反应试剂中还可以加入荧光染料如SYBR green I、SYT0_13或SYT0-82，以便扩增结束后可以肉眼直观地观察结果。本反应体系中的引物，其长度需要30nt左右，以保证链替换过程中的识别和特异性，引物个数可以随检测目的基因的个数增加而增加。反应体系中的Tris为高效的缓冲齐U，用于维持反应体系的PH值。适当浓度的醋酸钾和醋酸镁为反应进行所必需。RecQ蛋白为来自大肠杆菌解旋蛋白，UvsX蛋白和UvsY蛋白为来自T4、T6噬菌体等的重组蛋白，这三个蛋白的功能是介导模板的解链以及实现模板和引物之间的链替换。这一替换过程需要ATP来提供能量。在SSB蛋白的辅助下，重组Klewnow exo-聚合酶可以对链替换后的DNA实现特异的延伸。由于ATP在磷酸肌酸(Phosphocreatine)催化下实现再生,这一反应过程中的化学平衡倾向于产物的合成，并且可以不断重复这一过程，从而最终实现核酸的高效扩增。
本发明还提供一种核酸体外扩增的方法，包括如下步骤①提取DNA，或提取RNA后反转录得到cDNA ;②加入上述核酸扩增反应试剂，25-45°C下反应10—60分钟，即可完成核酸的扩增。本发明的方法最主要的特点是可在低于PCR技术或等温核酸扩增技术中的温度条件下实现核酸扩增，只需一种简单廉价的小型恒温装置，甚至在环境温度达到25°C及以上时直接放置于室温就可以完成反应，而不需要使用传统的PCR仪，操作极为简便。此外，由于大肠杆菌解旋酶RecQ蛋白、UvsY蛋白、UvsX蛋白在扩增过程中对目标序列具有闻度特异性，使得在复杂基因组DNA的反应体系中，只有引物和|旲版序列完全互补的位置才会出现扩增，从而避免了常规PCR反应中常见的非特异背景(常规PCR在引物中间有若干碱基不互补的情况下仍可出现非特异的扩增)，因此可使扩增结果的特异性大大提闻，从而实现无本底背景的闻效等温核酸扩增。 相比传统PCR技术，本技术更适合应用于有大量样品的检测，几乎不需要专业仪器，操作更为简单，对操作人员的技术要求更低，而且反应时间仅需半小时左右。同时本发明还可利用肉眼可见的核酸荧光染料来进行初步结果判断，如果出现阳性结果，则可进行凝胶电泳来进一步鉴定得到扩增的核酸分子。
图I为FMDV抗原VPl基因的转基因烟草叶绿体DNA经PCR扩增和本发明的等温核酸扩增方法扩增后的产物凝胶电泳 图2为超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的转基因烟草基因组DNA经PCR扩增和本发明的等温核酸扩增方法扩增后的产物凝胶电泳 其中，M为marker，I为PCR扩增产物，2为本发明的等温核酸扩增方法扩增产物。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做详细的说明。实施例I 口蹄疫病毒(FMDV)抗原VPl基因转基因烟草的检测
首先将FMDV抗原VPl基因插入到包含有烟草叶绿体特异Prrn启动子和psbA终止子的载体P16APT中，形成目的基因的表达盒；而后将完整的表达盒通过限制性内切酶的作用，切下来并插入到含有烟草叶绿体基因组同源片段rpl2-trnH-psbA和trnK_0RF509A的载体PTRV中，形成完整的包含有FMDV抗原VPI基因的烟草叶绿体表达的质粒。另一方面，培养无菌的大烟草(Nicotiana tabacum),取4 6叶期烟草无菌苗,选择直径约3cm的烟草无菌苗展开叶作为外植体，将其放在9cm无菌培养皿中心。培养皿中有一薄层含0. 2mol/L甘露醇和0. 2mol/L山梨醇的MS培养基，以备轰击可以缓冲。利用基因枪转化法，将构建完成的质粒转移到烟草的叶绿体中，并通过抗生素(壮观霉素)筛选的方法获得烟草的转化株(参见2003，浙江大学，口蹄疫病毒VPl抗原基因在模式植物叶绿体中的重组和表达)。烟草叶绿体DNA提取(高离子强度低pH法)
将50g烟草叶片用蒸馏水洗净控干后，置于4°C，黑暗中饥饿过夜；
去除叶脉，将叶片剪碎，放于搅切器中；加入200mL 4°C预冰冷的buffer A,高速勻衆数次,每次IOsec,至成糊状； buffer A 25mmol/L 梓樣酸盐(Citrate), I. 25mol/L NaCl, 0. 25mol/L Vc, pH3. 6 用8层医用纱布过滤滤液至预冷的250mL离心杯中；
4°C 800g离心6min,弃上清；
加入IOOmL预冷的buffer B重悬叶绿体；
buffer B: SOmmoI /T, Tris-HCl, 2Smmol /T, EDTA, I. 25mol/L NaCl, 10mmol/L b~ 疏基乙醇(pH8. 0)
4°C 800g离心6min,弃上清，回收叶绿体颗粒；
加3OmL buffer C重悬沉淀；
buffer C: 150mmol/L NaCl,100mmol/L EDTA(pH8. 0)
4°C, IOOOg离心8min,弃上清，回收叶绿体；
加 8mL buffer D 轻悬沉淀，再加入 2mL 10% Sarkosyl (用 buffer D 配制)、100mLProtease K (lOmg/mL),于 4CTC 轻轻摇动 4 6h ;
buffer D :50mmol/L Tris-HCl,25mmol/L EDTA (pH8. 0)
用等体积的TE饱和酚(pH8. 0)抽提数次，再用酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提I 2次，至界面干净；
上清液中加入1/2体积7. 5mol/L NH4AC和2倍体积无水乙醇，_20°C放置2h以上； 4°C，12000g离心15min回收DNA，并将其溶于500mL TE缓冲液，转入I. 5mL eppendorf
管中；
力口 5mL RNaseA (lOmg/mL) ,37。。保温 Ih ；
用酚、酚/氯仿抽提至界面干净；
上清液中加入1/10体积3mol/L NaAC(pH5. 2)和2倍体积无水乙醇，水平旋转、混匀；待白色絮状沉淀出现后，4°C，15000g离心20min回收DNA，真空抽干，溶于IOOmL TE缓冲液。采用两种方法检测FMDV抗原VPl基因，一种是常规的PCR的方法，另一种是本发明的等温核酸扩增方法。I、传统PCR核酸扩增制备FMDV抗原VPl基因的转基因烟草阳性基因组为正对
昭
设计以下引物，委托北京三博远之生物技术有限责任公司合成
5' GCATGACCACCTCTGCGGGCG 3' SEQ ID NO: I 5' GCTTACAGAAGCTGTTTTGCG 3' SEQ ID NO: 2 选择模板序列如SEQ ID NO: 3所示。PCR体系如下
10XPCR buffer5u L
4XdNTP (各 IOmM)I u L
引物 Pl (IOuM) (SEQ ID NO: I)I u L
引物 P2 (IOuM) (SEQ ID NO: 2)I u L
模板DNAI u L
Taq 酶(Takara 公司)I U LddH2041 u L
总体积50 u L。将上述成分加好至一个0. 5ml eppendrof管,放入PCR仪中，
反应程序
95 °C预变性5min ；
94°C I min,57°C lmin,72°C 2min，28 个循环；
72°C 延伸 IOmin0反应完毕后，电泳鉴定扩增产物。 2、等温核酸扩增
设计以下引物，并委托北京三博远之生物技术有限责任公司合成
5' GGATGACCACCTCTGCGGGCGAGTCCGCGG 3' SEQ ID NO: 4 5' GCTTACAGAAGCTGTTTTGCGGGTGCCACG 3' SEQ ID NO: 5 核酸扩增反应试剂的配比如下
Tris (PH 7. 4)50mM
醋酸钾50 mM
醋酸镁10 mM
二硫苏糖醇5 mM
PEG (15000-20000)10 % (w/v)
ATP10 mM
dNTPs2 mM
肌酸激酶2. 7l^g/ U
磷酸肌酸50 mM
引物 A (SEQ ID NO: 4)10 剛
引物 B (SEQ ID NO:5)10 剛
SSB 蛋白800 ng/ML
RecQ 蛋白10 ng/ML
UvsX 蛋白60 ng/ML
UvsY 蛋白50 ng/ML
重组 Klenow exo-聚合酶50 ng/ML
SYTO-I30.5mM 。
取2ML提取获得的烟草叶绿体DNA，加入印pendrof管中，再加入25ML上述核酸扩增试齐IJ，25°C下保温I小时，取出观察管内液体颜色为绿色。进一步用电泳鉴定扩增产物，结果出现645bp大小条带，如附图I所示。实施例2 Mn-SOD基因转基因烟草的检测
本实施例首先将超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因插入到包含有烟草细胞核E35S启动子，TEV Leader和35S终止子的载体pRTL2中，形成目的基因的表达盒。而后将完整的表达盒通过限制性内切酶pstl的作用，插入到烟草转化载体Pzp211中，形成完整的包含有超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的烟草细胞核表达的质粒。
另一方面，培养烟草无菌苗无菌条件下播种烟草大烟叶种子于MS培养基上，约6-8周后取无菌苗幼嫩叶片进行转化。用含有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶盘。无菌烟草叶盘需要在MSl固体培养基上预培养3d。农杆菌培养至对数期后用液体MS培养基稀释成侵染液。筛选抗性再生植株在培养基中加入一定浓度的合适的抗生素对再生植株进行筛选，得到具有抗性的完整转基因再生植株。CTAB法提取烟草基因组DNA
称取0.1 g-0.2 g叶片，于1.5 mL离心管中加入液氮，用玻璃棒迅速研磨成淡黄色粉
末；
加入 600 u L 2% CTAB 缓冲液和 5 u L RNaseAC 10 mg/mL)，混匀后 65°C温浴 30 mi n,期间每隔10 min轻轻颠倒混匀一次；
加入等体积的酚-氯仿(v/v = 1:1)混匀后放置3 min,4°C,10, 000 rpm离心10 min ；离心后吸取上清至新的I. 5 mL离心管,加入等体积氯仿,混勻静置5 min, 10, 000 rpm,4°C离心 10 min ；
离心后吸取上清至新的I. 5 mL离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物，然后置于-20°C冰箱沉淀30 min ；
取出样品，4°C 12000 rpm离心3 min，轻轻倒掉上清，注意勿将白色DNA沉淀倒出； 加入1.0 mL 70 %预冷的无水乙醇，12000 rpm，4°C离心2 min，倒掉上清液，重复3次； 快速离心，小心吸取离心管底部液体；
置于37°C温箱干燥后加入50 UL TE缓冲液使DNA溶解，最后置于_20°C冰箱备用。本实验通过两种方法，对获得的转化株进行检测，一种是常规的PCR的方法，另一种是本发明的等温核酸扩增的方法。本实例中的引物均有申请人设计，并委托北京三博远之生物技术有限责任公司合成。I、传统PCR核酸扩增制备超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的转基因烟草阳性基因组为正对照
设计并合成以下引物
5' GCATGCCATTTGAATTGCCAG 3' SEQ ID NO: 6 5' GCTTACTTCGCTTTCGCTTCG 3' SEQ ID NO: 7 选择模板序列如SEQ ID NO: 8所示。PCR扩增体系如下
ddH20 19.5 UL
IOXbuffer 2. 5 u L
dNTP (各 IOmM) 0. 5 u L
基因组DNA:I u L
上游引物(IOmM) (SEQ ID NO: 6) 0. 5 u L
下游引物(IOmM) (SEQ ID NO: 7) 0. 5 u L
Taq 酶(Takara) :0. 5 U L
总体积25 u L。将上述成分加好至于一个0. 5ml eppendrof管,放入PCR仪中，程序如下(退火温度和延伸时间可根据引物Tm值和扩增子长度进行调整)
预变性95 °C5 min
变性95 V30 s
退火56 0C60 s
延伸-J2 0C50 s
循环数30 cycles
延伸-J2 0C10 min。反应完毕后，电泳鉴定扩增产物。2、等温核酸扩增 设计并合成以下引物
5' GCATGCCATTTGAATTGCCAGCATTGCCGTATC 3' SEQ ID No: 9 5' GCTTACTTCGCTTTCGCTTCGCTGTACCGTTTC 3' SEQ ID No: 10 核酸扩增反应试剂的配比如下 Tris (PH 7. 4)50mM
醋酸钾50 mM
醋酸镁10 mM
二硫苏糖醇5 mM
PEG (15000-20000)10 % (w/v)
ATP10 mM
dNTPs2 mM
肌酸激酶2. 7l^g/ U
磷酸肌酸50 mM
引物 A (SEQ ID NO: 9)10 剛
引物 B (SEQ ID NO: 10)10 剛
SSB 蛋白800 ng/ML
RecQ 蛋白10 ng/ML
UvsX 蛋白60 ng/ML
UvsY 蛋白50 ng/ML
重组 Klenow exo-聚合酶50 ng/ML
SYTO-I30.5mM 。
取2ML提取获得的烟草基因组DNA，加入印pendrof管中，再加入25ML上述核酸扩增试
齐U，37°C下保温I小时，取出观察管内液体颜色为绿色。进一步用电泳鉴定扩增产物，结果出现615bp大小条带，如附图2所示。以上实施例说明使用本发明的核酸扩增试剂的核酸扩增方法能够有效地检测目
的基因，与常规PCR核酸扩增技术相比较，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器
设备，适用于大规模的筛选。
权利要求
1.ー种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于其包括下列成分 Tris25-75mM 醋酸钾25-75 mM 醋酸镁5-15 mM ニ硫苏糖醇2. 5-10 mM 聚こニ醇5-10 % (w/v) ATP5-10 mM dNTPs1-2 mM 肌酸激酶2. 7-4. 3μδ/υ 磷酸肌酸25-50 mM 引物组每种引物 ο μΜ SSB 蛋白800 ng/^L RecQ 蛋白10 ng/M-L UvsX 蛋白60 ng/M-L UvsY 蛋白50 ng/M-L DNA 聚合酶50 ng/^L。
2.如权利要求I所述的ー种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于所述DNA聚合酶为重组Klewnow exo-聚合酶。
3.如权利要求I所述的ー种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于所述聚こニ醇的分子量为 15000-20000。
4.如权利要求I所述的ー种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于所述Tris溶液的pH值为7.4。
5.如权利要求I所述的ー种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于所述反应试剂还包括荧光染料。
6.如权利要求5所述的ー种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于所述的荧光染料为SYBR green I、SYTO-13 或 SYT0-82。
7.—种等温核酸扩增的方法，其特征在干包括如下步骤①提取DNA，或提取RNA后反转录得到cDNA 加入如权利要求1-6中任一项所述的等温核酸扩增反应试剂，25-45°C下反应10 — 60分钟，即可完成核酸的扩增。
8.如权利要求7所述的ー种等温核酸扩增方法，其特征在于所述核酸扩增反应的温度为37で。
全文摘要
本发明公开了一种等温核酸扩增反应试剂，包含以下成分Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、肌酸激酶、引物组、SSB蛋白、大肠杆菌解旋酶RecQ蛋白、UvsY蛋白、UvsX蛋白和DNA聚合酶。本发明还公开了一种等温核酸扩增的方法，包括如下步骤①提取DNA，或提取RNA后反转录得到cDNA；②加入上述核酸扩增反应试剂，25-45℃下反应10—60分钟，即可完成核酸的扩增。相比传统PCR技术，本技术几乎不需要专业仪器，操作更为简单，对操作人员的技术要求更低，而且反应时间仅需半小时左右。
文档编号C12N15/10GK102816756SQ20121032873
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者汤赛君, 于小兰, 王秀东, 应清界, 王智宏, 程奇 申请人:江苏奇天基因生物科技有限公司