专利名称：一种大白菜eIF(iso)4E.c位点转座子插入突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发与应用，尤其涉及一种大白菜真核生物翻译起始因子eIF(iso)4E. c的转座子插入突变体及该位点特异性分子标记的开发和应用。本发明的突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒大白菜种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的大白菜材料，提高eIF4E突变体的选择效率，属于生物技术领域。
背景技术：
大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原产于中国，目前在世界各地均有种植。尤其在我国蔬菜的常年供应和淡季蔬菜调剂中已经成为蔬菜产品供给的重要组成部分，因而对人们生活具有重要影响。在大白菜生产过程中，常遭病毒病、霜霉病和软腐病等病害的威胁。就整体而言病毒病的危害最为严重，且没有普遍适用的抗病毒病药剂或其它行之有效的控制技术。培育抗病毒大白菜新品种是应对病毒病危害的首选途径[王雪，刘玉梅，李汉霞，张扬勇，方智远.芸薹属作物抗芜菁花叶病毒育种研究进展.园艺学报.2005,32(5): 939-946]。苗立强等[苗立强，张耀伟，崔崇士 .我国白菜抗病育种研究进展.东北农业大学学报.2008, 37 (4) : 52 9-533]研究发现，我国大白菜病毒病的病原分离物中70%是芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)、还有少量黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我国大白菜抗病毒病育种的主攻目标是抗TuMV。
培育抗TuMV大白菜新品种的两个关键要素是拥有丰富的抗TuMV种质资源和高效的育种效率。我国是大白菜原产地，种质资源非常丰富，其中不乏抗TuMV的优良资源，同时也有更多品质优良但不抗病毒的资源。在常规育种实践中，常通过回交转育的手段获得更多遗传背景丰富的抗性材料。随着分子标记技术的兴起及研究的深入，标记辅助选择在常规育种操作中已经成为提高选择效率、缩短育种年限的主要手段。一些跨国的育种集团更是不惜重金把创新资源和开发与重要农艺性状紧密连锁的分子标记作为育种攻关的主要内容。
一般而言，要寻找与某农艺性状紧密连锁的分子标记，往往需要先选择在目标性状方面存在显著差异的亲本，并构建分离群体$2，1 1，8(1，0!1等)，采用混合分群(BSA) 和传统的分子标记(如RAPD, SRAP, AFLP, SSR等)技术进行分析,用相应的软件分析所得标记与性状的连锁距离，最终得到与目标性状连锁的分子标记。目前报道的与大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)位点连锁的分子标记正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所选择的标记类型不同，所得到的与抗病毒特性连锁的标记距离亦不同，介于 3. 8-15. 36cM。由于这些标记与性状的连锁程度不够紧密，因而其用于大白菜抗TuMV辅助育种尚有一定的距离。
另一方面，由于拟南芥与大白菜同属十字花科，其抗病毒相关功能基因已有较深入的研究；同时大白菜的全基因组序列已经公布[Wang et al. , 2011, the genome of themesopoIyploidcrop species Brassica rapa. Nature Genetics. 43(10):1035-1039]。所以可以将拟南芥功能基因研究的结果和大白菜基因组序列信息结合，直接从抗病毒相关功能基因的角度入手，通过对大白菜自然群体在某一个重要功能基因位点的自然变异入手，寻找抗病毒相关功能基因的突变体；针对突变位点开发位点特异性分子标记(Allelespecific marker, ASM)，则这种标记本身与性状直接相关，这无疑会使标记辅助选择更加精准。在抗病毒功能基因研究方面近年来发现，由隐性单基因控制的抗病毒性状多与真核生物翻译起始因子4E及其异构体的突变有关。Wittmann等[WittmannS，Chatel H，Fortin MG，Laliberte JF.1nteraction of the viral protein genomelinked of Turnip mosaic virus with thetranslational eukaryotic initiationfactor(iso)4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybridsystem.Virology.1997,234:84-92]和 L6onard 等[L6onard S，Plante D，WittmannS,DaigneaultNj Fortin MG，LaliberteJF. Complex formation between potyvirusVPg and translation eukaryoticinitiation factor 4E correlates with virusinfectivity. J. Virol. 2000，74:7730-7737]分别证明拟南芥 eIF4E 和 eIF (iso) 4E 可以同TuMV的病毒基因组结合蛋白(VPg)相互作用。这种相互作用的关键氨基酸与真核生物自身mRNA翻译所需的关键氨基酸位点不同，所以eIF4E及eIF(iso)4E的一些氨基酸突变不影响植物自身的生长发育、却导致病毒与寄主不能发生互作，从而使寄主表现出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜[Ryder EJ. 1970.1nheritance of resistancetocommon lettuce mosaic. Am Soc Horticult Sc1. 95:378 - 379]、Ruffel 在辣椒[RuffelS, DussaultMHj Palloix A,Moury B，Bendahmane A, Robaglia C,Caranta C.2002.A natural recessiveresistance gene against potato virus Y in peper correspondsto the eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E) Plant J. 2002Dec;32(6) :1067-75]、Nieto 在舌甘瓜[Nieto C，Piron F，Dalmais M，Marco CF，Moriones E, Gomez-GuillamonML, Truniger V, Gomez P, Garcia-Mas J，Aranda MAj Bendahmane A. 2007. EcoTILLING forthe identification of allelic variants of melon eIF4E，afactor that controlsvirus susceptibility. BMC Plant Biology. 7，34-42]等重要蔬菜作用中已经发现了不少这样的突变体资源，Yeam 等[Yeam I，Kang BCj Lindeman W，Frantz JDj Faber N，andjahnMM. 2005. Allele-specific CAPS markers based on point mutations in resistancealleles at thepvrI locus encoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet.NNOj 178-186]在辣椒中针对突变位点开发了相应的位点特异性CAPs标记并用于抗病毒材料转育时的辅助选择。从其他作物的eIF4E和eIF (iso) 4E突变及其在抗病毒中的作用推测，大白菜自然群体中也可能存在eIF4E和eIF(is0)4E的突变体，且这种突变可能与大白菜的抗病毒特性有关。我国大白菜种质资源十分丰富，但目前，国内外有关大白菜抗病毒特性与eIF4E和eIF(iso)4E关系的研究很少，涉及的材料极为有限。Rusholme等[Rusholme RL,Higgins EE, Walsh JA, Lydiate DJ. Genetic control of broad-spectrum resistanceto turnip mosaic virus in Brassica rapa (Chinese cabbage). Journal of GeneralVirology. 2007,88:3177 - 3186]以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料R-0-18为亲本，构建BClFl群体，进行抗TuMV (⑶N I和CZEl株系)遗传研究。结果发现了一个大白菜抗病毒隐性遗传位点retrOl和一个显性位点ConTROl, RFLP标记关联分析分别发现了与retrO I连锁的标记pN202e I和与ConTRO I连锁的标记p085e I。进一步采用southern 杂交的手段发现，在A基因组中分别有3个拷贝的eIF4E (分别位于染色体N1、N3和NS)和 3个拷贝的eIF(is0)4E (分别位于染色体N4、N5和NS)。作者根据杂交结果，推测位于第8 染色体上的eIF4E和eIF (iso) 4E可能与ConTROl有关，而位于第4染色体上的eIF (iso) 4E 可能与retrOl有关。文中没有关于两个基因的序列信息报道。Jenner等[Jenner CE, Nellist C F，Barker GC, Walsh JA. Turnip mosaic virus (TuMV)isable to usealleles of both eIF4E and eIF (iso)4E from multiple loci of the diploid Brassica rapa. Mol PlantMicrobe Interact. 2010, 3(11): 1498-1505]从病毒敏感材料 R-0-18 中克隆得到了 eIF4E 和 eIF(iso)4E 各三个拷贝，分别命名为 BraA. eIF(iso)4E. C、BraA. eIF4E. b、 BraA. eIF4E. c 和 BraA. eIF(iso)4Ε· a>BraA. eIF(iso)4E. b、BraA. eIF(iso)4E. c。除 BraA. eIF4E. b和BraA. eIF (iso) 4E. b以外，其余4个基因分别转化拟南芥At. eIF (iso) 4E功能缺失突变体[Duprat A, Caranta C, ReversF, Menand B, Browning KS, Robaglia C. 2002. The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. The PlantJournal, 32:927 - 934], 然后对所有转基因株系接种TuMV加拿大株系CDNl，进行病毒敏感性互补实验。根据病情指数及ELISA结果，发现所转的四个基因均能使突变体完全或部分恢复对TuMV侵染的敏感性。这表明，在TuMV侵染白菜类蔬菜作物时，eIF4E和eIF (iso) 4E都可能参与病毒与寄主的相互作用。同时作者指出，要想在大白菜中获得与eIF4E和eIF(iso)4E有关的抗病毒材料，则这几个基因需同时丧失功能。截止目前，大白菜在上述两个基因位点的突变及相关突变体检测的标记开发国内外未见报道。
鉴于此，有必要对我国丰富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF (iso) 4E各个位点的多态性进行广泛筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜在益处① 可以将该标记用于筛查大白菜种群，提供高效的大白菜突变体检测手段；②当其他位点发现突变类型时，可以采用同样的方法开发标记；③当多个位点的突变位于不同的材料中时，可以通过标记辅助选择手段将多位点的突变聚合在一起，创造广谱抗TuMV大白菜新种质在培育广谱抗TuMV大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。 由于这种标记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达100%。发明内容
针对上述现有技术，针对目前大白菜在eIF4E和eIF (iso) 4E基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明首先获一个eIF (iso) 4E. c位点的转座子插入突变体，其次根据突变位点的序列特点，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的ASM共显性标记并用于标记辅助选择。
本发明是通过以下技术方案实现的
一种与大白菜eIF(is0)4E. c野生型和转座子插入突变体鉴定直接相关的位点特异性显性ASM标记与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E. c_W，片段大小1216bp，如SEQ IDNo.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e. c_I，片段大小4419bp，如 SEQ IDNo. 2 所示。用于鉴别上述特异性显性分子标记的引物是正向引物PFl :5’ -CGAAGAAGAATATGGCGA-3’ ；反向引物PRl :5’ - AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’ ；如 SEQ ID NO. 3、4 所示。本发明采用同源克隆技术从一份大白菜抗TuMV和一份大白菜感TuMV自交系材料中分别克隆到了 eIF(iso)4E. c基因全序列，将2个序列与GenBank中已经报道的B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E. c比较后，发现来自敏感材料的eIF(iso)4E. c与已经报道的完全一致，而来自病毒抗性材料的eIF(iso)4E. c则在第三内含子区插入了一个3195bp的片段，在NCBI比对时，没有发现与该插入片段完全同源的序列，但发现部分序列与拟南芥hAT转座子超家族有部分同源性。因此推断该突变体是一个转座子插入突变体。用小写字 母即eIF(iS0)4e. c2表示，以区别于本课题组之前鉴定的一个eIF (iso) 4E. c碱基缺失突变体 eIF (iso) 4e. cl。由于大白菜有三个eIF(is0)4E基因，且三者之间同源性较高，我们分析了该基因野生型序列的保守序列，在转座子两侧设计引物，进行一次PCR扩增，野生型只得到较小的条带，而突变体由于有转座子插入，得到较大的条带，一次PCR扩增即可将野生型和突变体同时鉴别出来。该标记为共显性标记。故杂合型得到两条带。所述ASM标记的筛选过程如下(I)以大白菜抗TuMV自交系DaQinBai和TuMV敏感自交系06-247为材料，采用CTAB法，提取两者的基因组DNA。(2)依据GenBank中已经报道的B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E. c序列，在编码区上下游设计引物。采用同源克隆技术，从两份材料中分别克隆得到了其eIF(is0)4E.c并进行测序。(3)将所得eIF(iso)4E. c与R-0-18的eIF(iso)4E. c序列分别进行比较，发现了一处大片段插入突变。(4)将插入部分的序列在NCBI进行BLAST分析，发现插入区域与拟南芥hAT转座子超家族同源关系最近，据此我们认为该突变体为转座子插入突变体。(5)用于扩增该基因的引物就是位点特异标记筛选的引物，据此我们认为该引物能够同时从抗/感材料中将野生型位点和突变位点扩增出来，此即为共显性位点特异性标记(ASM)。所述标记可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有DaQinBai中eIF (iso) 4E. c突变类型的种质材料或转育后代。具体应用方式为利用ASM标记的一套引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段大小，如果扩增出1216bp的条带，则为野生型；扩出4419bp的条带则为突变型；如果同时扩出两条带，则为杂合型。本发明的有益效果是由于大白菜eIF4E位点上受多个基因的控制，在同一份材料中多基因同时突变的频率较低。如果能够分别在各个位点鉴定出各自的突变体，开发针对各个突变体检测的位点特异性分子标记，则可以通过聚合杂交并结合分子标记辅助选择，将多个突变位点聚合在同一份材料中。本发明利用同源克隆技术发现了 eIF(iS0)4E.C位点的一个转座子插入突变体并开发了鉴定该位点的分子标记。利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择，以寻创造遗传背景更加丰富的突变体材料。其优点具体如下
1.本发明获得的了一个eIF(is0)4E. c位点大片段插入的突变体，该突变体有可能是导致材料抗病的主要原因，可以为通过回交手段转育遗传背景更丰富的突变体提供变异源。在大白菜eIF4E基因序列及突变型研究方面，仅Jenner等(2010)报道了 B. rapa的一个自交系R-0-18的序列，其它突变体未见报道。
2.针对该突变位点大片段插入，在插入位点两侧保守区设计引物，获得了与野生型和突变体检测直接相关的位点特异性共显性标记，该标记的开发可以为种质资源鉴定、 通过回交转育等手段筛选和培育不同遗传背景的突变体材料提供辅助选择工具。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。
图1 :两份大白菜材料eIF(is0)4E. c基因的扩增(琼脂糖凝胶电泳)，W为野生型材料06-247的扩增结果，m为突变体材料DaQinBai的扩增结果，DL5000是DNA分子量标准。
图2 :转座子插入突变示意图，图中双向箭头表示转座子序列插入在野生型 eIF (iso) 4E. c基因的692bp之后，插入片段大小3195bp。
图3 :插入片段BLAST比对部分结果(第三条示hAT 二聚化功能)。
图4 :特异引物在回交群体中对部分单株的扩增情况(M =DMA分子量标准DL5000. 从结果可以清楚地确定1-5是突变体单株，6-10是野生型单株)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明， 均为常规方法。
实施例1、不同大白菜自交系材料中eIF(is0)4E. c的克隆
1.1大白菜基因组DNA提取
(I)将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每IOOmg材料约加入O. 6ml预热至65°C的CTAB提取液，融化后，剧烈振荡混匀样品，65°C水浴放置40-60分钟使细胞裂解；
(3)裂解结束后，取出样品使其完全冷却至室温。加入等体积的氯仿 (chloroform),轻轻颠倒使混勻，室温放置10分钟；
(4)室温，12000rpm 离心 15 分钟；
(5)用移液器小心吸出上层水相，加入新的1. 5ml的离心管中，加入500 μ I的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，室温沉淀IOmin ；
(6) 4°C, 12000rpm 离心 IOmin,小心弃去上清液；
(7) DNA沉淀用lml75%乙醇洗涤。4°C，8000rpm离心IOmin收集沉淀；
(8)重复用75%乙醇洗涤一次DNA沉淀；
(9)去上清，DNA沉淀于无菌操作台上晾干约10_15分钟，DNA略显透明，加入适当体积(30-50 μ I)的IOmM的Tris. HCl (ρΗ8. O)使沉淀溶解(可放于4°C冰箱溶解过夜)；
(10)紫外分光光度计及l%Agr0Se凝胶电泳检测DNA浓度及质量。1. 2eIF(iso)4E. c的克隆及序列分析(I)检索B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E.c基因全序列(GenBank:HM131211.1)，在编码区上游和下游分别设计正反向引物，PFl:5’-CGAAGAAGAATATGGCGA-3’PRl :5’ -AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’，如 SEQ ID NO. 3,4 所示。(2) PCR扩增在20iil反应体系中，包含IXLA taq buffer ；20ng的基因组DNA ；0. 4iiM正反向引物；0. 25mM dNTPmix; I个单位的LA taq。PCR循环条件95°C预变性5分钟；接着是95 °C变性30秒，57. 5 °C退火30秒，72 °C延伸5分钟，35-38个循环，最后72 °C延
伸10分钟。(3) PCR产物的电泳检测PCR结束后，取IOiilPCR扩增产物加入IiU IOXloading buffer，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后EB染色，自动凝胶成像系统观察拍照。结果见图1。(4) PCR产物的克隆测序电泳确认目的条带被扩增后，取I Ul PCR扩增产物加I U I pEasy-T3载体室温连接10分钟,转化大肠杆菌感受态细胞Transl-Tl (TransGen :0)501),转化菌在含50 u g/ml卡那霉素的LB固体平板上37°C倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取阳性克隆委托北京华大基因有限公司进行DNA序列的测定。(5)所克隆的大白菜eIF(iso)4E. c序列分析将来自TuMV抗性材料DaQinBai和感病材料06-247的fcA. eIF(iso)4E. c基因组序列分别于已知的来自R-0-18的BrA.eIF(iso)4E.c进行比较，发现来自TuMV敏感材料06-247的BrA. eIF (iso) 4E. c基因组序列与R-0-18的完全同源，将其命名为BrA.eIF(iso)4E. c，称为野生型；而来自TuMV抗性材料DaQinBai的BrA. eIF(iso)4E. c有大片段插入，我们将其命名为BrA. eIF(iso)4e. c2，称为转座子插入突变体。其序列如SEQID NO. 2所示,插入部位示意图如图2所示，即从基因组序列(从起始密码算起)的第692bp(从起始密码算起)之后插入，且685-692是插入位点的靶序列(TGTTTGAC，即8_bp hostduplication，简称HD)，因为该序列在转座子序列的下游又重复了一次。同时转座子区域两侧有 17bp 的末端反向重复(CTGTG (T/G) TTAMATAGCG, Terminal Inverted R印eat 或Inverted Terminal Repeat,简称TIR或ITR)。上述两点是hAT转座子超家族的典型特征(Rubin E, Lithwick G, Levy AA. Structure and evolution of the hATtransposonsuperfamily. Genetics, 2001, 158(3):949-57)。(6)插入片段功能预测将插入部分的3195bp在NCBI数据库进行BLAST比对，发现与拟南芥第一染色部分序列同源性较高，其中插入部分第1570bp-2630bp与拟南芥hAT转座子超家族同源性最高，检索结果见图3。由此推断，我们得到的这个大片段插入的BrA.eIF(iS0)4E.C突变体是个转座子插入突变体。实施例2共显性ASM标记的开发及验证由于BrA. eIF(iso)4E. c和BrA. eIF(iso)4e. c2的基因组序列存在三千多个碱基的插入突变，用于扩增该基因的一对引物保守性较高，可以用于开发标记。我们用扩增该基因的引物在(DaQinBaiX06-247)XDaQinBai的回交群体进行了验证。具体实施细则如下
(I)回交群体各单株基因组DNA提取如1.1所述。
(2) PCR扩增PCR反应液的配制及扩增条件如1. 2第⑵条所述。
(3)PCR产物的检测如实施例2所述。检测结果如图4所示，M是分子量标准 DL5000,1-10是回交群体的10个单株。从扩增结果可以看出这对引物能够100%鉴定纯合野生型、纯合突变体，完 全可以用于种质资源的筛选和育种辅助选择。
权利要求
1.一种大白菜eIF(iso)4E. c位点转座子插入突变体,其特征在于与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E. c-W，片段大小1216bp，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e. c-1，片段大小4419bp，如SEQ ID No. 2所示。
2.权利要求1所述的大白菜eIF(iso)4E.c位点转座子插入突变体的引物,其特征在于引物序列如下正向引物 PFl :5’-CGAAGAAGAATATGGCGA-3’ ；反向引物 PRl :5’ - AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’ ；如 SEQ ID Ν0·3、4 所示。
3.权利要求1所述的大白菜eIF(is0)4E.c位点转座子插入突变体作为特异性分子标记在鉴别大白菜eIF(iso)4E. c位点的基因型中的应用。
4.权利要求2所述的引物在鉴别大白菜eIF(is0)4E.c位点的基因型中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于具体应用方式为利用引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段大小，如果扩增出1216bp的条带，则为野生型；扩出4419bp的条带则为突变型；如果同时扩出两条带，则为杂合型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述PCR扩增具体为在20μ I反应体系中，包含 IXLA taq buffer ;20ng 的基因组DNA ;0. 4 μ M正反向引物；O. 25mM dNTPmix;l 个单位的LAtaq ；PCR循环条件95°C预变性5分钟；接着是95°C变性30秒，57. 5°C退火30秒，72°C延伸5分钟，35-38个循环，最后72°C延伸10分钟。
全文摘要
本发明公开了一种与大白菜eIF(iso)4E.c野生型和转座子插入突变体鉴定直接相关的位点特异性显性ASM标记与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E.c-W，片段大小1216bp，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e.c-I，片段大小4419bp，SEQ ID No.2所示。本发明利用同源克隆技术发现了eIF(iso)4E.c位点的一个转座子插入突变体并开发了鉴定该位点的分子标记。利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择，以寻创造遗传背景更加丰富的突变体材料。
文档编号C12Q1/68GK102994497SQ20121045527
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者刘栓桃, 赵智中, 张志刚, 李巧云, 卢金东 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所