专利名称：应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法
技术领域：
本发明涉及毒性检测领域，具体涉及一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法。
背景技术：
现有技术中大多数药物水溶性较差，因此在剂型制备过程中往往需要一定量的溶齐U。然而，溶剂作为化学物质，对人或动物等也存在一定的潜在威胁，大量的摄入也会影响人或动物的健康。因此，快速检测溶剂的毒性，拟定其最高使用限量将变得尤为重要。斑马鱼是一种新颖的模式生物，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长3 4cm，一次交配能获得100 200个胚胎，每周产卵一次，这样中等规模的鱼缸每年就能养殖成鱼数百万只，成本仅为养小鼠的O. 斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性 强，所以可以利用斑马鱼来检测物质的毒性，进而初步评价其对人类等的毒性。现有技术中也有溶剂对斑马鱼胚胎发育影响相关的报道。例如王思峰等发表的“溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响”中，分析了乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响；李佳等发表的“助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应”中，分析了甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应的研究。前者是在12hpf(hourspost-fertilization,受精后小时数)、24hpf时进行处理,而在72hpf进行调查统计；后者虽然是在3hpf时进行处理，但最快也需在12hpf才能调查胚胎发育情况。上述两篇现有技术所报道的方法周期均较长。本发明发明人在科研过程中，有了一个惊奇的发现，即当使用特殊的胚胎培养液配制溶剂时，能够使胚胎对溶剂的不良反应在较短的时间内表现出来，大大缩短了检测周期，正是基于上述发现，发明人完成了本发明。
发明内容
本发明所要解决的技术问题提供一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法。为了解决上述问题，本发明采用以下的技术方案。本发明提供一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法，其特征在于包含如下步骤配制胚胎培养液，然后向胚胎培养液中加入有机溶剂，使得胚胎培养液中有机溶剂的浓度达到测量需要的浓度，用加入了有机溶剂的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在6-12小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断有机溶剂对胚胎的毒性。其中胚胎培养液用pH为6. 7-8. 5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有5mM NaCUO. 17mMKCl、0· 43mM CaCl2 和 0. 33mM MgSO4。上述方法中，斑马鱼胚胎通过如下方法选择采卵前一天将性成熟的斑马鱼，按雌雄为I : 2的比例放入配缸内并隔开，次日上午9:00自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗两次收集得到的受精卵，并去除杂质和坏卵，之后后置于胚胎培养液中，29. 3°C进行控光培养；当2hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达85%以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。上述方法中，培养斑马鱼胚胎的方法如下将斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两次，然后移入24孔板的样孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了有机溶剂的胚胎培养液，每孔3ml，随后加盖封闭，置于培养箱中，在29. 3°C培养斑马鱼胚胎。上述方法中，观察记录的时间是培养后第4、6、8、12小时，记录畸形率和死亡率。上述方法中，pH为7. 0-7. 8，优选地，pH为7. 2。畸形是指斑马鱼体型与正常的相同培养时间单用胚胎培养液培养的斑马鱼体型有差异。
死亡是指用搅拌棒触碰斑马鱼尾部时斑马鱼没有任何反应。上述方法中,所述的有机溶剂为任何需要测量其对生物的毒性有机溶剂，优选地，有机溶剂为二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇和乙醇中任意一种。本发明配制胚胎培养液所用的氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁以及弱碱性水等均为市购，其中无机盐均为AR级；本发明试验用溶剂分别为二甲基甲酸胺Sigma-Aldrich(Cat#D1435-lL)；丙酮广州化学试剂厂AR级；甲醇广州化学试剂厂AR级；乙醇广州化学试剂厂AR级。需要特别说明的是，弱碱性水可以采用任何通过光电催化电解水获得的弱碱性水，该弱碱性水的PH为6. 7-8. 5，可以通过市场上的弱碱性水制备装置制备，也可以自行通过电解的方式制备，需要注意的是本发明的弱碱性水并不是通过在水中加入化学物质制备得到的弱碱性水，任何通过加入化学物质到水中制备的弱碱性水不是本发明所说的弱碱性水。弱碱性水的pH可以在制备中调节，而不是通过加入化学物质调节pH。本发明的有益效果本发明使用弱碱性水配制的胚胎培养液来作为测试有机溶剂毒性的培养液，其不仅因为培养液中的水为弱碱性水，还因为培养液中的无机盐的特定组成，使得斑马鱼胚胎能够快速测试有机溶剂的毒性，缩短了检测周期。
图I :正常斑马鱼；图2 :二甲基甲酰胺处理时畸形的斑马鱼；图3 :丙酮处理时畸形的斑马鱼；图4 甲醇处理时畸形的斑马鱼；图5 乙醇处理时畸形的斑马鱼；
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但本发明并不限制于此。
实施例I最佳胚胎培养液的筛选I. I不同配方的胚胎培养液的配制及培养斑马鱼的效果A用普通水配制包含以下浓度无机盐的胚胎培养液，调节pH为7. 2，培养斑马鱼胚胎72小时，观察斑马鱼的透明度和存活率。具体结果见表I :表I普通水配制的胚胎培养液对斑马鱼胚胎的影响
权利要求
1.本发明提供一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法，其特征在于包含如下步骤 配制胚胎培养液，然后向胚胎培养液中加入有机溶剂，使得胚胎培养液中有机溶剂的浓度达到测量需要的浓度，用加入了有机溶剂的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在6-12小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断有机溶剂对胚胎的毒性。
2.根据权利要求I所述的方法，其中胚胎培养液用PH为6.7-8. 5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有 5mM NaCl、O. 17mM KCl、O. 43mM CaCl2 和 O. 33mM MgSO4。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中斑马鱼胚胎通过如下方法选择 采卵前一天将性成熟的斑马鱼，按雌雄为I : 2的比例放入配缸内并隔开，次日上午9:00自然交配并收集受精卵,用胚胎培养液清洗两次收集得到的受精卵，并去除杂质和坏卵，之后后置于胚胎培养液中，29. 3°C进行控光培养；当2hpf时,在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达85%以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中培养斑马鱼胚胎的方法如下将斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两次，然后移入24孔板的样孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了有机溶剂的胚胎培养液，每孔3ml,随后加盖封闭,置于培养箱中,在29. 3°C培养斑马鱼胚胎。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中观察记录的时间是培养后第4、6、8、12小时,记录畸形率和死亡率。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中pH为7.0-7. 8。
7.根据权利要求6所述的方法，其中pH为7.2。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中有机溶剂为任何需要测量其对生物毒性的有机溶剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中有机溶剂为二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇和乙醇中任意一种。
全文摘要
本发明涉及一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法，其主要步骤为配制胚胎培养液，然后向胚胎培养液中加入有机溶剂，使得胚胎培养液中有机溶剂的浓度达到测量需要的浓度，用加入了有机溶剂的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在6-12小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断有机溶剂对胚胎的毒性。其中胚胎培养液用pH为6.7-8.5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl2和0.33mM MgSO4。本发明使用弱碱性水配制的胚胎培养液使得斑马鱼胚胎能够快速测试有机溶剂的毒性，缩短了检测周期。
文档编号C12Q1/02GK102899384SQ201210455108
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者陈 峰, 裴端卿, 粱桂婵, 周兴茹, 舒晓东 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院, 陈 峰