专利名称：一种栅藻及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种栅藻及其应用，具体涉及到该栅藻在生物能源和净化养猪废水领域的应用。
背景技术：
21世纪人类面临着两大危机能源危机和水资源危机。据估计，全球的原油储量和天然气储量将分别在40年和64年后用尽，因此，开发经济、高效的新型能源势在必行，其中生物新能源是主要研究热点之一。与此同时，全球40%的国家与地区面临着缺水问题，水资源的可持续利用迫在眉睫。污水再生利用作为城市第二水源为解决城市水资源的紧缺问题提供了一条新途径，但污水中较高含量的氮磷容易引起水体的富营养化，影响污水的利用。因此，寻找高效、低成本的废水生态修复技术是解决当前水资源危机的重要手段之一。 微藻是一类光能自养型单细胞生物，具有资源丰富、种类繁多、生长速度快、适应性强和油脂含量高等特点。近年来，随着人类对微藻认识的深入，微藻在制备生物柴油和污水深度脱氮除磷方面得到了越来越多的关注，开展了大量的相关研究。藻类生长需要以氮磷作为底物，因此利用微藻可去除污水中氮磷等污染物；同时，微藻通过光合作用可将CO2固定为有机碳(蛋白质、油脂等)，藻细胞油脂中的三酰甘油酯是制备生物柴油的主要原料，因此，可利用污水培养微藻进行污水的脱氮除磷深度处理同时生产生物柴油。目前，国内开展基于微藻培养的污水深度处理和生物柴油生产相耦合的研究报道较少，筛选适宜污水培养并油脂产率高，易于转化生物柴油的微藻藻株是该工艺的前提和关键。而许多单纯以制备生物柴油为目的的高含油藻种如小球藻、布朗葡萄球藻并不一定能在污水中正常生长并大量积累油脂，并且这些藻株普遍存在培养条件要求高、生物产量低或油脂产率低等问题。因此，筛选优良的藻种对于解决上述问题具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种栅藻及其应用。栅藻,分离于养猪废水处理池中，命名为CHX1,其分类命名为Scenedesmus sp ,己保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No. 6649。所述的栅藻优化培养基，将如下溶质定容至I升Iml A5+Co溶液、5g葡萄糖、3g NaN03、0.04g K2HPO4 3H20、0. 075g MgSO4 7H20、0. 036g CaCl2 2H20、0. 006gFe (NH4)3C18H10O14 >0. OOlg Na2_EDTA、余量为水；所述的A5+Co溶液是将如下溶质定容至I升得到的2.86 g H3BO3U. 81 MnCl2 H20、0. 222 ZnSO4 7H20、0. 079 CuSO4 5H20、0. 39Na2MoO4 2H20、0. 049 Co (NO3)2 6H20、余量为水；优化培养基初始pH=8，接种栅藻培养液后优化培养基的初始浓度为OD69tl=O. 16。所述的栅藻优化培养基的应用，培养栅藻Scenedesmus sp.，CHX1，得到种子培养液。所述的种子培养液的干重生物量和总油脂产率分别为814. I晕克/升.天(范围是809. 6 818. 6毫克/升.天)和128. 3毫克/升.天(范围是127. 5 129.0毫克/升.天)；组成总油脂的脂肪酸中C16-C18成分含量占70%，可用于制备生物柴油。所述的栅藻在处理养猪废水中的应用。所述的养猪废水处理为除氮和/或除磷。本发明的有益效果栅藻培养条件要求低，在污水中生长良好，同时可以高效去除污水中的氮磷。栅藻自身生长速度快，生物产量高，油脂产率高，可以用于制备生物柴油。综上所述，栅藻CHXl在养猪废水处理耦合高价值生物质生产应用中具有广阔的应用前景。
图I为基于18S rDNA部分序列构建的系统发育树。图2为栅藻CHXl最优吸收峰选择。图3为栅藻CHXl在不同培养方式下的生长情况。图4为栅藻CHXl在不同碳源下的生长情况。图5为栅藻CHXl在不同葡萄糖投加量下的生长情况。图6为栅藻CHXl正交优化实验生物量产率。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不限定于所述的实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购买自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例I栅藻CHXl的分离鉴定
一、样品米集
2011年7月从浙江省杭州市萧山区某养殖场废水池采集含有 绿藻的水样。二、栅藻CHXl的分离纯化
分离纯化步骤将采集的水样离心浓缩(5000 r/min,4°C),用无菌水稀释,过60微米目原生动物筛后再过0.45 滤膜。用无菌水多次冲洗滤膜，将滤膜上残留细胞转接于12孔细胞培养板(每孔含已灭菌处理BG-Il培养液1ml，灭菌方式为121°C下高压蒸汽灭菌20分钟)，置于光照培养箱内进行富集培养(培养条件为全天光照，光照强度为40 u molphoton/ m2. s，温度为25°C )。富集培养7天后，适当稀释藻液，吸取稀释藻液涂抹于含I. 5%琼脂的BG-Il固体培养基上,置于光照培养箱内培养数日(培养条件全天光照，光照强度为40iimol photon/ m2. s,温度为25°C ),然后挑选单菌落于液体BG-11培养液中再进行扩大培养(培养条件全天光照，光照强度为40 ii mol photon/ m2. s,温度为25°C,摇床速度150 r mirT1)。得到一株纯藻株，命名为CHX1.
三、栅藻CHXl的鉴定 I.栅藻CHXl的形态鉴定
细胞绿色，常聚集成群；单个细胞形态呈圆形或椭球形，直径为3-6 u m ;色素体周生，内含脂滴；细胞内含有一个清晰可见的蛋白核。
2.栅藻CHXl的分子鉴定
收集指数生长期的细胞，用植物基因组DNA提取试剂盒(南京建成生物技术有限公司)提取基因组DNA，以其为模板扩增18S rDNA基因片段。PCR扩增体系为20 yl，其中含有I ill50ng DNA 模板，0.2iil I. 6-Unit Taq 聚合酶，2yl IOxPCR 反应体系，2 y I 2. 5mM dNTP，正反引物(0. 2iiM)各0. 5iil，双蒸灭菌水13.8u I0 PCR扩增程序为:94°C预变性5min ；94°C变性40s，58。。复性35s，72。。延伸35s，共36个循环；72°C再延伸IOmin。用于扩增18S rDNA的引物为真核生物18S核糖体DNA特定引物，序列如下
正向引物(18SF) :5，-CAGGTCTGTGATGCCC-3，；反向引物(18SR) :5，-ACGGGCGGTG TGTAC -3’ ；
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒回收，交由上海华大基因测序有限公司测序。PCR扩增产物为18S rDNA部分序列，测序结果如序列表的序列所示。测序结果经NCBI 网站 BLAST 比对分析，CHXl 与 Scenedesmaceaesp. (AY197639)的Query coverage值达到100%, Max-Ident为96%。用MEGA 4.0软件进行多序列同源性分析，并根据NJ法构建系统发育树(见图1，分枝上的数值为自举100)。微藻CHXl与Scenedesmaceaesp.很好地聚在一个分枝。基于形态鉴定和分子鉴定的结果,将CHXl鉴定为栅藻(Scenedesmus sp.),己于2012年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No. 6649。实施例2栅藻CHXl生长条件优化
一、栅藻CHXl最佳吸光密度值的确定
为更好的描述栅藻CHXl生长,确定栅藻CHXl的最佳吸光密度值,将含微藻的BGll培养液在600-700nm范围内进行全自动扫描确定。扫描结果见图2。二、栅藻CHXl生长条件优化确定
为了使栅藻CHXl更快更好的生长，在BG-Il培养基基础上进行培养方式、碳源、葡萄糖投加量和培养条件组合优化。I.培养方式优化确定
以BG-Il培养基为基础,设光自养、异养和混养三种培养方式，其中光自养培养条件为光照+BG-Il培养液；异养培养条件为BG-Il培养液+lg/L葡萄糖；混养培养条件为光照+BG-Il培养液+lg/L葡萄糖。将栅藻CHXl分别接种至各培养液中(将OD69tl值为0. 637的栅藻CHXl以10%的体积比接种于各个培养液中，栅藻在培养液中的OD69tl值均为0. 067左右),25°C培养3天,光照强度为40 ii mol photon/ m2. S。检测各个培养液中的OD69c!值,根据OD69tl与藻细胞干物重之间的换算关系式计算生物量产率，结果见图3。2.碳源优化确定
在BG-Il培养基中去除碳酸钠成分的基础上添加不同碳源，以等摩尔浓度碳含量设定各个碳源添加量。将栅藻CHXl分别接种至各培养液中(将OD69tl值为I. 70的栅藻CHXl以20%的体积比接种于各个培养液中，栅藻在培养液中的OD69tl值均为0. 38左右)，25°C培养3天，光照强度为40 ii mol photon/ m2. S。检测各个培养液中的OD69c!值,检测各个培养液中的OD69tl值，根据OD69tl与藻细胞干物重之间的换算关系式计算生物量产率，结果见图4。3.葡萄糖投加量优化确定在确定最佳碳源的基础上，在BG-Il培养中以葡萄糖替代碳酸钠作为碳源,设定不同葡萄糖投加量。将栅藻CHXl分别接种至各培养液中(将OD69tl值为0. 8的栅藻CHXl以10%的体积比接种于各个培养液中，栅藻在培养液中的OD69tl值均为0. 08左右)，25°C培养3天，光照强度为40 V- mol photon/ m2. S。检测各个培养液中的OD69tl值,根据OD69tl与藻细胞干物重之间的换算关系式计算生物量产率，结果见图5。4.最佳培养条件组合确定
采用L9 (34)正交实验表进一步优化培养条件组合，以葡萄糖投加量、硝酸盐投加量、初始PH和接种浓度为考察指标，筛选最佳 条件组合，具体设计方案见表I。将栅藻CHXl分别接种至各培养液中，25°C培养3天,光照强度为40 ii mol photon/ m2. S。检测各个培养液中的OD69tl值，根据OD69tl与藻细胞干物重之间的换算关系式计算生物量产率，具体结果见图6。表I L9 (34)正交实验表设计方案
权利要求
1.一种栅藻，其特征在于分离于养猪废水处理池中，命名为CHX1，其分类命名为Scenedesmus sp.,己保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号是 CGMCC No. 6649。
2.一种如权利要求I所述的栅藻优化培养基，其特征在于将如下溶质定容至I升Iml A5+Co 溶液、5g 葡萄糖、3g NaNO3>O. 04g K2HPO4 · 3Η20、0· 075g MgSO4 · 7Η20、0· 036gCaCl2 · 2Η20、0· 006g Fe(NH4)3C18HltlO14、0· OOlg Na2_EDTA、余量为水；所述的 A5+Co 溶液是将如下溶质定容至 I 升得到的2. 86 g H3BO3U. 81 MnCl2 · Η20、0· 222 ZnSO4 · 7Η20、0· 079CuSO4 · 5Η20、0· 39 Na2MoO4 · 2Η20、0· 049 Co (NO3) 2 · 6Η20、余量为水；优化培养基初始 ρΗ=8，接种栅藻培养液后优化培养基的初始浓度为OD69tl=O. 16。
3.—种如权利要求2所述的栅藻优化培养基的应用，其特征在于所述的栅藻优化培养基培养栅藻Scenedesmus sp. , CHX1,得到种子培养液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的种子培养液的干重生物量和总油脂产率分别为809. 6-818. 6毫克/升·天和127. 5-129. O毫克/升·天；组成总油脂的脂肪酸中C16-C18成分含量占70%，用于制备生物柴油。
5.一种如权利要求I所述的栅藻在处理养猪废水中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的养猪废水处理为除氮和/或除磷。
全文摘要
本发明公开了一株栅藻及其应用。分离于养猪废水处理池中，命名为CHX1，其分类命名为Scenedesmus sp.，己保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.6649。栅藻优化培养基，将如下溶质定容至1升1mlA5+Co溶液、5g葡萄糖、3gNaNO3、0.04gK2HPO4·3H2O、0.075gMgSO4·7H2O、0.036gCaCl2·2H2O、0.006gFe(NH4)3C18H10O14、0.001gNa2-EDTA、余量为水；栅藻优化培养基培养栅藻Scenedesmus sp.，CHX1，得到种子培养液。种子培养液可用于制备生物柴油和处理养猪废水。本发明提供的栅藻CHX1在养猪废水中生长良好，同时可以高效去除废水中的氮磷；栅藻CHX1自身生物产率和油脂产率均较高，脂肪酸成分中C16-C18占70%以上，适于生产生物柴油。
文档编号C12P7/64GK102978118SQ20121046915
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者程海翔, 田光明 申请人:浙江大学