垃圾渗滤液毒性评价方法
【专利摘要】本发明涉及废水检测【技术领域】，特别是一种垃圾渗滤液毒性评价方法；包括以下步骤：(1)取垃圾渗滤液，制备测试样液；(2)通过重组基因芽孢对测试样液进行体外生物毒性定量评价；(3)以早期发育的鱼类为受试生物材料，暴露于测试样液中，检查鱼类的生长发育繁殖和基因转录变化情况，获得垃圾渗滤液生物毒性真实定量检测结果；(4)以斜生栅藻－多刺裸腹溞－斑马鱼为受试模拟生态系统，暴露于测试样液中，评价垃圾渗滤液毒性物质的生物富集、世代传递效应，获得相关检测结果；本发明所述方法具有快速高效、精确量化、真实可靠、多层次评价等诸多优点，具有很高的实用价值和广阔的市场前景。
【专利说明】垃圾渗滤液毒性评价方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及废水检测【技术领域】，特别是一种垃圾渗滤液毒性评价方法，用于垃圾渗滤液的生态风险和对人体健康危害的评估。
【背景技术】
[0002]垃圾渗滤液是指垃圾在堆放和填埋过程中由于压实、发酵等生物化学降解作用，同时在降水和地下水的渗流作用下产生了一种高浓度的有机或无机成份的液体。
[0003]随着经济发展水平的提高，城镇化进程的加快，垃圾量与日俱增，垃圾渗滤液的污染问题日益严峻，引起了政府和民众的广泛关注。如何实现我国城市垃圾的减量化、无害化、资源化是摆在我们面前的一项重要的社会发展战略任务。由于卫生填埋处理方法具有经济、简单易行、技术成熟等优点，一直是国内外城市固体废物的主要处置方式。中国有95%以上的城市生活垃圾采用填埋处理，但是由于资金和技术手段的限制，绝大多数填埋场只是进行简单的填埋处理，大多未经科学的设计与防护处理，有的甚至直接露天堆放或简单掩埋，造成了周围树木、植被枯死，土壤干裂，地表水、地下水污染等诸多生态环境问题，严重影响城市环境质量和生态文明建设。
[0004]众所周知，垃圾填埋所产生的垃圾渗滤液因组分复杂、毒性大、处理困难，成为目前人们最为关注的环境污染问题。垃圾渗滤液具有高浓度、高毒性的特点，通常含有大量的有毒有机化合物、高浓度的含氮化合物、各种金属离子，以及各种病原体。近年来，随着工农业生产、塑料制品的大量使用，多个国家和地区垃圾填埋场渗滤液中检出含有邻苯二甲酸酯、双酚A、烷基酚、有机锡化合物、有机氯农药、有机磷农药、多氯联苯、多溴联苯醚、二噁英类物质和多环芳烃等多种具有内分泌干扰效应的物质。同时，随着大量药物的使用和废弃，如避孕药类、类固醇类药物、抗生素等，最终随垃圾进入环境中，对生态环境和人体健康造成风险。
[0005]目前，针对垃圾渗滤液中单一有毒化合物的化学分析方法屡见不鲜，生物毒性评价数据也不乏报道。然而，缺乏对于成分复杂、有毒物质种类繁多的垃圾渗滤液的联合生物毒性的定量评价方法。
【发明内容】
[0006]本发明为了弥补现有评价方法在评价垃圾渗滤液的生态风险和对人体健康危害等方面存在的不足而提供的一种垃圾渗滤液毒性评价方法。
[0007]为达到上述功能，本发明提供的技术方案是:
[0008]一种垃圾渗滤液毒性评价方法，包括以下步骤:
[0009](I)、取垃圾渗滤液，制备测试样液；
[0010](2)、通过重组基因芽孢对所述测试样液进行体外生物毒性定量评价，获得生物毒性评价量化检测结果；
[0011](3)、以早期发育的鱼类为受试生物材料，暴露于所述测试样液中，检查所述鱼类的生长发育繁殖和基因转录变化情况，通过解剖镜检观察早期发育的所述鱼类对所述测试样液中存在的有毒污染物的选择性摄食作用和代谢分解作用，剔除步骤(2)中检测结果中的假阳性结果，修正检测结果，获得垃圾渗滤液生物毒性真实的定量检测结果。
[0012](4)、将斜生栅藻长期暴露于所述测试样液中，再以所述斜生栅藻为饲料，喂养初级消费者多刺裸腹潘，受污染的多刺裸腹潘继续喂养次级消费者斑马鱼，形成斜生栅藻一多刺裸腹潘一斑马鱼三层级生态系统，观察斑马鱼子代的存活率、平均繁殖量、不同子代对垃圾渗滤液有毒有机物的生物富集系数和遗传基因变化，评价垃圾渗滤液毒性物质的生物富集、世代传递效应，获得相关检测结果。
[0013]优选地，步骤(I)中所述测试样液为垃圾渗滤液的原液、稀释10倍的稀释液和稀释100位的稀释液。
[0014]优选地,步骤(2)中所述的重组基因芽孢为er α，vtg, cypl9alb, rxr y雌激素受体基因转染的枯草芽孢杆菌，经营养匮乏条件培养后繁殖，形成芽孢；重组基因芽孢在垃圾渗滤液暴露过程中，芽孢中的雌激素受体基因(era，vtg，cypl9alb，rxrY)被垃圾渗滤液中的雌激素活性物质激活，从而在蛋白质转录和合成过程中，基因Lac-Z也同时被激活，转录成β_半乳糖苷酶，通过测定β_半乳糖苷酶活性定量表征垃圾渗滤液的生物毒性。
[0015]优选地，步骤(3)中所述的鱼类为斑马鱼或红鳟鱼。
[0016]本发明的有益效果在于:
[0017]1、芽孢的天然抗性，较其他细菌载体更加适应垃圾渗滤液的高盐、高毒性，采用转染雌激素受体基因的芽孢，可以更加准确实现定量评价垃圾渗滤液的生物毒性，屏蔽其他毒性干扰，很好地解决了垃圾渗滤液成分复杂、体外生物评价载体选择困难，无法检测联合生物毒性的紧迫问题；
[0018]2、本发明采用早期斑马鱼体内生物毒性评价方法，更加真实地模拟了水体被垃圾渗滤液污染后，水生动物在摄取、代谢过程中的生物毒性效应，更加真实反映垃圾渗滤液的实际污染情况和水生动物毒性效应，可以弥补体外生物毒性评价方法的不足，修正其假阳性结果，使得垃圾渗滤液的生物毒性评价结果更加真实可靠；
[0019]3、本发明所采用的三层级模拟生态系统，更加真实地再现了垃圾渗滤液污染后水体中，污染物质在生态系统生物链传递过程中的生物富集效应和世代传递效应，贴近生态环境真实情况，可以更加准确地评估垃圾渗滤液污染对区域生态污染的风险，为决策者提供有力的工具手段。
[0020]综上，本发明所述方法具有快速高效、精确量化、真实可靠、多层次评价等诸多优点，具有很高的实用价值和广阔的市场前景，有望成为控制垃圾渗滤液污染的重要评价检测手段。
【具体实施方式】
[0021]现有某简易垃圾填埋场渗滤液原液排放至下游河流，采样经检测COD为2800mg/L，氨氮为2130mg/L，采用本发明方法对该垃圾渗滤液的生物毒性进行评价。
[0022]首先，提取该垃圾渗滤液并根据该垃圾渗滤液制作以下三种测试样液:垃圾渗滤液原液、稀释10倍稀释液、稀释100倍的稀释液。
[0023]众所周知，垃圾渗滤液具有高盐度、高化学毒性、高生物毒性等特点，而芽孢与其他细菌载体相比，具有天然的抗性，而且繁殖速度快、特异性强，适合作为雌激素受体基因的载体。因此，可以转染er α，vtg, cypl9alb, rxr Y雌激素受体基因至枯草芽孢杆菌体内，经营养匮乏条件培养后繁殖形成芽孢。在本实施例中，采用重组era基因芽孢，分别暴露于此垃圾渗滤液原液、稀释10倍稀释液、稀释100倍的稀释液各IL的测试样液中72h，取出通过荧光光度计，暴露于垃圾渗滤液原液、稀释10倍稀释液、稀释100倍稀释液的试样分别测定酵母蛋白中β -半乳糖苷酶活性定量表征垃圾渗滤液的生物毒性，以17-β -雌二醇为标准比对物，其生物毒性平均值相当于66.4ng/L(17-13 -雌二醇雌活性当量)，结论是垃圾渗滤液具有内分泌干扰毒性，排入环境水体中对水生生态系统具有外源性内分泌干扰风险，可以导致人体内分泌失调、生殖障碍、基因突变、畸变等疾病。
[0024]对于成分复杂的垃圾渗滤液，重组基因芽孢法可能在评价过程中存在假阳性结果，因此，综合采用具有代表性的水生生物，早期发育斑马鱼作为体内生物毒性评价方法的受试生物，对垃圾渗滤液的内分泌干扰毒性更加敏感，可以准确模拟垃圾渗滤液污染水体后，水生动物在摄取、代谢过程中的生物毒性效应，更加贴近实际污染情况和毒性效应，所得结果可以修正重组基因芽孢法评价的假阳性结果，使得垃圾渗滤液的生物毒性评价结果更加真实可靠。因此，采用20只早期发育雄性斑马鱼暴露于渗滤液原液、稀释10倍稀释液、稀释100倍稀释液，十二天后，暴露于原液和稀释10倍稀释液的全部致死，暴露于稀释100倍垃圾渗滤液，早期发育雄性斑马鱼生长卵巢，孵化率下降70%，雌激素受体基因era转录水平提高73%，复核体外生物毒性评价结果，结论正确。
[0025]最后，以分别暴露于渗滤液原液、稀释10倍稀释液、稀释100倍稀释液12天生长的斜生栅藻为饲料，喂养多刺裸腹潘，选取成年受污染潘继续喂养斑马鱼，与空白组相比，斑马鱼子代的存活率分别下降了 55%、36%、33%，第一代和第二代生物富集系数分别为
0.86和0.83，染色体数目异常，发现遗传基因毒性。
[0026]因此，通过本发明的方法能对成份复杂的垃圾渗滤液的生物毒性进行定量评价，并能够评价污染物质在生态系统生物链传递过程中的生物富集效应和世代传递效应，贴近生态环境真实情况，可以更加准确地评估垃圾渗滤液对区域生态污染的风险，为决策者提供有力的工具手段。
[0027]以上所述实施例，只是本发明的较佳实例，并非来限制本发明的实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明专利申请范围内。
【权利要求】
1.一种垃圾渗滤液毒性评价方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)、取垃圾渗滤液，制备测试样液； (2)、通过重组基因芽孢对所述测试样液进行体外生物毒性定量评价，获得生物毒性评价量化检测结果； (3)、以早期发育的鱼类为受试生物材料，暴露于所述测试样液中，检查所述鱼类的生长发育繁殖和基因转录变化情况，对步骤(2)中检测结果的假阳性部分进行修正，获得垃圾渗滤液生物毒性真实的定量检测结果； (4)、将斜生栅藻长期暴露于所述测试样液中，再以所述斜生栅藻为饲料，喂养初级消费者多刺裸腹潘，受污染的多刺裸腹潘继续喂养次级消费者斑马鱼，形成斜生栅藻一多刺裸腹潘一斑马鱼三层级生态系统，观察斑马鱼子代的存活率、平均繁殖量、不同子代对垃圾渗滤液有毒有机物的生物富集系数和遗传基因变化，评价垃圾渗滤液毒性物质的生物富集、世代传递效应，获得相关检测结果。
2.如权利要求1所述的垃圾渗滤液毒性评价方法，其特征在于:步骤(I)中所述测试样液为垃圾渗滤液的原液、稀释10倍的稀释液和稀释100位的稀释液。
3.如权利要求1所述的垃圾渗滤液毒性评价方法，其特征在于:步骤(2)中所述的重组基因芽孢为er α，vtg, cypl9alb, rxr y雌激素受体基因转染的枯草芽孢杆菌，经营养匮乏条件培养后繁殖，形成芽孢。
4.如权利要求1所述的垃圾渗滤液毒性评价方法，其特征在于:步骤(3)中所述的鱼类为斑马鱼或红鳟鱼。
【文档编号】G01N33/50GK104034877SQ201410221885
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】陆钢, 刘鹏, 崔海波 申请人:东莞道汇环保科技有限公司