用于无菌性测试的盒的制作方法

用于无菌性测试的盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于使细胞生长的装置，其称为盒。细胞培育装置包括壳体，壳体包含：具有透光窗的盖；流体分配通道；在流体方面连接到流体分配通道上的样本注射端口；容纳多孔介质垫的底座；以及在流体方面连接到介质垫上的介质注射端口。盖匹配到底座上而形成无菌密封；流体分配通道设置在可通过光学窗观察到的介质垫上；以及引入流体分配通道中的样本流体例如经由多个通道而均匀地分配到介质垫。本发明还提供套件，其包括本发明的盒和管道组。
【专利说明】用于无菌性测试的盒
[0001]与相关申请的交叉引用
本申请要求2011年9月7日提交的美国临时申请N0.61/556, 390以及2012年4月16日提交的美国临时申请N0.61/624，499，它们中的各个通过引用而结合在本文中。

【技术领域】
[0002]本发明涉及细胞生长和检测的领域。

【背景技术】
[0003]在许多行业中，特别是在食品、饮料、医疗保健、电子和制药行业中，快速地分析样本被微生物(诸如细菌、酵母或霉菌)污染的程度是重要的。
[0004]—种称为微生物计数或菌落计算的微生物培育技术对样本中的微生物细胞的数量进行量化。基于现场微生物复制的微生物计数方法大体为样本中的各个可培育的微生物细胞或细胞群产生一个可通过视觉检测的“菌落”，这称为菌落形成单元或CFU。因而，计算可见菌落允许微生物学家精确地确定样本中的微生物CFU的数量。为了执行微生物计数，细菌细胞可散布在佩特里(Petri)培养皿(“琼脂板”)中的营养琼脂的表面上且在容许现场细菌复制的条件下进行培养。微生物计数是简单的、非常敏感的、廉价的且是定量的，但是典型地也是慢的。所需的长时间导致医疗保健和制造的成本增加。
[0005]需要另外的培育装置和方法来进行微生物计数。


【发明内容】

[0006] 本发明提供用于使生长细胞的装置，其称为盒(cassette)。一方面，本发明的特征在于细胞培育装置，其包括壳体，壳体包含:具有透光窗的盖(盖可为可移除或可为不可移除的)；流体分配通道，例如，其为单个通道或连接到多个通道上；样本注射端口，其在流体方面连接到流体分配通道；容纳多孔介质垫的底座；以及介质注射端口，其在流体方面连接到介质垫。盖匹配到底座上而形成无菌密封；流体分配通道设置在可通过光学窗观察到的介质垫上；并且引入到流体分配通道中的样本流体例如经由多个通道而均匀地分配到介质垫。在某些实施例中，装置进一步包括设置在介质垫上的隔膜，其中，样本流体中的细胞保留在隔膜上，并且可通过光学窗观察到。备选地，介质垫可具有足够的孔隙率，以用作隔膜。盖和隔膜之间的空间可进行加压。在其它实施例中，盒进一步包括排泄端口。还可包括氧清除剂，其足以使装置的内部无氧。在某些实施例中，盒进一步包括用于氧清除剂的促动器，例如，通过翻转盖或通过拉片或推杆来启动促动器，通过位于盒的顶部上的隔膜而接近拉片或推杆。本发明的盒可包括释压阀，并且/或者底座可进一步包括通道，在引入流体时，通道释放介质垫中的压力。盒还可包括介质分配通道，介质分配通道连接到介质注射端口上且可选地围绕介质垫的周缘具有多个出口，其中，经由介质注射端口引入的介质经由介质分配通道而均匀地分配到介质垫。介质分配通道可完全或部分地由底座中的插件形成，例如，图中描绘的流体环。盒还可包括氧指示器。在某些实施例中，流体分配通道包括例如连接到多个通道上的螺旋导槽。当流体分配通道为单个通道时，其可围绕介质垫包括倾斜周向区域。盒还可包括设置在流体分配通道的顶部上的覆盖物。覆盖物可确定流体流的形状，以通过单个通道而实现向介质垫的均匀分配。盒还可进一步包括通气端口，其用于在引入液体时对盒的内部进行通气。通气端口可为自密封的，例如，直到连接到本发明的管道组上。
[0007]在相关方面，本发明的特征在于用于检测细胞的套件，其包括本发明的盒，以及管道组，管道组包括具有连接器的管道，连接器具有针且匹配到样本注射端口、介质注射端口、通气端口或排泄端口上。连接器可进一步包括隔片，针穿过隔片，并且连接器可匹配到样本注射端口、介质注射端口、通气端口或排泄端口上，并且当针和管道被移除时，与隔片一起密封端口。套件可进一步包括第二管道组和可选的第三管道组，它们具有连接器，连接器具有针，其中，管道组的连接器匹配到样本注射端口、介质注射端口、通气端口和排泄端口中的一个上。第一管道组、第二管道组和可选的第三管道组的管道可共享公共入口或出口。连接器可包括夹具，夹具搭扣到盒中。管道组可进一步包括多个单独的管道，用于进行下者中的至少两个:样本引入、介质引入、排泄和通气。连接器可包括用于各个管道的针。当一个管道用于通气时，该管道可包括过滤器(例如，以防止细菌或流体的释放)和/或释压阀。
[0008]本发明的盒和套件可在用于细胞的生长、化验或维持(maintaine)的任何方法中使用，包括计数、检测、诊断或治疗反应。
[0009]根据以下描述和权利要求，其它特征和优点将是显而易见的。

【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1A和IC是盒的分解视图。图1B是盒的横截面。图1D是盒的底座的横截面，其示出介质注射端口、排泄端口、介质垫和介质分配通道。图1E是移除了盖的盒的视图，其显示用于氧清除剂的托盘。如在插图中显示的那样，底座包括两个止动件。第一止动件允许盖密封盒，而不促动氧清除剂。通过将盖翻转到第二止动件，盖上的突出部刺穿氧清除剂上的密封件。图1F是备选盖实施例的图。
[0011]图2A是盒的一个实施例的分解视图。图2B是盒的横截面。图2C是用于有氧和无氧用途的盒的图。
[0012]图3A是盒的一个实施例的分解视图。图3B是有氧盒的横截面。图3C是无氧盒的横截面。图3D是用于有氧和无氧用途的盒的图。
[0013]图4A是盒的一个实施例的分解图。图4B是无氧盒的横截面。
[0014]图5A-5B是盒的俯视图，盒包括具有螺旋导槽的流体分配通道，螺旋导槽具有两个螺旋线。
[0015]图5C是盒的俯视图，盒包括外部导槽和具有多个通道的内部导槽。
[0016]图是盒的俯视图，盒包括外部导槽和具有单个通道的内部导槽。
[0017]图6A是具有多个通道的流体分配通道的图，其中覆盖物就位。图6B是移除了覆盖物的流体分配通道的图。图6C是覆盖物的图。
[0018]图7A是具有单个通道的流体分配通道的图，其中覆盖物就位。图7B是移除了覆盖物的流体分配通道的图。图7C是覆盖物的图。
[0019]图8是盒底座的图。
[0020]图9A是本发明的管道组的示意性描绘。管道组具有匹配到盒上的三个连接器，以及用于在样本或介质输送或废料移除中使用的安全铠装针。图9B是管道组的示意性描绘，管道组的隔片在使用之后保留在盒中。在这个示例中，连接器包括凹槽，凹槽搭扣到包围盒上的端口的对应的特征上。
[0021]图1OA是本发明的管道组的示意性描绘。管道组具有终止在匹配到盒上的带键针夹具中的三个连接器(例如分支)，以及用于在样本或介质输送或废料移除中使用的安全铠装针(未显示)。每个盒存在两个流体管线。图1OB是安装在盒中的管道组的示意性描绘。带键针夹具规定管道组仅可以预先限定的定向插入。
[0022]图1lA是本发明的管道组的示意性描绘。管道组具有终止在匹配到盒上的带键针夹具中的三个连接器(例如分支)，以及用于在样本或介质输送或废料移除中使用的安全铠装针(未显示)。每个盒存在三个流体管线。显示的通气管线连结到公共阀和过滤器上，但是管道组可对各个盒采用单独的通气管线。图1lB是安装在盒中的管道组的示意性描绘。带键针夹具规定管道组仅可以预先限定的定向插入。
[0023]图12示出包装好的测试套件的一个可行变型，其中，透气的接近面板被移除。
[0024]图13是一系列显微照片，其显示本发明的盒中的细菌的生长。
[0025]图未必按比例绘制。

【具体实施方式】
[0026]本发明的特征在于捕捉和培育细胞(例如，微生物或包含微生物的细胞)的装置和使用这些装置的方法。一个示例是包含营养介质的盒，其可用于自动快速计数系统中，诸如Growth Direct ?系统(马萨诸塞的贝德福德的Rapid Micro B1systems公司),例如，如美国公开N0.2003/0082516中描述的那样，该公开通过引用而结合在本文中。在一个实施例中，本发明提供完全包含的闭环无菌性测试，这允许终端使用者通过隔膜(例如，
0.45 μ m)过滤样本,添加营养介质来支持生长和例如在Growth Direct "*系统上对盒成像，而不使样本或其它内部构件暴露于可能的外部污染。盒可用于有氧或无氧条件下。多个盒可在套件中包装在一起，例如，至少一个盒将构造成进行有氧测试，并且一个构造成进行无氧测试。本发明还提供管道组来允许引入样本、营养介质和/或排出过量流体。管道组还可允许在多个盒中均匀地分配样本。
[0027]盒
大体上，本发明的盒将包括:具有透光窗的盖；流体分配通道；在流体方面连接到流体分配通道的样本注射端口 ；容纳多孔介质垫的底座；以及在流体方面连接到介质垫的介质注射端口。样本注射端口典型地位于盖的侧部上，但是还可位于顶部上。在某些实施例中，盖由透光材料制成。备选地，透光窗容纳在光学框架内。
[0028] 在某些实施例中，流体分配通道包括多个通道。这种盒的多个视图显示在图1A-1F中。图显示具有透光窗的盖、容纳介质垫的底座、样本注射端口、介质注射端口和流体分配通道，流体分配通道包括稳定通道，以及用于将样本分配到介质垫的多个通道。还显示了排泄端口和隔膜，隔膜可为可移除的或可为不可移除的。典型地，盖匹配到底座上而形成无菌密封，该无菌密封可为气密性的或可为不是气密性的。隔膜定位在介质垫上，以便可通过光学窗观察到。图1F显示盖，其由透光材料制成或具有容纳在光学框架内的透光窗。样本注射端口位于盖的顶部上，但是还可位于侧部上。
[0029]图2A-2C中显示的备选盒的多个视图。图显示具有透光窗的盖、容纳介质垫的底座、样本注射端口、介质注射端口和流体分配通道，流体分配通道包括稳定通道，以及用于将样本分配到介质垫的多个通道。还显示了排泄端口和隔膜，隔膜可为可移除的或可为不可移除的。典型地，盖匹配到底座上而形成无菌密封，无菌密封可为气密性的或可为不是气密性的。隔膜定位在介质垫上，以便可通过光学窗观察到。图2C显示盖，其具有容纳在光学框架内的透光窗。备选地，盖由透光材料制成。样本注射端口位于盖的侧部上，但是还可位于顶部上。这个盒的特征在于盖中的释压阀。
[0030]图3A-3D中显示了另一个盒的多个视图。图显示具有透光窗的盖、容纳介质垫的底座、样本注射端口、介质注射端口和流体分配通道，流体分配通道包括稳定通道和用于将样本分配到介质垫的多个通道。还显示了排泄端口和隔膜，隔膜可为可移除的或可为不可移除的。典型地，盖匹配到底座上而形成无菌密封，无菌密封可为气密性的或可为不是气密性的。隔膜定位在介质垫上，以便可通过光学窗观察到。图3B和3C显示这个盒的有氧和无氧版本。图3D显示盖，其具有容纳在光学框架内的透光窗。备选地，盖由透光材料制成。样本注射端口位于盖的侧部上，但是还可位于顶部上。盖还包括通气端口(图3D)。
[0031 ] 本发明的盒可包括流体分配通道，流体分配通道通过单个通道将流体输送到介质垫上。这种盒显示在图4A-4B中。图显示具有透光窗的盖、容纳介质垫的底座、样本注射端口、介质注射端口和流体分配通道，流体分配通道包括用于将样本分配到介质垫的稳定通道。还显示了排泄端口和隔膜，隔膜可为可移除的或可为不可移除的。典型地，盖匹配到底座上而形成无菌密封，无菌密封可为气密性的或可为不是气密性的。隔膜定位在介质垫上，以便可通过光学窗观察到。样本注射端口位于盖的侧部上，但是还可位于顶部上。盖还包括通气端口。
[0032]流体分配通道可包括或可不包括螺旋导槽。螺旋导槽设计成平息过量湍流，并且例如经由多个通道将样本均匀地分配到介质垫或定位在介质垫的顶部上的隔膜。如显示在图5A-5C中，导槽典型地包括围绕装置的两个环路，但是可采用三个或更多个环路。当存在时，导槽可经由单个通道或多个通道(图5A-5D)将流体提供给介质垫。图显示采用单个流体分配通道的备选盒。如图5D中显示,盒包括沿周向包围介质垫的倾斜表面。流体围绕表面流动且流到介质垫上。在具有通往介质垫的多个通道的盒中，还可在倾斜周向表面上或倾斜周向表面中形成多个通道。盒可包括或可不包括覆盖流体分配通道的构件，流体分配通道具有或不具有螺旋导槽或多个通道，例如，图1A-4B。用于多个通道的示例性覆盖物显示在图6A-6C中。图6A显示具有多个通道的流体分配通道，其中覆盖物就位。图6B显示具有多个通道的流体分配通道。图6C显示用于多个通道的覆盖物。用于单个流体分配通道的示例性覆盖物显示在图7A-7C中。图7A显示具有单个通道的流体分配通道，其中覆盖物就位。图7B显示单个流体分配通道。图7C显示用于单个通道的覆盖物。这个覆盖物包括流体操纵器，其随着流体分配通道进入倾斜周向区域而减小流体分配通道的柱高度。流体操纵器还可使流体沿着通往介质垫的表面散开。盒还可包括定位在流体分配通道上面的防溅罩，其中，样本输送到介质垫。防溅罩可形成覆盖物的端口或为单独的构件。介质垫和隔膜(如果存在的话)的边缘典型地被流体分配通道或覆盖物或防溅罩覆盖，以防止边缘被成像。
[0033]介质垫设计成容纳用于细胞的生长或维持的介质。在某些实施例中，介质垫的大小设置成容纳足够的介质，以便细胞生长一个星期、两个星期或更长时间。介质经由介质注射端口输送到垫。介质注射端口典型地位于底座的侧部或底部上。盒还可包括连接到介质注射端口上的介质分配通道。介质分配通道可围绕介质垫的周缘具有多个出口，以将介质均匀地分配到介质垫。具有介质垫的示例性底座显示在图8中。
[0034]当介质引入盒中时，介质为液体，并且介质可在垫中保持为液体或在垫内呈凝胶或以别的方式凝固。示例包括LB液体培养基或沙保(Sabouraud)葡萄糖琼脂(SDA)、R2A琼脂、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)、平板计数琼脂(PCA)、Schaedler血琼脂或没有琼脂凝固剂的类似介质。隔膜可置于介质垫上，例如，置于流体分配通道和垫之间。隔膜具有足以保留关注的细胞同时使流体穿过的孔。孔大小的示例为0.45μπι和0.22μπι。隔膜可与介质垫分开或与介质垫成整体。备选地，介质垫的表面可经过制造或处理，以产生隔膜。
[0035]盒可包括或可不包括氧清除剂，氧清除剂使盒无氧(例如，图1Ε、2Α和3Α)。氧清除剂典型地在盒内存储在密封托盘或隔室中，其在盒内部的确切位置不是关键的。一旦样本和介质已经输送到盒，然后就可破坏密封。用于破坏密封的各种方法在本领域是已知的。在一个实施例中，密封的隔室位于盖(或底座)上的突出部附近。盖可翻转，以使突出部刺破清除剂上的密封件(图1Ε)。还可通过拉片进行促动，通过位于盒的外侧上的隔膜或隔片(图2Α和3Α)来接近拉片。示例性氧清除剂包括氧化铁、葡糖氧化酶或类似的试剂。盒还可包括内部氧含量的指示器，其位于盒的内部中。适当的指示器在本领域中是已知的。
[0036]盒的入口和出口端口优选为自密封的，例如，橡胶隔片或其它自关闭阀。如下面论述的那样，盒可设置成不具有自密封部分，自密封部分在使用之前进行安装。除了样本注射端口和介质注射端口之外，盒可包括例如位于底座的底部或侧部上的排泄端口。盒可包括或可不包括用以控制盒内部的最大压力的释压阀。盖和隔膜之间的空间也可进行加压，例如，以防止过量介质汇聚在垫的顶部上或通过隔膜泄露。底座还可包括通道或其它区域，以允许在对垫引入介质期间释放压力。
[0037]优选地，盒能够在载体中堆叠，例如，载体设计成将一组盒转移和引入到自动成像仪器。盒的这种自动搬运可包括运输、在盒和载体之间的对接、用于自动搬运的定位，以及机械手转移的能力。盒还可设计成允许可重复的机械定位，即，反复地能够使同一盒返回到同一位置，以进行自动成像。
[0038]盒还可包括有利于多个像对准的设计特征。成像基准标记包括在荧光塑料或介质上的贯通孔口。成像基准标记还包括在盒上的印刷的或压印的荧光材料。其它基准标记在本领域是已知的。
[0039]在本领域中已知用于制造盒的各种构件的材料。这样的材料包括塑料、聚合物、金属、玻璃和陶瓷。在各种实施例中，盒有利于例如通过采用具有与这种检测相当的荧光属性的材料对包含少于500个细胞的自发荧光微生物微菌落的自动成像。示例性材料是黑K-Resin?(苯乙烯-丁二烯-共聚物；Chevron Phillips公司)。盒还可采用具有与自发荧光微生物微菌落的检测相当的荧光属性的透明盖。盖的示例性材料为Zeonor?1060R(聚环烯树脂；Zeon Chemicals LP公司)。还可采用玻璃。还可采用多孔隔膜，其具有与自发荧光微生物微菌落的检测相当的荧光属性。隔膜可由包括下者的材料制成:纤维素、醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯对苯二甲酯、聚烯烃、乙烯-醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、聚四氟乙烯、尼龙和硅酮共聚物。隔膜的选择部分地取决于要培育的细胞的类型(例如，附连到表面上(取决于锚定(anchorage))而生长的微生物、在悬浮液中生长的微生物(独立于锚定)或附连到表面上或在悬浮液中生长的微生物)、渗透度和流体和气体的转移速率。示例性隔膜为黑混合纤维素酯隔膜(Sartorius AG公司)。盒的将不成像的部分可由任何适当的材料制成，例如，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯或丙烯腈苯乙烯。示例性介质垫由烧结聚乙烯(Porex公司)形成，烧结聚乙烯可提供预先限定的孔大小和孔空间。
[0040]管道组
本发明还提供管道组，其允许与盒进行无菌连接。管道组包括至少一个连接器，其与本发明的盒的入口或出口端口匹配。可使管道的另一端开口，例如，以进行排泄或滑到喷嘴或其它流体源或槽。备选地，另一端可包含连接器，例如鲁尔(Luer)锁、针或类似的配件。管道组可设计成将流体从一个源输送到多个盒或入口或从多个盒或出口移除流体。各个管道组可由单独的泵促动，例如，蠕动泵，或多个管道组可由单个泵促动。
[0041 ] 在一个实施例中，与盒匹配的连接器包括针，针被防护件包围，使得针的尖部相对于防护件的边缘向后间隔开。防护件匹配到盒上的端口上，并且针提供流体连接，以输送或移除流体。在图9A-9B中显示的具体实施例中，连接器包括包围针的隔片。连接器匹配到盒上的端口上和锁定就位。一旦完成流体输送或移除，就可移除针和管道，而使隔片就位，从而密封盒(图9B)。
[0042]在图10A-10B中显示的另一个实施例中，连接器包括两个单独的流体管线，即，管道，其各自具有其自己的针，并且构造成防止不恰当地安装到盒中。在这个构造中，连接器搭扣就位，从而对使用者提供关于已经实现了恰当的插入的正反馈(图10B)。流体管线的数量可如特定用途所需要的那样增加。图11A-11B显示管道组的示例，其包括三个流体管线，管线中的一个提供释压。释压管线可包括释压阀和过滤器，如显示的那样。一旦完成流体输送或移除，就可通过轻轻地挤压连接器同时将其拉离盒来移除针和管道。
[0043]可通过与针进行额外的连接来另外接近盒。连接器可通过任何适当的机构与盒匹配，例如，螺纹、鲁尔锁、摩擦配合和搭扣配合。一个或多个管道组(例如，各自用于样本和介质输送和废料移除)还可在套件中与一个或多个盒包装在一起。
[0044]管道组的管道可由任何适当的材料制成，诸如聚乙烯、聚四氟乙烯和Tygon?柔性管道。连接器和针可由金属(例如不锈钢)、塑料、陶瓷或其组合制成。
[0045]使用方法
本发明的盒和管道组可用于细胞的生长或维持，包括检测、计数、诊断和治疗反应。示例性使用领域包括测试液体、空气或表面样本的微生物负载；测试工业样本、无菌制药产品样本、非无菌制药产品样本的微生物负载；以及测试样本的无氧微生物负载。可结合本文描述的盒来采样任何可培育的细胞类型，包括细菌、蓝藻细菌、原生动物、真菌、哺乳动物细胞、植物细胞或其它真核细胞。盒可用于有氧和无氧测试。盒可包装在无菌套件中或通过最终使用者来灭菌(图12)。盒将典型地用于使用层流罩或隔离室的实验室环境中。
[0046]在典型的实验中，盒被灭菌，或盒设置成预先灭菌的。漂洗前流体、样本介质流体和漂洗后流体通过样本注射端口引入。在进入盒之后，流体将行进通过流体分配通道，流体分配通道可包括螺旋的稳定通道，以在流体传送穿过隔膜的面之前平息过量的湍流。穿过隔膜的面将这些流体引入密封室中可导致陷在盒中的残余空气在流体柱上升时压缩，导致对光学窗的下侧形成保护性阻隔。在完成采样和漂洗步骤之后，额外的空气可泵送到盒中，以确保所有流体被迫通过隔膜和/或介质垫。这可导致隔膜上方的室被加压。
[0047]营养介质然后经由介质注射端口泵送到介质垫中。介质被介质垫吸收，并且提供食品源达规定的时间段，例如，至少7或14天。可使用例如具有0.45 μ m孔大小的隔膜以及盖和隔膜之间的室的加压来阻止过量的营养介质传送通过隔膜。
[0048]当存在排泄端口时，过量的样本或介质流体可经由排泄端口从盒移除。备选地，过量的样本流体可经由介质注射端口移除。预先设定量的介质还可经由介质注射端口输送，在盒内部移置的气体通过样本注射端口、通气端口或释压阀进行通气。其它构造是可行的。
[0049]盒优选能够处理大量流体，例如，2升样本和2升漂洗溶液。流体的确切量将取决于样本。
[0050]盒可通过任何适当的方法来灭菌。例如通过环氧乙烷进行的气体灭菌可通过下者来执行:用气体对盒加压，保留气体达预先确定的时间量，以及在高真空下排空气体。
[0051]在一个实施例中，在完成过滤过程和营养物转移之后，盒置于处于预先限定的温度的培养器中(例如，在Growth Direct?系统内)且进行存储，同时等待成像。在预先限定的时间间隔下，盒被自动取出且发送通过成像站，在成像站中，它经历特定波长的高强度的激励光。作为响应，存在于隔膜上的任何微生物生长将自然地发荧光。借助于光学滤波器和CCD摄像机捕捉荧光像，并且记录发荧光对象。随着时间的推移，捕捉后续的像，并且测量和监测这些发荧光对象，以测量生长。满足生长标准的那些被看作菌落。其它发荧光对象被特征化为碎屑。
[0052]现在将关于某些优选的实施例来进一步描述本发明。
[0053]本发明的盒容纳0.45微米黑混合纤维素酯过滤隔膜，其由烧结聚乙烯珠制成的介质垫支承。包含混合微生物的样本经由螺动泵被泵送通过Tygon? S-50-HL管道而进入盒的样本注射端口中。在样本添加期间，在介质注射端口上的管道被密封，并且在排泄端口上的管道打开。在后面的样本添加过程中泵送Fluid D(蛋白胨-吐温80冲洗流体)，之后是添加空气来迫使所有流体通过隔膜，并且将上部室加压到1psi。然后利用夹具密封样本注射端口，并且介质注射端口被打开。液态Schaedler血介质经由介质注射端口添加，并且泵送到隔膜下方的介质垫中，以用生长介质更换Fluid D漂洗液。
[0054]然后从所有端口移除管道，并且利用封口膜(Parafilm)密封端口。盒在32.5°C下进行培养。在不同时间间隔手动地将盒置于成像器中(在像之间进行培养)。大约600瓦/厘米2的处于460-500nm的激励光由蓝LED提供，蓝LED经过光学带通滤波器调节。505-550nm的带通滤波器允许发射的光被CXD摄像机捕捉。
[0055]为了进行这些实验，在将盒置于成像器之前移除盖，并且在继续培养之前更换盖。成像器在各个时间点捕捉九个平铺像，并且这些像接合在一起，以显示完整的盒。盒的对准通过眼睛和手动进行。
[0056]图13中的时间序列显示盒中生长的微生物菌落的荧光像。虽然开始时存在碎屑颗粒，但是生长的微生物的荧光随着时间的推移而增加。可使用软件算法而将生长的荧光点检测为生长的菌落，并且可在它们还小时进行识别，这部分地由于非放大成像系统的分辨率的原因。图13中的最后的面板显示在培养时期结束时用数码摄像机在常规照明下获得的盒的像。如通过比较最后两个面板可看到的那样，在荧光菌落和常规像之间的一对一的对应关系。
[0057]其它实施例
上面的说明书中提到的所有公开、专利和专利申请通过引用而结合在本文中。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明描述的方法和系统的各种修改和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然结合具体实施例来描述本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应当不恰当地限于这样的具体实施例。实际上，对于本领域技术人员显而易见的用于执行本发明的描述的模式的各种修改意图处于本发明的范围内。
[0058]其它实施例在权利要求中。
【权利要求】
1.一种细胞培育装置，其包括壳体，所述壳体包含: i)盖，其具有透光窗； ii)流体分配通道； iii)在流体方面连接到所述流体分配通道上的样本注射端口； iv)包括多孔介质垫的底座；以及 V)在流体方面连接到所述 介质垫上的介质注射端口， 其中，所述盖匹配到所述底座上而形成无菌密封；所述流体分配通道设置在可通过所述光学窗观察到的所述介质垫上；并且引入所述流体分配通道中的样本流体均匀地分配到所述介质垫。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，进一步包括设置在所述介质垫上的隔膜，其中，处于所述样本流体中的细胞保留在所述隔膜上且可通过所述光学窗观察到。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述盖和隔膜之间的空间可进行加压。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，进一步包括排泄端口。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，进一步包括氧清除剂，其足以使所述装置的内部无氧。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，进一步包括用于所述氧清除剂的促动器。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，通过翻转所述盖或通过拉片来启动所述促动器。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，进一步包括释压阀。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，所述底座进一步包括通道，当引入流体时，所述通道释放所述介质垫中的压力。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，所述盖是可移除的。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，进一步包括介质分配通道，所述介质分配通道连接到所述介质注射端口上且围绕所述介质垫的周缘具有多个出口，其中，经由所述介质注射端口引入的介质经由所述介质分配通道而均匀地分配到所述介质垫。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，进一步包括氧指示器。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，所述流体分配通道包括螺旋导槽。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，所述流体分配通道包括多个通道，并且引入所述流体分配通道中的样本流体经由所述多个通道而均匀地分配到所述介质垫。
15.根据权利要求1至13中的任一项所述的装置，其特征在于，所述流体分配通道为单个通道。
16.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述流体分配通道围绕所述介质垫而包括倾斜周向区域。
17.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，进一步包括设置在所述流体分配通道的顶部上的覆盖物。
18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述覆盖物确定流体流的形状，以通过单个通道实现向所述介质垫的均匀分配。
19.根据前述权利要求中的任一项所述的装置，其特征在于，进一步包括通气端口，其用于在引入液体时对所述盒的内部进行通气。
20.根据权利要求19所述的装置，其特征在于，所述通气端口是自密封的。
21.一种用于检测细胞的套件，其包括根据前述权利要求中的任一项所述的装置，以及管道组，所述管道组包括具有连接器的管道，所述连接器具有针，并且匹配到所述样本注射端口、介质注射端口、通气端口或排泄端口上。
22.根据权利要求21所述的套件，其特征在于，所述连接器进一步包括隔片，所述针穿过所述隔片。
23.根据权利要求22所述的套件，其特征在于，所述连接器匹配到所述样本注射端口、介质注射端口、通气端口或排泄端口上，并且当所述针和管道被移除时，与所述隔片一起密封所述端口。
24.根据权利要求21至23中的任一项所述的套件，其特征在于，进一步包括第二管道组和可选的第三管道组，它们各自包括具有连接器的管道，所述连接器具有针，其中，所述管道组的连接器匹配到所述样本注射端口、介质注射端口、通气端口和排泄端口中的一个上。
25.根据权利要求24所述的套件，其特征在于，所述第一管道组、第二管道组和可选的第三管道组的管道共享公共入口或出口。
26.根据权利要求21至25中的任一项所述的套件，其特征在于，所述连接器包括夹具，所述夹具搭扣到所述盒中。
27.根据权利要求21至26中的任一项所述的套件，其特征在于，所述管道组进一步包括多个单独的管道，用于进行下者中的至少两个:样本引入、介质引入、排泄和通气。
28.根据权利要求27所述的套件，其特征在于，所述连接器包括用于各个管道的针。
29.根据权利要求27至28中的任一项所述的套件，其特征在于，所述管道中的一个用于通气。
30.根据权利要求27至29中的任一项所述的套件，其特征在于，用于通气的管道包括过滤器。
31.根据权利要求27至30中的任一项所述的套件，其特征在于，用于通气的管道包括释压阀。
【文档编号】C12M1/00GK104185677SQ201280054238
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2011年11月7日
【发明者】R.C.阿维勒斯, D.T.米朝德, D.J.布朗内 申请人:快速微型生物系统公司