一种专用药材pcr反应增强剂的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及中药材领域，特别涉及一种中药材PCR扩增反应液。其特征在于包含PCR扩增反应增强剂，具体为1-10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和5-100mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。使用以上混合试剂可以明显增强中药材DNA条形码通用引物PCR扩增的成功率，进而提高PCR扩增效率。
【专利说明】—种专用药材PCR反应增强剂
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及中药材领域，涉及一种中药材PCR扩增反应液。特别用于药材通用引物PCR的扩增。
【背景技术】
[0002]聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。
[0003]近年来，分子鉴定技术已被应用于药材鉴别，其中以PCR技术为核心的药材鉴定方法已较为成熟。如RAH)和AP-PCR等方法，Cheung等人采用AP-PCR法建立能够区别人参和西洋参的 DNA 指纹图谱(Cheung K S, Kwan H S, But P P H et al.Pharmacognosticalidentificationof American and oriental ginseng roots by genomic fingerprintingusing arbitrarily primedpolymerase chain reaction (AP-PCR).Journal ofEthnopharmacology, 1994,42 (I):67-69)。曹辉等人用该方法成功的鉴定了中药材地胆草与白花地胆草混淆品(曹辉，毕培曦，邵鹏柱.中药材苦地胆的DNA指纹鉴定.中药材，1996,19(12) =608-612)及蒲公英与6种土公英混淆品(曹辉，毕培曦，邵鹏柱.香港市蒲公英及其混淆品土公英的DNA指纹鉴别研究.1997，22 (4) =197-200)。
[0004]但由于药材来源复杂，其DNA纯度和浓度往往不能满足PCR的需求，严重制约了药材分子鉴定的效率。研制药材专用PCR增强剂，提高药材DNA的PCR成功率，对于节约研究成本、缩短实验周期、促进药材分子鉴定技术的推广具有重要的意义。
[0005]PCR增强剂包括二甲基亚砜(DMSO)，牛血清白蛋白(BSA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甜菜碱等。
[0006]本研究筛选获得一种含有BSA和PVP等成分的PCR增强剂，并分别采用碱裂解法和CTAB法提取180种中药材DNA，利用DNA条形码通用引物ITS2、rbcL、psbA_trnH、trnL-trnF和matK进行PCR扩增，并对本发明的PCR增强剂进行了适用性分析，建立了一种药材专用PCR反应液。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种中药材PCR扩增反应液。使用本发明混合试剂可以明显增强中药材PCR扩增的成功率，进而提高扩增效率。
[0008]所述PCR扩增反应液，其特征在于包含PCR扩增反应增强剂，具体为牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
[0009]其中，牛血清白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮都能够提高PCR反应的扩增效率，同时减少体系中PCR抑制物对反应的影响。
[0010]在本发明的实施方案中，牛血清白蛋白的浓度为1-10μ g/μ 1，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为 2-50 μ g/μ I。
[0011]本发明筛选获得一种PCR增强剂，并分别采用碱裂解法和CTAB法提取180种中药材 DNA,利用 DNA 条形码通用引物 ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL-trnF 和 matK 进行 PCR 扩±曾，对PCR增强剂的适用性进行了分析，建立了一种药材专用PCR反应液。本PCR反应增强剂可以应用于中药材ITS2、rbcL、psbA-trnH等DNA barcoding通用条形码的扩增。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1: 10种药材PCR扩增对照试验结果
[0013]1.玉竹；2.天葵子；3.黄芪；4.地骨皮；5.天葵子；6.紫菀；7.猫爪草；8.莲须；
9.黑豆； 10.荔枝核；11.玉竹；12.天葵子；13.黄芪；14.地骨皮；15.天葵子；16.紫菀；17.猫爪草；18.莲须；19.黑豆；20.荔枝核；M.DNA分子量标准:从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp
【具体实施方式】
[0014]1 材料
[0015]2012年自安徽亳州药材市场，随机收集市售药材178份，其中包括50个果实种子类、22个叶及全草类、20个花类、6个茎木类、57个根及根茎类、3个动物类药材以及20个其它类药材。
[0016]2药材DNA提取将药材研磨成粉末，取0.03g粉末，利用改良CTAB法提取药材总DNA，提取缓冲液为 2 X CTAB 提取缓冲液(pH8.0)，包括 IOOmM Tris、25mM EDTAU.4M NaCl、2% CTAB。
[0017]3药材DNA快速提取将药材研磨成粉末，取0.0Olg粉末，利用碱裂解法提取药材总DNA，提取缓冲液为 0.1M Tris-Hcl，0.5M NaOH, I % PVP, I % Triton-100 几种混合溶液。
[0018]4PCR 反应
[0019]以药材DNA为模版，分别利用DNA条形码通用引物ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL-trnF和matK进行PCR扩增，引物见表1。PCR反应体系包括:模板DNAI μ L(IOOmmol *L_1), 2XTaq PCR MasterMix 13 μ L(10mmol.L-1)，引物(IOpmol *L_1) I μ L,牛血清白蛋白(1-10 μ g/μ 1)0.5 μ L，聚乙烯吡咯烷酮(2-50 μ g/μ I) I μ L，0.5U Taq酶，加入ddH20补足到25 μ L。PCR扩增程序为:95°C预变性5min ;95°C变性30s, 47°C _56°C退火lmin，72°C延伸lmin40s，循环40次；72°C后延伸7min。反应结果后，取PCR反应液各5 μ L经1.2%琼脂糖凝胶电泳lh，溴化乙锭染色，SYNGENE型凝胶成像系统检测照相。
[0020]表1引物序列
[0021]
【权利要求】
1.一种专用药材PCR反应液，其特征在于所述反应液中包含牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或两种。
2.权利要求1的反应液，其特征在于所述反应液中包含牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
3.权利要求1的反应液，其还包含DNA聚合酶，所用DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
4.一种专用药材PCR反应液，其特征在于反应液的成分包含10-50mM Tris-Hcl(pH8.0)、20-60Mm KCU2.0-5.0mM Mg2+、0.2-0.4mM dNTP、0.1 % -1 % BSA、0.5% -5% PVP、0.04U-0.4UTaq DNA 聚合酶。
5.一种专用药材PCR方法，其特征在于所述方法包含使用权利要求1-4任一项所述的反应液的步骤。
【文档编号】C12N15/10GK103911364SQ201310004034
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年1月7日 优先权日:2013年1月7日
【发明者】黄璐琦, 袁媛, 李旻辉, 蒋超, 崔占虎 申请人:中国中医科学院中药研究所